抗除草劑和抗蟲的雙抗水稻新品系的選育

張夢琦李平波柳絮張華李臻劉芳姚方印

(1.山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014；2.山東省農業科學院濕地農業與生態研究所，山東 濟南 250100)

水稻(Oryza sativaL.)是重要的糧食作物，其穩產和高產對保障世界糧食安全具有重要意義[1]。近年來，隨著我國農業供給側結構性改革的深入推進，土地流轉速度的加快，作物生產急需向規模化、輕簡化方向發展[2，3]。水稻旱直播是一種新型種植方式，與人工插秧和機械插秧相比，具有省工降本等優點，適用于水稻的規模化、輕簡化種植。但是，旱直播方式的粗放田間管理導致雜草生長嚴重，對水稻的生長和產量影響很大[4]。因而，培育抗除草劑的水稻新品種是適應輕簡化栽培的重要手段。

咪唑乙鹽酸又稱咪草煙，屬于咪唑啉酮類除草劑，具有高效、廣譜、低毒等特點，其作用機理是通過抑制高等植物體內乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS)的活性從而抑制側鏈氨基酸的合成[5]，進一步影響蛋白質的合成，有絲分裂指數下降，最終使組織失綠、黃化，植株逐漸死亡達到除草目的[6－8]。作物對咪唑啉酮類除草劑的抗性來源于ALS基因一個或多個氨基酸變異從而導致酶的結構變化，不同位點的突變產生了抗除草劑水平的差異[8－11]。王芳權等[12]在水稻品種資源材料中篩選到一株抗咪草煙的水稻(金粳818)，通過對其ALS基因的測序分析，發現其ALS基因第1 880位堿基G轉換為A，即第627位氨基酸由絲氨酸(Ser，S)突變為天冬酰胺(Asn，N)。通過分子標記輔助選擇，將金粳818來源的ALS基因導入其它水稻材料中，從而培育出抗咪草煙的水稻新品種，這對于水稻旱直播方式的推廣具有重要意義[13，14]。

水稻的豐產和穩產受水稻鱗翅目害蟲的影響。稻縱卷葉螟、二化螟、三化螟可造成水稻減產5%~10%[15，16]。主要表現為葉片枯白、枯心苗、白穗等。對水稻鱗翅目害蟲具有抗性的稻種資源目前尚未發現，因此對螟蟲的防治主要以施用農藥為主，但同時也存在農藥殘留污染、防治效果不佳以及增加成本等問題。培育抗蟲水稻是抵御蟲害的重要措施之一，目前，Bt毒蛋白基因是使用最廣泛的抗蟲基因，將Bt蛋白基因導入常規水稻，可以提高水稻對螟蟲的抗性[17]。轉基因抗蟲水稻的種植推廣對減少農藥使用、增加作物產量、提高經濟效益及環境保護等具有重要意義[18]。

本研究通過雜交和分子標記輔助選擇育種技術，將抗除草劑ALS基因與抗蟲基因Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A聚合，獲得同時具有持久穩定的抗除草劑和抗蟲的新品系，為黃淮稻區水稻直播和抗蟲水稻的推廣提供材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

顯性核不育材料的除草劑抗性基因ALS來源于金粳818[12]。攜帶抗蟲基因Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A的供體親本華恢1號、T1C－19、T2A－1是由華中農業大學提供的單拷貝轉Bt基因水稻株系。潤農11、圣稻22、華粳5均是黃淮稻區的粳稻主栽品種，農藝性狀優良。

1.2 分子標記檢測

在水稻分蘗盛期取新鮮幼嫩葉片，采用CTAB法[15]提取供試水稻基因組總DNA。

利用王廣達等[19]設計的一對特異性引物ALS－627－F/ALS－627－R和限制性內切酶DdeI對感咪草煙基因型(ALS－G)和抗咪草煙基因型(ALS－A)進行區分。利用Yang等[20]開發的引物Cry1Ab1Ac－F/Cry1Ab1Ac－R、Cry1C－F/Cry1CR、Cry2A－F/Cry2A－R對抗性基因Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A進行檢測。具體引物序列見表1。

表1 本研究所用分子標記

1.2.1 抗蟲基因的分子檢測 PCR擴增體系(20 μL):DNA模板3μL，2×PowerTaqPCR Master-Mix 10μL，正反引物各0.5μL，ddH2O 6μL。PCR擴增程序:94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經4%瓊脂糖凝膠電泳分離和EB染色后在紫外透射儀下觀察。

1.2.2 抗除草劑基因ALS的分子檢測 PCR擴增體系及程序同1.2.1。酶切體系(30μL):DNA模板(PCR擴增產物)20μL，10×K Buffer 3μL，DdeⅠ酶0.34μL，ddH2O 6.66μL。37℃反應0.5 h。經4%瓊脂糖凝膠電泳分離和EB染色后在紫外透射儀下觀察。

1.3 性狀評價

1.3.1 田間除草劑抗性鑒定 于苗期人工噴灑咪唑乙鹽酸除草劑在水稻植株葉片上，5 d后進行觀察。

1.3.2 田間抗蟲鑒定 在不用任何藥劑防治的情況下，于每年稻縱卷葉螟高發期，田間調查其危害情況及引起的白穗發生情況，并統計白穗率。

1.3.3 雙抗材料的農藝性狀 聚合Cry1Ab/Ac和ALS、Cry1C和ALS、Cry2A和ALS基因的雙抗水稻新品系按小區種植，小區面積5 m2。同時種植華恢1號、T1C－19、T2A－1、潤農11、圣稻22、華粳5作為對照。所有供試水稻材料均種植于山東省農業科學院飲馬泉試驗基地，5月4日播種，6月4日插秧，正常大田管理。農藝性狀調查分為抽穗期、株高、每穗實粒數、千粒重和穗長，具體方法參考?水稻種質資源描述規范和數據標準?[21]。

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft Office Excel 2007進行數據處理。不同材料均值的多重比較利用R軟件包multcomp和Tukey測驗進行分析。圖片采用PowerPoint 2007繪制，后期采用Adobe Photoshop CS5進行加工。

2 結果與分析

2.1 雙抗水稻新品系選育過程

以聚合ALS和Cry1Ab/Ac的雙抗水稻新品系選育為例，具體選育過程如圖1所示。以攜帶純合基因ALS的粳型顯性核不育系為起點，通過和攜帶純合基因Cry1Ab/Ac的秈稻華恢1號雜交一次，引入抗蟲基因。雜交后代的F1單株均攜帶了雜合的ALS和Cry1Ab/Ac基因以及50%粳稻遺傳背景，且可育單株和不育單株以1∶1的比例分離；以不育的F1單株為母本，以黃淮區的主栽粳稻品種A(潤農11)為父本雜交一次，提升后代單株的粳稻遺傳背景至約75%。在雜交后代FA1群體中，基因ALS和Cry1Ab/Ac發生了分離；通過分子標記輔助選擇，挑選攜帶兩個基因的陽性不育單株為母本，以黃淮區主栽粳稻品種B(圣稻22)為父本雜交一次，提升后代單株的粳稻遺傳背景至約87.5%。繼續挑選攜帶兩個基因的陽性不育FB1單株為母本，以黃淮區主栽粳稻品種C(華粳5)為父本雜交一次，提升后代單株的粳稻遺傳背景至約93.75%。在雜交后代FC1群體中，挑選兩個基因陽性且農藝性狀優良的可育單株，連續自交至F6世代；在連續自交的過程中，每個世代均進行兩個基因的選擇和農藝性狀選擇。最終，在F6世代單株中，挑選兩個目標基因純合、農藝性狀優良的單株作為攜帶ALS和Cry1Ab/Ac的雙抗水稻新品系。

圖1 攜帶ALS和Cry1Ab/Ac雙抗水稻新品系的選育過程示意圖

根據上述選育過程，最終得到聚合Cry1Ab/Ac與ALS基因的水稻品系2個:1A1、1A2；聚合Cry1C與ALS的水稻品系2個:1C1、1C2；聚合Cry2A與ALS的水稻品系2個:2A1、2A2(圖2)。

圖2 基因ALS(A)、Cry1Ab/Ac(B)、Cry1C(C)、Cry2A(D)的分子標記檢測

2.2 雙抗水稻新品系的抗除草劑評價

在噴施除草劑后，水稻生長緩慢，葉色加深。1周后不含抗除草劑ALS等位基因的水稻開始出現凋萎和死亡，先從新葉枯死，隨后老葉也逐漸枯死，15 d后基本全部死亡；而抗除草劑水稻開始恢復并正常生長(圖3)。

圖3 田間抗除草劑鑒定

2.3 雙抗水稻新品系的抗蟲性

由表2可知，雙抗新品系的白穗率介于0.20%~0.50%之間，遠遠低于3個主栽品種(約39%)，與3個抗蟲親本的白穗率(約0.20%)相當，表明新品系的抗蟲性得到明顯提高。

表2 親本與雙抗株系稻縱卷葉螟危害情況

2.4 雙抗水稻新品系的農藝性狀評價

由表3可知，在抽穗期方面，聚合Cry1Ab/Ac和ALS基因的新品系1A1和1A2與主栽品種圣稻22一致，聚合Cry2A和ALS基因的新品系2A1和2A2與主栽品種華粳5一致，聚合Cry1C和ALS基因的新品系1C1和1C2比主栽品種圣稻22長約2 d。在株高方面，新品系1A1和1A2、2A1和2A2分別與主栽品種華粳5和圣稻22一致，而新品系1C1和1C2比主栽品種圣稻22高約2 cm。在每穗實粒數方面，6個新品系均顯著低于3個主栽品種。在千粒重方面，新品系1A1、1C2和2A1顯著低于3個主栽品種，新品系1C1和2A2與主栽品種潤農11一致，新品系1A2介于主栽品種華粳5和潤農11之間。在穗長方面，新品系1A2、1C2和2A1與主栽品種圣稻22相差不大，新品系1C1介于主栽品種潤農11和圣稻22之間。基于5個性狀的綜合考量，6個新品系的農藝性狀表現均接近于主栽品種。

表3 潤農11、圣稻22、華粳5及6個雙抗新品系主要農藝性狀

3 討論與結論

近年來，水稻由播種、插秧的傳統方式逐步向直播等輕簡栽培方式轉變。在直播稻田中容易發生雜草，危害農作物生長，尤其是與直播相伴的雜草危害已經嚴重影響了水稻的產量和品質[22，23]。本研究將抗除草劑品種金粳818來源的ALS等位基因應用于雙抗水稻新品系的選育，相比于目前的主栽品種潤農11、圣稻22和華粳5，新品系對除草劑咪唑乙鹽酸表現出很好的抗性。該結果為ALS等位基因在抗除草劑品種的培育過程中的應用提供了重要的理論支持，并進一步證實了該基因的廣闊應用前景。

利用Bt基因能夠增強植物對螟蟲的抗性，已經在國內外多年的研究和商業化種植中得到了充分證明[24－26]。本研究將轉基因秈稻材料攜帶的3個抗蟲基因引入黃淮稻區的粳稻育種群體中，Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A基因及其介導的抗性在所有雜交和自交獲得的轉基因株系中均能穩定遺傳和表達，并表現出很強的抗蟲能力。該結果為抗螟蟲粳稻的培育提供了理論基礎。

本研究利用分子標記輔助選擇和傳統育種相結合的方法，將抗除草劑基因ALS和3個抗蟲基因導入粳稻，并選育出6個農藝性狀優良的水稻新品系。相比于目前黃淮稻區的主栽品種，6個水稻新品系在保證產量的前提下，顯著提高了除草劑抗性和螟蟲抗性，為黃淮稻區水稻的直播和綠色種植提供了重要的材料基礎。