花旗松素對高糖誘導的人腎小管上皮細胞炎癥損傷的影響及其機制▲

陳 靜 張 進

(1 寶雞職業技術學院教務處，陜西省寶雞市 721003； 2 寶雞市人民醫院內分泌科，陜西省寶雞市 721000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的并發癥之一，有30%～40%的糖尿病患者最終會發展為DN[1]。腎小管上皮細胞損傷是DN的主要特征之一，高血糖可誘導腎小管上皮細胞凋亡并誘發炎癥反應，導致腎小管損傷[2]。因此，減輕高糖誘發的腎小管上皮細胞損傷可能是阻斷DN進展的有效策略。花旗松素是從松科植物中提取的生物類黃酮，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗癌等作用[3]。最近研究表明，花旗松素可通過抑制促炎細胞因子的分泌減少破骨細胞的生成，對骨質疏松具有潛在的治療作用[4]。此外，花旗松素還可以預防甲醇暴露引起的大鼠視神經氧化損傷和炎癥損傷[5]。然而，有關花旗松素對高糖誘導的人腎小管上皮細胞炎癥損傷的改善作用的研究仍較少。環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類具有穩定共價閉合環的內源性非編碼RNA，對糖尿病及其并發癥進展具有重要的調節作用[6]。研究發現，circRNA circ_0001445在氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導的內皮細胞中表達下調，過表達circ_0001445可抑制ox-LDL誘導的炎癥反應，并抑制細胞凋亡[7]。但circ_0001445是否與高糖誘導的人腎小管上皮細胞損傷相關并不清楚。本研究觀察花旗松素對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡及其分泌炎癥因子水平的影響，并基于circ_0001445探討該藥的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人腎小管上皮細胞購自美國ATCC公司(批號：20190201)；Lipofectamine 2000轉染試劑盒、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司(批號：20181225、20181109)；花旗松素(純度98.9%)購自中國食品藥品檢定研究院(批號：111816-201102)；circ_0001445過表達質粒(pcDNA-circ_0001445)、質粒空載體(pcDNA)、circ_0001445小干擾RNA(si-circ_0001445)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)均購自上海吉凱基因公司(批號：20190103、2019106、2019108、2019110)；Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物公司(批號：20181114)；人白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒、GAPDH兔源多克隆抗體、活化型Caspase(cleaved Caspase)-3兔單克隆抗體、cleaved Caspase-9兔多克隆抗體均購自美國Abcam公司(批號：20181214、20181115、20181005、20180926、20181117)；RIPA緩沖液購自上海遠慕生物公司(批號：20181016)；化學發光試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司(批號：20181203)；PrimeScriptTM反轉錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq試劑盒均購自日本Takara公司(批號：20190102、20190113)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和實驗分組：采用添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM-F12，并置于含5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養腎小管上皮細胞，細胞融合度為80%時采用胰酶消化，按1 ∶3比例傳代培養。將對數期腎小管上皮細胞以5×105個/孔接種在6孔板中過夜，利用Lipofectamine 2000轉染試劑將2 μg pcDNA、2 μg pcDNA-circ_0001445、2 μg si-NC、2 μg si-circ_0001445分別轉染融合度為60%的腎小管上皮細胞，培養6 h后更換為含血清的培養液，轉染48 h時采用實時熒光定量PCR驗證轉染效果。

將未經轉染的腎小管上皮細胞分為5組，包括Con組、HG組、HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組。Con組采用含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM-F12培養液孵育腎小管上皮細胞，作為一般對照組；HG組采用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM-F12培養液孵育腎小管上皮細胞[8]，作為高糖對照組；HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組分別采用含1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L的花旗松素加25 mmol/L葡萄糖的DMEM-F12培養液孵育腎小管上皮細胞[9]，作為治療低、中、高劑量花旗松素組。培養24 h后，收集細胞進行后續實驗。

另外，再將經過轉染的腎小管上皮細胞分為4組，包括HG+pcDNA組、HG+pcDNA-circ_0001445組、HG+花旗松素+si-NC組、HG+花旗松素+si-circ_0001445組。HG+pcDNA組、HG+pcDNA-circ_0001445組分別采用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM-F12培養液孵育經轉染的腎小管上皮細胞；HG+花旗松素+si-NC組、HG+花旗松素+si-circ_0001445組分別采用含100 μmol/L花旗松素和含25 mmol/L葡萄糖的DMEM-F12培養液孵育經轉染的腎小管上皮細胞。培養24 h后，收集細胞進行后續實驗。

1.2.2 流式細胞術檢測腎小管上皮細胞凋亡率：采用冰冷的PBS洗滌1.2.1中各組腎小管上皮細胞1次，用500 μL結合緩沖液(含5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL 碘化丙啶)室溫避光染色20 min，然后采用FACSCalibur流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=[Annexin Ⅴ(+)碘化丙啶(-)細胞數量+Annexin Ⅴ(+)碘化丙啶(+)細胞數量]/所有細胞數量。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 ELISA檢測IL-6和TNF-α水平:1.2.1中各組腎小管上皮細胞處理完畢后，收集細胞培養的上清液，檢測其IL-6和TNF-α水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。實驗重復3次。

1.2.4 Western blot檢測cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達量：將1.2.1中各組腎小管上皮細胞置于冰上，加入RIPA緩沖液裂解細胞。將適量蛋白與等體積1×上樣緩沖液混合100 ℃孵育3 min使蛋白變性。每孔中加入30 μg蛋白樣品，進行SDS-PAGEA，采用濕式轉膜裝置將蛋白轉移到PVDF膜，用封閉緩沖液室溫孵育2 h。用特異性一抗溶液(cleaved Caspase-3為1 ∶1 000，cleaved Caspase-9為1 ∶1 000，GAPDH為1 ∶2 500)4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，37 ℃下用二抗溶液(1 ∶1 000)孵育膜1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。以GAPDH為內參，用化學發光試劑盒檢測免疫條帶，采用ImageJ軟件檢測灰度值,以目的蛋白與內參的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測circ_0001445表達水平：使用TRIzol試劑提取1.2.1中各組腎小管上皮細胞總RNA，使用分光光度計對獲得的RNA樣品的濃度和純度進行定量。濃度和純度合格后，利用PrimeScriptTM反轉錄試劑盒將RNA樣本反轉錄為cDNA，再用SYBR Premix EX Taq試劑盒進行實時熒光定量PCR。反應體系為10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL。反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，63.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。變性、退火和延伸步驟重復40個循環。以GAPDH基因為內參對照，2-ΔΔCt法計算circ_0001445相對表達量。circ_0001445上游引物5′-CAAGATGGGCGAAAGTTCACT-3′，下游引物5′-TGTGTTGCTCCATGTCTAATCATT-3′；GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計量資料采用(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 花旗松素對高糖誘導的人腎小管上皮細胞凋亡及cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達量的影響 與Con組比較，HG組腎小管上皮細胞的凋亡率、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達量均升高(均P<0.05)；與HG組比較，HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組腎小管上皮細胞的凋亡率、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達量均降低(均P<0.05)，腎小管上皮細胞的凋亡率、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達量由高到低均為HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組(均P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 花旗松素對高糖誘導的人腎小管上皮細胞凋亡及cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達量的影響注：圖A為蛋白條帶圖；圖B為細胞凋亡流式圖。

表1 各組細胞凋亡率及cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白相對表達量的比較(x±s)

2.2 花旗松素對高糖誘導的人腎小管上皮細胞炎癥因子水平的影響 與Con組比較，HG組腎小管上皮細胞的IL-6和TNF-α水平均增加(均P<0.05)；與HG組比較，HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組腎小管上皮細胞的IL-6和TNF-α水平均下降(均P<0.05)，腎小管上皮細胞的IL-6和TNF-α水平由高到低均為HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞IL-6和TNF-α水平的比較(x±s，pg/mL)

2.3 花旗松素對高糖誘導的人腎小管上皮細胞circ_0001445表達的影響 與Con組比較，HG組腎小管上皮細胞的circ_0001445表達量降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組腎小管上皮細胞的circ_0001445表達量均升高(P<0.05)，腎小管上皮細胞circ_0001445相對表達量由低到高為HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組細胞circ_0001445相對表達量的比較(x±s)

2.4 circ_0001445過表達對高糖誘導的人腎小管上皮細胞凋亡和炎癥因子水平的影響 與HG+pcDNA組比較，HG+pcDNA-circ_0001445組腎小管上皮細胞circ_0001445表達量升高，細胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表達量、cleaved Caspase-9蛋白表達量、IL-6和TNF-α水平均降低(均P<0.05)。見圖2和表4。

圖2 circ_0001445過表達對高糖誘導的人腎小管上皮細胞凋亡及相關蛋白表達的影響注：圖A為蛋白條帶圖；圖B為細胞凋亡流式圖。

2.5 干擾circ_0001445表達后花旗松素對高糖誘導的人腎小管上皮細胞凋亡、相關蛋白表達及炎癥因子水平的影響 與HG+花旗松素+si-NC組比較，HG+花旗松素+si-circ_0001445組腎小管上皮細胞circ_0001445表達量降低，細胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表達量、cleaved Caspase-9蛋白表達量、IL-6和TNF-α水平均升高(均P<0.05)。見圖3和表5。

圖3 干擾circ_0001445表達后花旗松素對高糖誘導的人腎小管上皮細胞凋亡及相關蛋白表達的影響注：圖A為蛋白條帶圖；圖B為細胞凋亡流式圖。

表5 各組細胞凋亡、相關蛋白相對表達量及炎癥因子水平的比較(x±s)

3 討 論

花旗松素已被證實在多種類型損傷模型中可發揮保護作用。例如葉艷瓊等[10]研究發現，花旗松素可抑制炎性小體表達，抑制心肌細胞凋亡，保護心肌細胞免受氧化損傷；Tang等[11]的研究表明，花旗松素可調節缺血再灌注大鼠心肌細胞的氧化應激反應，減少心肌細胞凋亡，并能改善大鼠的心功能；Turovskaya等[12]的研究證實花旗松素通過上調抗凋亡相關基因、抗氧化相關基因的表達，下調促炎因子的表達，進而抑制糖氧剝奪誘導的神經元細胞損傷。而花旗松素是否對高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥損傷具有改善作用鮮見報告。

高血糖刺激可導致過量活性氧生成和氧化應激反應，誘導腎小管上皮細胞凋亡[13]；此外，高血糖刺激還導致促炎性因子分泌增加，這些炎癥因子可直接損傷腎小管上皮細胞[14]。本研究中，高糖干預后腎小管上皮細胞凋亡率、促炎因子IL-6和TNF-α水平、促凋亡蛋白cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9表達量均增加，而花旗松素可明顯抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥因子的表達，并可下調促凋亡蛋白cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的表達，這表明花旗松素對高糖誘導的細胞炎癥損傷具有改善作用，且其作用呈一定的劑量依賴性。

circRNA是由其前體RNA反向剪切形成的非編碼RNA，其通過調控炎癥、凋亡、自噬、細胞增殖等過程參與DN的發病機制[15]。研究發現，circ_0000285在DN小鼠模型腎組織、高糖誘導的小鼠足細胞中的表達顯著升高，抑制circ_0000285可上調miR-654-3p進而減輕高糖誘導的炎癥損傷[16]。還有研究表明，circACTR2參與高糖誘導的近端腎小管上皮細胞焦亡、炎癥和纖維化[17]。有學者發現，circ_0001445在絕經后骨質疏松癥患者血漿中表達降低，而抗骨質疏松治療后血漿中circ_0001445表達明顯上調，血漿circ_0001445是潛在的絕經后骨質疏松癥診斷標志物[18]。此外，肝癌、宮頸癌等腫瘤中circ_0001445表達下調，恢復其表達能夠抑制腫瘤生長和轉移[19-20]。本研究中，高糖干預后腎小管上皮細胞中circ_0001445表達量降低，而花旗松素可顯著上調細胞中circ_0001445的相對表達量，這提示circ_0001445表達增加可能是花旗松素對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷發揮改善作用的重要因素。本研究結果還顯示，通過轉染pcDNA-circ_0001445過表達circ_0001445，可顯著抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥因子的表達，并降低cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表達，這與花旗松素的保護效果類似，提示circ_0001445可能介導花旗松素對高糖誘導腎小管上皮細胞損傷的保護作用。本研究結果還顯示，通過轉染si-circ_0001445干擾circ_0001445表達，可明顯減弱花旗松素對高糖誘導腎小管上皮細胞凋亡、炎癥因子分泌、cleaved Caspase-3，cleaved Caspase-9蛋白表達的影響，這進一步證實花旗松素通過上調circ_0001445表達，從而抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應。

綜上所述，花旗松素可呈劑量依賴性地減輕高糖誘導的人腎小管上皮細胞凋亡和炎癥因子表達，其機制可能為通過上調circ_0001445表達實現的。這初步揭示了花旗松素抑制高糖誘導的人腎小管上皮細胞炎癥損傷的作用機制，為花旗松素治療DN提供了實驗依據。