外源Ca2＋對西伯利亞白刺鹽脅迫傷害的緩解效應

吳華鑫，趙野，王浩宇，張鳳祥，鄒剛，閆永慶

(東北農業大學園藝園林學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

鹽害是全球性的資源與生態問題，也是農業生產上最重要的逆境危害之一[1]。土壤中鹽分的增加會引起土壤理化性質改變，間接導致植物受到傷害。植物在遭受鹽害之后，生長發育受到影響，嚴重時萎蔫死亡[2]。鹽脅迫的危害也表現在降低植物的發芽指數、發芽勢，推遲萌發時間，從而導致種子發芽率降低；同時還影響植物對離子的吸收和轉運，降低對鉀(K)、氮(N)、磷(P)等營養素的吸收，而且植物在鹽脅迫下吸收的離子相對單一，體內其他離子也會流失，從而導致營養失衡，使滲透調節等多方面紊亂[3]。植物為了應對鹽脅迫形成了多種復雜的抵御機制，如積累滲透調節物質、離子區域化、形成大分子蛋白增加親水性等[4]，除此之外，維護膜系統的完整性、內源激素和光合作用調節也能夠抵御和緩解鹽脅迫。

Ca2＋在植物為應對環境脅迫而形成的各種調節機制中發揮著重要作用，不僅是信號轉導系統中的關鍵物質，還是植物生長發育必不可少的大量營養元素，缺少Ca2＋可使植物幼葉枯黃，根系發育遲緩，甚至枯死[5]。Ca2＋的存在可使細胞內維持膠體狀態，中和細胞內代謝出的有機酸，維持細胞內的酸堿度在正常水平，從而保證內環境的穩定。Ca2＋濃度的降低或升高可以影響細胞壁的結構強度，調節細胞和組織的生長[6]。Ca2＋作為第二信使，能夠根據不同的刺激信號產生特異性反應，通過作用于不同位置、不同時間進行特異性調控[7]；而Ca2＋結合蛋白通過對鈣信號進行分析，引起細胞內發生抗逆反應，并直接或間接參與植物防御反應，調控下游蛋白，以響應環境脅迫。大量研究表明，外源Ca2＋可以提高植物的抗逆性，如施加外源Ca2＋能有效減輕干旱對結縷草的傷害[8]，提高鹽脅迫下棉花的根冠比和有機物積累[9]，增加芒果的可溶性糖含量并降低在儲存期間的發病率[10]，提高鹽脅迫下草木樨葉片的氣孔指數及維持細胞正常形態和功能[11]；適當濃度的外源Ca2＋可以提高水曲柳的光合作用電子傳遞效率、葉綠素含量、水分利用效率，從而緩解脅迫造成的傷害[12]。但外源Ca2＋的濃度并不是越高越好，當濃度過高時富余的Ca2＋能與磷酸鹽在細胞內形成沉淀，使得植物的光合作用降低，生長速率減慢[13]。

西伯利亞白刺(Nitraria sibiricaPall.)為蒺蔾科白刺屬(NitrariaL.)落葉具刺小灌木，大多分布于我國青海、甘肅等地，具有較強的耐鹽能力，是治理土壤鹽化的優良樹種。其果實含有豐富的維生素，可直接食用亦可做成果脯、飲料；葉片可作為飼料，也可用于生產降血壓和消炎的藥物，具有一定的經濟和藥用價值。白刺根系發達，比地上部大4~22倍，其龐大的根系能夠固定土壤和水分，長期生長的白刺周圍土壤含鹽量顯著降低，因此常作為鹽堿地綠化先鋒樹種使用，在鹽堿地改良中發揮重要作用[14]。但目前有關外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞白刺抗氧化酶活性以及內源激素含量影響的研究報道尚少。因此，本試驗研究了在300 mmol?L－1NaCl脅迫下澆灌15 mmol?L－1CaCl2對西伯利亞白刺抗氧化生理特性和內源激素含量的影響，以探究外源Ca2＋緩解其鹽脅迫傷害、提高抗鹽性的機理，為應用外源Ca2＋提高白刺對鹽脅迫的適應性提供理論基礎，為今后鹽堿區篩選和應用耐鹽園林植物提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為西伯利亞白刺實生苗，種子由吉林省白城市林業科學研究院提供。播前將西伯利亞白刺種子先溫水浸泡72 h，然后播于穴盤中，基質為按1∶1∶1(體積比)混合的純凈河沙、園土、草炭土；置于東北農業大學連棟溫室內進行培養，自然光照，培養溫度在17~28℃之間；待幼苗長出5~6片真葉時，定植到10 cm×10 cm的塑料花盆中，養護條件不變，待其長勢良好，選取生長狀態一致的白刺苗，根部用清水浸泡并沖洗干凈后栽植到裝有純凈河沙的花盆中，用1/2Hoagland全營養液澆灌緩苗，2周后進行相關試驗處理。

1.2 試驗設計

經預試驗得知，300 mmol?L－1是西伯利亞白刺耐受NaCl脅迫的閾值濃度，鹽脅迫3 d時實生苗所受傷害較為明顯，而15 mmol?L－1CaCl2對鹽脅迫的緩解作用最佳。在預試驗的基礎上，設計0、300 mmol?L－1NaCl和0、15 mmol?L－1CaCl2組合的4種處理:CK，空白對照，無NaCl、CaCl2處理；Ca2＋處 理，15 mmol?L－1CaCl2；NaCl處 理，300 mmol?L－1NaCl；NaCl＋Ca2＋處理，300 mmol?L－1NaCl＋15 mmol?L－1CaCl2。每盆種植3株西伯利亞白刺，每個處理10盆，共40盆。NaCl和CaCl2均按設計濃度對實生苗進行澆灌，為防止實生苗產生鹽激反應，鹽處理時從50 mmol?L－1NaCl開始澆灌，逐天增加50 mmol?L－1鹽濃度，待達到預設濃度后，繼續連續澆灌3 d，澆灌量大于基質持水量，便于多余鹽分流出以保持鹽濃度的穩定。處理結束一天后取樣，將白刺葉片清洗干凈后放入－80℃超低溫冰箱保存備用。

1.3 測定指標及方法

葉片相對含水量的測定參照高俊鳳[15]的方法；葉綠素含量的測定采用丙酮－乙醇混合法[15]；MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法[15]；SOD活性的測定采用氮藍四唑顯色法[15]；POD活性的測定采用愈創木酚法[16]；CAT活性的測定參考王學奎[16]的方法；內源激素(IAA、ABA、GA)含量采用酶聯免疫(ELISA)試劑盒測定。

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進行數據整理與計算，利用GraphPad Prism 7.0軟件處理數據并繪圖，運用SPSS 20.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片相對含水量及葉綠素和MDA含量的影響

由表1可見，與CK相比，Ca2＋處理對西伯利亞白刺葉片的相對含水量無顯著影響，NaCl處理則顯著降低葉片相對含水量20%；較NaCl處理，NaCl＋Ca2＋處理的葉片相對含水量明顯增加，但仍低于CK，差異未達顯著水平。總體來看，鹽脅迫使西伯利亞白刺葉片的相對含水量顯著下降，而增施外源Ca2＋能緩解鹽脅迫傷害，使葉片相對含水量基本回升到正常水平。

正常生長狀態下施加外源Ca2＋能增加西伯利亞白刺的葉綠素含量，但增幅較小，與CK差異不顯著；NaCl處理下，葉綠素含量比CK下降了22%，差異顯著；與NaCl處理相比，NaCl＋Ca2＋處理使西伯利亞白刺的葉綠素含量顯著增加，但仍明顯低于CK(表1)。表明外源Ca2＋的施加有利于NaCl脅迫下西伯利亞白刺的葉綠素生成。

NaCl處理下西伯利亞白刺葉片中的MDA含量顯著高于其它處理，分別是CK、Ca2＋處理、NaCl＋Ca2＋處理的1.74、1.76、1.55倍；其余三處理間差異不顯著(表1)。說明NaCl脅迫下西伯利亞白刺的膜脂過氧化反應劇烈，產生大量MDA，而外加Ca2＋能夠有效降低NaCl脅迫的傷害，使MDA產量控制在對照水平。

表1 外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片 相對含水量、葉綠素和MDA含量的影響

2.2 外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片抗氧化酶活性的影響

2.2.1 SOD活性的變化 如圖1所示，與CK相比，NaCl脅迫顯著提高SOD活性，提高了67%；Ca2＋和NaCl＋Ca2＋處理的SOD活性進一步升高，兩者間差異不顯著，但顯著高于CK和NaCl處理；與NaCl處理相比，NaCl＋Ca2＋處理的SOD活性顯著提高0.3倍。表明，施加外源Ca2＋能提高鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片中的SOD活性，加速對超氧陰離子的歧化反應，從而提高其耐鹽能力。

圖1 外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片中SOD活性的影響

2.2.2 POD活性的變化 如圖2所示，Ca2＋和NaCl處理的POD活性與CK相比無顯著變化，但顯著低于NaCl＋Ca2＋處理；NaCl＋Ca2＋處理比NaCl處理的POD活性增加了14%。表明NaCl脅迫下施加外源Ca2＋能有效增強西伯利亞白刺葉片內POD的活性，提高清除細胞內活性氧的能力，使光呼吸作用穩定進行，增強對鹽脅迫的耐受能力。

圖2 外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞白刺POD活性的影響

2.2.3 CAT活性的變化 如圖3所示，與CK相比，NaCl、Ca2＋、NaCl＋Ca2＋處理的CAT活性均顯著增高，分別是CK的1.50、1.90、1.87倍；NaCl＋Ca2＋處理的CAT活性比NaCl處理升高25%。可見施加外源Ca2＋能提高鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片內CAT的活性，從而提高其分解過氧化氫的能力，減弱鹽脅迫造成的氧化傷害，提高植株的耐鹽能力。

圖3 外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞 白刺CAT活性的影響

2.3 外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片內源激素含量的影響

2.3.1 ABA含量的變化 ABA是一種應急脅迫激素，能夠在不同逆境下調節植物的適應性。從圖4可以看出，Ca2＋處理的ABA含量與CK基本一致；NaCl處理顯著提高ABA含量，是對照組的1.65倍；NaCl＋Ca2＋處理的ABA含量顯著高于CK，但顯著低于NaCl處理20%。一般來說，ABA含量的增加與植物抗逆性的增強呈正相關，因此，施加外源Ca2＋能減弱NaCl脅迫對西伯利亞白刺的傷害，使其更能適應鹽脅迫環境。

圖4 外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞 白刺ABA含量的影響

2.3.2 IAA含量的變化 由圖5可知，NaCl處理的IAA含量顯著低于CK、Ca2＋、NaCl＋Ca2＋處理，后三者間無明顯差異。與NaCl處理相比，NaCl＋Ca2＋處理的IAA含量顯著增加19%。可見，施加外源Ca2＋可使鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片中的IAA含量恢復到正常水平。

圖5 外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞 白刺IAA含量的影響

2.3.3 GA含量的變化 由圖6可見，各處理下西伯利亞白刺的GA含量變化基本與IAA一致，也表現為與CK相比，NaCl處理顯著降低GA含量(降幅為20%)，而Ca2＋和NaCl＋Ca2＋處理對其無明顯影響；與NaCl處理相比，NaCl＋Ca2＋處理的GA含量顯著升高24%。表明施加外源Ca2＋能將NaCl脅迫下西伯利亞白刺葉片內GA含量恢復到正常水平。

圖6 外源Ca2＋對鹽脅迫下西伯利亞 白刺GA含量的影響

3 討論與結論

植物一切生理功能都與水有著極為密切的關系，葉片相對含水量是植物內部保水能力的最直接表現，關系著其生理功能能否正常進行[17]。本研究結果表明，在300 mmol?L－1NaCl脅迫下，西伯利亞白刺葉片的相對含水量顯著降低，與在蒙古黃芪幼苗上的研究結論一致[18]，說明土壤中含鹽較高時，吸水困難，導致細胞產生失水現象[19，20]。葉綠素含量的多少能在一定程度上反映植株同化物質能力的強弱[21]。本研究中，西伯利亞白刺在鹽脅下葉片葉綠素含量降低，說明植物遭受逆境脅迫時，葉綠體會被傷害，可能從葉綠素合成速度減緩而分解速率加快、相關合成酶活性減弱而分解酶活性增強兩種途徑減少葉綠素含量[22，23]。施加15 mmol?L－1外源Ca2＋后，西伯利亞白刺葉片的相對含水量、葉綠素含量明顯升高，說明Ca2＋可能通過調節氣孔大小和光合作用來增加植物體內水分和葉綠素含量，從而提高植物抗性，這與Medvedev[24]的研究結論一致。

鹽脅迫環境下，植物體內會產生大量的活性氧，MDA作為指示生物膜和酶損傷程度的重要指標，能夠反映植物的抗氧化水平。本研究中，300 mmol?L－1NaCl處理后西伯利亞白刺葉片中的MDA含量顯著增加，說明膜系統受到明顯傷害，這與劉會超等[25]在五葉地錦上的研究結果一致。植物抗氧化系統中的SOD、POD、CAT三種酶，在免除植物氧化損傷和清除體內活性氧中發揮著重要作用。本研究中SOD、CAT活性在300 mmol?L－1NaCl脅迫下增加，分別比CK增加67%和50%，而POD活性無明顯變化，這與范海霞等[26]在菊花上的研究結果不一致，可能是因為西伯利亞白刺為較典型的鹽生植物，本身有著較強的耐鹽能力，所以POD活性變化不是很明顯。施加15 mmol?L－1外源Ca2＋后，西伯利亞白刺葉片中的SOD、POD、CAT活性均有所提高，分別是NaCl脅迫下的1.30、1.14、1.25倍。

綜上，Ca2＋除了能使植物膜結合蛋白保持穩定外，也在緩解鹽脅迫中起著重要作用。正常情況下細胞內外的Ca2＋會維持在一個穩定平衡的狀態，但當受到外界非生物脅迫時，胞外Ca2＋會內流，使胞內Ca2＋濃度升高，若內流持續時間較短則內流完成后會再次恢復到平衡狀態，這是Ca2＋行使信號作用的基礎[27]。而外源Ca2＋的增加相當于增加了信號的強度，可以引發一系列的生理生化反應，通過增加抗氧化酶活性加速清除胞內的活性氧，降低活性氧的積累，減弱膜脂過氧化的程度[28，29]，以維持細胞膜的結構和功能。

植物遭受鹽害時也會通過改變體內激素含量調控不同的代謝活動，以使自身能維持正常的生命活動。本研究中，西伯利亞白刺在300 mmol?L－1NaCl脅迫下，體內ABA含量顯著增加，IAA、GA含量顯著下降，這與羅玉婕等[30]在海棠上的研究結果一致。ABA可以調節氣孔的開合度和蒸騰速率，受到鹽脅迫時，ABA大量積累，可使氣孔變小、蒸騰速率降低，從而減少體內水分流失[31]；在分子層面，它還可以通過誘導相關抗氧化酶基因、滲透調節相關基因和抗鹽基因表達來增加滲透調節物質的含量，降低滲透勢，從而減輕鹽脅迫的傷害[32，33]。本研究中，與ABA在鹽脅迫下含量增加不同，IAA、GA兩種促進型激素在鹽脅迫下含量減少，可能原因是Na＋和H＋通過Na＋/H＋逆向轉運蛋白使得細胞內Na＋向外排出，H＋在細胞內的數量增加，IAA合成場所所需的正常pH環境受到干擾，使IAA含量下降[34]；GA能減小氣孔阻力，提高蒸騰速率，受離子毒害作用更加明顯，在鹽脅迫環境下含量下降。施加外源Ca2＋后，ABA含量下降了20%，IAA和GA含量則分別增加了19%和24%，這與李青云等[35]的研究結果一致，可能是因為Ca2＋參與了激素對生理活動的調節，抑制了ABA的增長，促進了IAA、GA的生成。Li等[36]的研究表明ABA在誘導鈣依賴蛋白酶(CDPK)的產生和對一些相關酶及基因的調控全部依賴于Ca2＋。

綜上所述，300 mmol?L－1NaCl脅迫對西伯利亞白刺的相對含水量、葉綠素和MDA含量、抗氧化酶活性、內源激素含量產生明顯影響，施加15 mmol?L－1外源Ca2＋可通過改變抗氧化酶活性和內源激素含量來減弱鹽脅迫的傷害。但有關西伯利亞白刺耐鹽機制的研究尚不完善，激素與Ca2＋的關系也需要進一步探明，今后可從調控Ca2＋的相關基因、Ca2＋的受體蛋白、Na＋的受體蛋白、滲透調節物質相關基因等方面進一步探索。