一株煙草黑脛病拮抗菌Y12的鑒定及發酵條件優化

何明川，鈕徐融*，曾舒泉，謝永輝，戴恩，李美燕，吳國星，張忠，王志江

(1.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南省煙草公司昆明市公司，云南 昆明 650051；3.山東第一醫科大學生命科學學院，山東 泰安 271016)

煙草黑脛病是目前世界上危害較嚴重的煙草真菌性病害之一，對世界煙草生產造成巨大的沖擊和威脅，受到廣泛關注[1，2]。近年來在該病害流行預測預報、化學及生物農藥防治等相關領域取得了較大進展，對煙草黑脛病的防控手段主要為種植抗病品種、優化煙草栽培管理技術和化學與生物防治[3，4]。但由于煙草疫霉的侵染過程伴有其他病原微生物的發生，易使抗病品種抗性喪失，且該病原菌游動孢子形成速度快且數量大、侵染寄主后發病快，所以田間監測與管理難度較大[5]，化學防治被廣泛運用以控制病害。相比化學防治，生物防治在長期研究與實際運用中表現出無污染、無公害、不易產生抗藥性、藥效持續時間長等優點[6]，應進行深入的研究并予以廣泛運用。目前用于防治煙草黑脛病的拮抗菌多分離自根際土壤和植物根莖葉[7－9]，而分離自昆蟲體內的具有拮抗煙草黑脛病特性的細菌卻鮮有報道。本課題在前期從美洲大蠊腸道內分離出一株對煙草疫霉具有拮抗作用的Y12菌株，本試驗通過形態學、生理生化特征及16S rRNA基因序列測定等方法對該菌株進行鑒定，采用單因素試驗確定其最佳培養基和最適發酵條件，為利用該菌對煙草黑脛病進行生物防治和菌劑制備等奠定基礎，同時對利用昆蟲腸道微生物進行生物防治提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2021年7—12月在云南農業大學植物保護學院生物化學實驗室進行。拮抗菌Y12分離自美洲大蠊腸道內，保存于－80℃超低溫冰箱。

1.2 供試培養基

蛋白胨酵母蔗糖(YSP)培養基:蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，蔗糖20.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；牛肉膏酵母(NYBD)培養基:牛肉浸膏8.0 g，酵母浸粉5.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；細菌基礎(CM)培養基:葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO42.0 g，檸檬酸鈉1.0 g，MgSO4?7H2O 0.2 g，K2HSO44.0 g，KH2SO46.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；牛肉膏蛋白胨瓊脂(NA)培養基:蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；蛋白胨酵母(LB)培養基:蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；燕麥(OA)培養基:燕麥30.0 g，瓊脂18.0 g，加蒸餾水至1 L。

1.3 Y12菌株抑菌效果測定

采用平板對峙法對拮抗菌Y12的抑菌效果進行測定。利用6 mm打孔器在已活化的煙草疫霉平板上打取菌餅，接種于新的OA平板中央，將已分離純化的Y12菌株單菌落使用接種環接種于OA平板距菌餅十字對稱2.2 cm處，于28℃恒溫培養箱中培養3~5 d后取出并測量抑菌圈半徑，計算抑菌率。以不接拮抗菌作為空白對照，每個處理3個重復[10]。

抑菌率(%)＝(對照平板菌落直徑－處理平板菌落直徑)/對照平板菌落直徑×100。

1.4 拮抗菌的鑒定

1.4.1 形態學與生理生化鑒定 挑取Y12單菌落接種于LB培養基，28℃培養48 h，觀察菌落形態特征，并參考?常見細菌系統鑒定手冊?等對菌株進行生理生化特征鑒定[11，12]。

1.4.2 16S rRNA基因序列分析 以27F(5′－AGAGTTGACCTGGCTCA－3′)和1492R(5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′)為引物擴增Y12菌株的16S rRNA基因序列。擴增體系(50μL):PCR Mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA模板3μL，ddH2O 18μL。擴增程序:94.8℃預變性2.5 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸20 s，30個循環；72℃延伸2 min。采用1.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產物，送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測序。測序結果在NCBI上進行BLAST比對后將同源性較高的序列用MEGA 7和clustal x1.83軟件構建系統發育樹[13]。

1.5 拮抗菌株發酵條件優化

1.5.1 種子液的制備 挑取Y12菌株單菌落于100 mL LB液體培養基中，28℃、180 r/min振蕩培養24 h后備用。

1.5.2 培養基優化 分別取50μL種子液接種于100 mL的YSP、NYBD、CM、NA和LB液體培養基中，于25℃、220 r/min、正常光照環境下培養24 h，使用分光光度法測定菌液在600 nm波長處的OD值以確定該菌在不同培養基中的生長狀況[14]。

1.5.3 培養基組分優化 以1.5.2中的最適培養基作為基礎培養基，分別以麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖以及淀粉作為碳源。接種50μL種子液于25℃、220 r/min條件下培養24 h，利用分光光度法測定各組培養后的菌液在600 nm波長處的OD值[15]。

以1.5.2中的最適培養基作為基礎培養基，分別以氯化銨、酵母浸粉、硝酸銨、甘氨酸以及蛋白胨作為氮源。接種50μL種子液于25℃、220 r/min條件下培養24 h，利用分光光度法測定各組培養后的菌液在600 nm波長處的OD值[15]。

1.5.4 溫度對拮抗菌生長的影響 將50μL Y12種子液加入最佳培養基中，于不同溫度(16、20、24、28、32、36、40℃)條件下、220 r/min振蕩培養24 h，利用分光光度法測定各組菌液在600 nm波長處的OD值[14]。

1.5.5 初始pH值對拮抗菌生長的影響 將50 μL Y12種子液加入最佳培養基中，利用HCl與NaOH調整pH值至4、5、6、7、8、9、10，于最適溫度下、220 r/min振蕩培養24 h后利用分光光度法測定各組培養后的菌液在600 nm波長處的OD值[15]。

1.5.6 裝液量對拮抗菌生長的影響 250 mL三角瓶中分別加入20、40、80、120、160 mL最佳培養基，50μL Y12種子液接種于培養基中，于最適溫度下、220 r/min振蕩培養24 h后利用分光光度法測定各組培養后的菌液在600 nm波長處的OD值[14]。

1.5.7 發酵時間對拮抗菌生長的影響 將50μL Y12種子液加入最佳培養基中，于最適溫度下、220 r/min、正常光照下振蕩培養，每隔2 h利用分光光度法測定菌液在600 nm波長處的OD值并繪制Y12生長曲線以確定Y12的最佳發酵時間[14]。

1.5.8 轉速對細菌生長的影響 將50μL Y12種子液加入最佳培養基中，于最適溫度、不同轉速下(140、160、180、200、220、240 r/min)振蕩培養至最適發酵時間后利用分光光度法測定各組培養后的菌液在600 nm波長處的OD值[14]。

1.5.9 光照時間對細菌生長的影響 將50μL Y12種子液加入最佳培養基中，于最適溫度、最適轉速、不同光照時間下(0、4、8、12、16、20、24 h)培養至最適發酵時間后利用分光光度法測定各組培養后的菌液在600 nm波長處的OD值[14]。

1.5.1 0 初始接菌量對細菌生長的影響 接入不同初始菌量(0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%、2.50%、3.00%)至最佳培養基中，于最適溫度、最適轉速下培養至最適發酵時間后利用分光光度法測定各組培養后的菌液在600 nm波長處的OD值[16]。

1.6 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據處理，利用DPS 7.05進行統計分析，用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 Y12菌株抑菌效果

如圖1所示，處理組疫霉菌落平均半徑為(16.30±0.05)mm，抑制率為62.95%±0.11%。

圖1 拮抗菌Y12的抑菌效果

2.2 Y12菌株的鑒定

2.2.1 形態學與生理生化特征 菌株的菌落直徑0.86~3.60 mm，近圓形，隨培養時間延長由銅綠色漸漸變為黃褐色，表面濕潤隆起且邊緣略透明呈波狀。菌體短桿狀至橢球狀，(0.28~0.36)μm×(0.71~1.36)μm，未觀察到芽孢，革蘭氏陰性菌(圖2)。生理生化特征如表1所示。

圖2 Y12菌株菌落形態及革蘭氏染色結果

表1 拮抗細菌Y12的生理生化特征

2.2.2 16S rRNA基因序列分析結果 將Y12菌株16S rRNA基因測序結果與GenBank數據庫中已有序列進行Blast比對，發現該菌與Pseudo-monas aeruginosaDSM 50071(NR117678.1)相似度最高(99%)。結合2.2.1中所得結果和系統發育樹(圖3)，鑒定該菌為銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)。

圖3 基于16S rRNA基因序列構建的Y12菌株系統進化樹

2.3 Y12菌株發酵條件優化

2.3.1 培養基種類優化 由圖4可知，Y12菌株在NYBD培養基上的生長速度最快(OD600值為2.25)，在YSP、CM、LB、NA培養基上的生長較慢(YSP培養基上最慢)，且顯著低于NYBD培養基。表明NYBD培養基為該菌的最適培養基。

圖4 不同培養基對Y12菌株生長的影響

2.3.2 培養基組分優化 由圖5可知，Y12菌株在以葡萄糖為碳源的培養基中生長狀況最佳(OD600值為2.07)，而后依次為乳糖、麥芽糖和蔗糖，以淀粉為碳源的處理顯著(P<0.05)低于葡萄糖、乳糖和麥芽糖處理。表明Y12的最適碳源為葡萄糖。

圖5 不同碳源對Y12菌株生長的影響

由圖6可知，Y12菌株在以酵母浸粉為氮源的培養基中生長最快(OD600值為2.24)，而后依次為氯化銨、蛋白胨和硝酸銨，以甘氨酸為氮源的處理與酵母浸粉處理存在顯著差異(P<0.05)。表明Y12的最適氮源為酵母浸粉。

圖6 不同氮源對Y12菌株生長的影響

2.3.3 溫度對Y12菌株生長的影響 由圖7可得，在一定溫度范圍內(16~40℃)，Y12菌株的生長量差異不顯著，說明一定范圍溫度變化對Y12生長的影響較小。其中，28℃為該菌的最適生長溫度。

圖7 不同溫度對Y12菌株生長的影響

2.3.4 初始pH值對Y12菌株生長的影響 pH＝7時Y12生長狀況最好(OD600值為2.56)，pH＝4、pH＝5的生長環境對Y12具有顯著的抑制作用(圖8)，這表明該菌不適于生存在強酸性環境下，而在弱酸至堿性環境中能較好的生存。

圖8 不同pH值對Y12菌株生長的影響

2.3.5 裝液量對Y12菌株生長的影響 由圖9可知，裝液量為20 mL時最有利于該菌生長(OD600值為2.54)，在裝液量為40、80、120、160 mL時的培養效果顯著低于20 mL處理(P<0.05)。裝液量越多，氧氣含量越少，Y12菌株的生長受到抑制，這表明該菌為好氧型細菌，其生長對氧氣含量有較高的要求。

圖9 不同裝液量對Y12菌株生長的影響

2.3.6 發酵時間對Y12菌株生長的影響 由圖10可知，Y12菌株的生長曲線呈“S”型。0~12 h內菌液濃度較低且變化緩慢，處于生長遲緩期。12 h后細菌生長速度急劇加快，菌液濃度不斷增大，48 h后該菌生長趨于穩定。故12~48 h為Y12的對數生長期，生長速度最快。60 h時菌液濃度達到峰值，OD600值為2.17，60 h后細菌濃度逐漸下降，進入衰亡期。

圖10 Y12菌株生長曲線

2.3.7 轉速對Y12菌株生長的影響 160、220 r/min和240 r/min培養效果較好，其中以220 r/min最優(OD600值為1.91)；140、180 r/min培養效果略差；200 r/min培養效果最差，且顯著低于160、220、240 r/min處理(P<0.05，圖11)。

圖11 不同轉速對Y12菌株生長的影響

2.3.8 光照對細菌生長的影響 由圖12可知，每日光照8 h的培養效果最優(OD600值為2.36)，其次為4 h和0 h處理。12 h和24 h光照處理下的培養效果較差且與8 h光照處理組存在顯著差異(P<0.05)，16 h和20 h處理效果顯著低于其它處理(P<0.05)。

圖12 不同光照時間對Y12菌株生長的影響

2.3.9 初始接菌量對Y12菌株生長的影響 由圖13可知，不同初始接菌量對Y12菌株生長的影響差異不顯著，其中接菌量為0.10%時最適宜Y12菌株生長(OD600值2.23)。

圖13 不同接菌量對Y12菌株生長的影響

3 討論與結論

前期從美洲大蠊腸道內分離到一株對煙草黑脛病拮抗作用較好的Y12菌株，通過形態學、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析，確定該菌為銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)。假單胞菌是自然界中種類和數量較多、分布最廣泛的微生物之一，其豐富的遺傳多樣性為人類對其的研究提供了繁多的資源，擁有廣闊的研究前景和應用價值[17，18]。有研究表明某些假單胞屬生防菌對煙草黑脛病有良好的拮抗效果，可開發為生物農藥用于田間防治[19]。關于將假單胞菌作為生防菌防治煙草黑脛病的研究已較為深入。例如許煜泉等[20]研究發現假單胞菌JKD－2能分泌鐵載體以抑制稻瘟病菌(Piricularia orzae)的生長；譙天敏等[19]分離得到的一株銅綠假單胞菌ZB27，對雜交竹梢枯病病原菌具有較強的抑制作用；王遠山等[21]的研究表明綠針假單胞菌(Pseudomonas choloraphis)可能因分泌某種抗生素類物質而表現出對煙草疫霉的拮抗作用；董國菊等[22，23]的研究發現熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)可通過分解纖維素、蛋白質和結合Fe3＋，破壞煙草黑脛病病原菌細胞壁，從而抑制其生長。另外，熒光假單胞產生的抗生素吩嗪酸(PCA)和2，4－二乙酰藤黃酚(Ph1)被認為在抑制小麥全蝕菌Gaeamuuomyces gramiaisvar.tritici上起重要作用[24]。目前，相關研究中具有拮抗作用的銅綠假單胞菌多為根際土壤和植物體內分離所得[7－9]，而Y12菌株由美洲大蠊腸道中分離得到，為昆蟲內生菌用于生物防治提供了資源。

Y12最適培養基與發酵條件的篩選結果表明，該菌最適培養基成分為:牛肉浸膏8.0 g，酵母浸粉5.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；最適發酵條件為培養溫度28℃、pH＝7、裝液量20 mL、發酵時間60 h、轉速220 r/min、光照時間8 h/d、接菌量0.10%。相較于對病原真菌起拮抗作用的銅綠假單胞菌2016NX1的最佳發酵條件[25]，Y12發酵的最適轉速更高、發酵溫度更低。采用最適培養基在最適條件下培養Y12可明顯提高其發酵速度、增加其發酵產出效率，為利用Y12菌株開展菌劑制備等研究工作奠定了基礎。Y12菌株對煙草黑脛病的拮抗效果僅通過平板對峙試驗進行測定，并未在感病植株上進行抗病防治試驗，后期需對其田間防治效果進行驗證。

本研究表明銅綠假單胞菌Y12對煙草黑脛病病菌具有較明顯的拮抗作用，為煙草黑脛病的生物防治提供了理論基礎。