小果型西瓜耐低溫弱光種質資源遺傳多樣性的SSR分析

李曉慧，趙衛星，康利允，梁慎，常高正，李海倫，王慧穎，徐小利，高寧寧

(河南省農業科學院園藝研究所，河南 鄭州 450002)

西瓜(Citrullus lanatus)屬于葫蘆科，是一種重要的經濟作物。小果型西瓜由于熟性早、品質佳，越來越受消費者青睞，種植面積也逐年擴大[1]。小果型西瓜在生長發育過程中受溫度和光照的影響較大，早春的低溫弱光會抑制西瓜生長，使其發育不良，造成西瓜減產、品質下降[2]。目前，最經濟有效的方法是選育耐低溫弱光品種，但小果型西瓜的種質資源匱乏，遺傳基礎較為狹窄，對小果型西瓜種質資源遺傳多樣性和親緣關系進行分析，有利于種質資源的更好利用和創新。

SSR分子標記是以PCR為基礎發展起來的分子標記技術，一般是由重復的幾個核苷酸為單位組成的串聯序列。利用SSR分子標記技術對西瓜的研究主要在指紋圖譜構建[3－5]、品種純度鑒定[6－8]以及遺傳多樣性[9－12]等方面。前人對西瓜耐低溫弱光種質的研究多集中在生理生化[13－15]和分子機理方面[16－18]，未見有關于西瓜耐低溫弱光種質資源的遺傳多樣性研究。因此，本研究利用SSR分子標記對耐低溫弱光和不耐低溫弱光共32份西瓜種質資源進行親緣關系分析，以期為耐低溫弱光西瓜種質資源的合理利用和遺傳育種提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試32份小果型西瓜材料為河南省農業科學院園藝研究所經過多年收集及創新的品種(系)。其中，1~10號為耐低溫弱光型，11~32號為不耐低溫弱光型(表1)。

表1 供試32份小果型西瓜品種

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 試驗于2021年4月在河南省農業科學院園藝研究所溫室取樣，在西瓜長至兩葉一心時，取100 mg幼嫩真葉，在破碎儀中進行破碎，利用改良的CTAB法[19]提取DNA，將提取的原液稀釋至30 ng/μL，－20℃保存備用。

1.2.2 SSR擴增及檢測 SSR反應采用15μL體系:2×MasterMix 7.5μL(購自BioTeke公司)，DNA模板(30 ng/μL)1μL，正、反向引物(0.4 μmol/L)各0.4μL，ddH2O 5.7μL，反應程序參考黃春瓊等[20]。選取耐低溫弱光和不耐低溫弱光的西瓜品種各1份對50對SSR引物組合進行篩選(表2)，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，具體參考梁寶萍等[21]的方法，篩選擴增位點穩定清晰且多態性高的引物用于分析供試小果型西瓜材料。

表2 引物序列

1.3 數據分析

利用Microsoft Excel軟件統計原始數據矩陣，人工讀帶將圖譜上出現條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”。使用NTSYS－pc 2.1e軟件中的UPGMA方法獲取遺傳相似系數，利用Treeplot模塊對數據進行聚類分析；用PopGen Version 3.2軟件計算不同類型小果型西瓜的遺傳多樣性指數，包括觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(H)、Shannon’s信息指數(I)、遺傳一致度和遺傳距離等，并用Cophenetic相關性方法對相似系數矩陣和聚類分析結果的相關性進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 SSR擴增多態性

從50對SSR引物中篩選出21對穩定、清晰且多態性高的引物，對32份小果型西瓜進行擴增，共得到201個多態性位點，平均每對引物可擴增出多態性位點9.6個，多態性比率為74%(表3)，擴增片段的長度在80~500 bp之間。其中，Pr25多態性位點最多，為26個(圖1)，Pr8和Pr18擴增多態性比率可達90%以上，Pr30多態性比率最低，為38%。

圖1 引物對Pr25對32份西瓜的SSR擴增圖

表3 SSR擴增多態性

2.2 不同類型西瓜種質間的遺傳多樣性

遺傳多樣性指數計算結果(表4)顯示，耐低溫弱光和不耐低溫弱光兩種類型供試小果型西瓜的觀測等位基因數(Na)分別為1.6333、1.7111，總體值為1.7556；有效等位基因數(Ne)分別為1.3395、1.3658，總體值為1.3929；Nei’s基因多樣性指數(H)分別為0.2046、0.2186，總體值為0.2366；Shannon’s信息指數(I)分別為0.3117、0.3337，總體值為0.3614。由以上數據可知，供試32份小果型西瓜種質具有較豐富的遺傳多樣性，不耐低溫弱光小果型西瓜遺傳多樣性指數均高于耐低溫弱光型，表明不耐低溫弱光型西瓜遺傳多樣性比耐低溫弱光型豐富。耐低溫弱光和不耐低溫弱光兩種類型供試小果型西瓜的遺傳一致度為0.9340，遺傳距離為0.0682(表5)，表明兩種供試小果型西瓜親緣關系較近。

表4 不同類型西瓜品種(系)遺傳多樣性指數

表5 不同類型西瓜品種(系)遺傳一致度和遺傳距離

2.3 不同類型西瓜種質間的聚類分析

供試西瓜的遺傳相似系數在0.60~0.92之間(表6)。耐低溫弱光小果型西瓜‘S5’和不耐低溫弱光小果型西瓜‘金冠’、耐低溫弱光小果型西瓜‘MW020’和不耐低溫弱光小果型西瓜‘A20－6’兩組的遺傳相似系數最小，為0.60，說明兩組之間的親緣關系最遠。不耐低溫弱光小果型西瓜‘S7’和‘S8’的遺傳相似系數最大，為0.92，說明兩者之間的親緣關系最近。

表6 32份西瓜種質遺傳相似系數

利用NTSYS－pc 2.1e軟件對21對SSR引物獲得的多態性數據進行分析，以遺傳系數0.73為界，通過UPGMA聚類，可將32份供試小果型西瓜材料分為4大類(圖2)，耐低溫弱光小果型西瓜分布在Ⅰ、Ⅱ大類，不耐低溫弱光小果型西瓜在4大類中均有分布。第Ⅰ大類8個品種，包括6份耐低溫弱光型和2份不耐低溫弱光型；第Ⅱ大類5個品種，包括4份耐低溫弱光型和1份不耐低溫弱光型；第Ⅲ大類僅包含1個不耐低溫弱光品種；第Ⅳ大類18個品種，均為不耐低溫弱光品種。

圖2 32份西瓜種質聚類分析

Cophentic相關性可以反應遺傳相似系數矩陣和UPGMA聚類結果矩陣間的關聯程度。通過Cophentic檢驗得出兩個矩陣的相關系數(r值)為0.75，說明遺傳相似性原始數據與UPGMA聚類結果之間有密切的關聯性，聚類結果準確。

3 討論與結論

本試驗選取50對SSR標記引物對32份小果型西瓜供試材料進行遺傳多樣性分析，共得到201個多態性位點，平均每對引物擴增出多態性位點9.6個，多態性比率可達74%，選取引物的擴增多態性較高，說明篩選出的21對SSR引物可用于分析西瓜種質的遺傳背景。本研究結果高于張法惺等[22]利用SSR分子標記對96份西瓜品種的遺傳多樣性(11.7%)，而低于Solmaz等[23]對土耳其不同區域的西瓜品種進行SSR標記的遺傳多態率(100%)，這可能與西瓜材料來源的地域豐富程度有關。

本研究表明，32份供試西瓜種質資源的Na、Ne、H和I分別為1.7556、1.3929、0.2366、0.3614，遺傳變異參數低于Mashilo等[24]對34份野生西瓜地方品種的SSR標記以及石磊等[25]對50份籽用西瓜種質資源的SSR分析結果，說明供試西瓜種質資源的遺傳多樣性豐富度不高，這可能與樣本量少有關。不耐低溫弱光種質資源(Na＝1.7111，Ne＝1.3658，H＝0.2186，I＝0.3337)比耐低溫弱光種質資源(Na＝1.6333，Ne＝1.3395，H＝0.2046，I＝0.3117)遺傳多樣性豐富。耐低溫弱光和不耐低溫弱光兩種類型供試小果型西瓜的遺傳一致度為0.9340，遺傳距離為0.0682，表明兩種供試小果型西瓜親緣關系較近。

通過UPGMA聚類比較將32份供試西瓜材料分為4大類。耐低溫弱光小果型西瓜分布在Ⅰ、Ⅱ大類，不耐低溫弱光小果型西瓜在4大類中均有分布。表明不耐低溫弱光型的遺傳多樣性較耐低溫弱光型豐富，這與前面遺傳多樣性參數結果一致。Cophentic相關性檢驗的遺傳相似系數矩陣和UPGMA聚類結果矩陣間的相關系數為0.75，說明兩者之間有密切的關聯性，聚類結果準確。SSR分子標記結果表明，供試小果型西瓜間的親緣關系較近，因此還需擴寬種質的遺傳基礎，引進新種質。本研究為揭示小果型西瓜種質資源間的親緣關系和新品種選育提供了理論參考。