HuR胞漿表達水平與接受他莫昔芬輔助治療的雌激素受體陽性乳腺癌預后的相關性

廖瑜倩 李 勇 張戰民 謝 寧 樊 英

根據2020年全球癌癥統計數據，乳腺癌發病率位于所有惡性腫瘤發病率第一位，年新發病例數為2261419例[1]。在中國，乳腺癌發病率位于女性惡性腫瘤第1位[2]。2013年St Gallen會議提出了分子亞型的替代分型，即采用免疫組化雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體-2(HER-2)、Ki-67表達情況進行分型[3]，其中激素受體陽性患者約占全部乳腺癌患者的70%[4]，提高這部分患者的療效，對于改善整個乳腺癌患者人群的生存具有重要意義。

內分泌治療是激素受體陽性乳腺癌最重要的治療手段之一，所有激素受體陽性乳腺癌均需要接受輔助內分泌治療，無論淋巴結狀態、HER2狀態、年齡、月經狀態如何[5]。他莫昔芬是絕經前女性最常用的內分泌治療藥物。與不進行輔助內分泌治療的患者相比，接受他莫昔芬輔助治療的淋巴結陰性乳腺癌患者的5年復發風險可降低12.5%，死亡風險可降低3.5%，淋巴結陽性乳腺癌患者的5年復發風險可降低17.3%，死亡風險可降低5.9%。隨著隨訪時間的延長，10年復發和死亡風險降低的比例更高[6]。芳香化酶抑制劑[7]、延長內分泌治療時間[8]、聯合細胞周期依賴激酶4/6抑制劑(CDK4/6抑制劑)[9]可以進一步提高激素受體陽性乳腺癌患者的生存期。然而，盡管激素受體陽性乳腺癌是各個亞型中預后較好的，但是仍有30%～50%的患者出現復發轉移。我們還需要進一步發現新的預后預測指標及新型治療藥物。

人類抗原R (human antigen R，HuR)是一種RNA結合蛋白，屬于胚胎致死性異常視覺(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)基因家族成員。HuR能夠在轉錄后水平調節癌基因和抑癌基因的表達，包括信使RNA(mRNA)運輸、mRNA衰變和蛋白質翻譯等等。HuR在不同惡性腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用[10]。HuR也與他莫昔芬[11]、吉西他濱[12]、紫杉類[13]等藥物的敏感性相關。但是，HuR與乳腺癌特征及生存的關系尚不明確，本研究計劃在接受他莫昔芬輔助內分泌治療的雌激素受體陽性乳腺癌患者中，分析HuR 胞漿表達水平與生存的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2005年1月至2016年12月在中國醫學科學院腫瘤醫院接受他莫昔芬輔助內分泌治療的Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者105例。所有患者均簽署知情同意書。該研究獲得中國醫學科學院腫瘤醫院倫理委員會的同意。根據美國癌癥分期聯合委員會(AJCC) 2010版進行分期[14]。僅有5例患者未接受術后輔助化療，31例患者接受術后輔助放療。所有患者均接受他莫昔芬內分泌治療5年。

1.2 免疫組化方法及評分

ER、PR、HER-2狀態的評價依據2010年美國臨床腫瘤學會(ASCO)和美國病理學家學會(CAP)標準[15-16]。采用鼠抗人HuR單克隆抗體 (3A2;Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)。在室溫(37°C)下，以1∶200的稀釋度與HuR抗體孵育1小時。然后進行標準的兩步過氧化物酶共軛聚合物技術(DAKO Envision kit，DAKO，Carpentia，CA，USA)。下一步，用二氨基聯苯胺四氫氯化物溶液(DAB；Sigma，美國密蘇里州圣路易斯)觀察免疫染色。

由2位病理科醫生盲法觀察，半定量積分法判斷結果。HuR陽性染色部位定位于細胞漿。用低倍鏡和高倍鏡觀察切片，判斷標準：觀察腫瘤胞漿的染色強度，分為0～3級：0級(0分)，未著色，陰性；1級(1分)，淺黃色，弱陽性；2級(2分)，黃色，中度陽性；3級(3分)，棕黃色，強陽性。同時，每張切片選取5個典型高倍視野，在200倍下連續計數100個細胞，陽性細胞數小于5%者為0分；5%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；76%～100%計4 分。兩種積分相加，積分為0～1分，表示陰性(-)；2～3分，表示陽性(+)；4～5分，表示陽性(++)；6～7分，表示陽性(+++)。本研究中，-～+為HuR弱表達(圖1a)，++～+++為HuR強表達(圖1b)。

注：a為HuR胞漿弱表達；b為 HuR胞漿強表達。

1.3 統計學方法

生存期(OS，overall survival)指從確診開始至因任何原因死亡或末次隨訪的時間。無病生存期(DFS，disease-free survival)指從確診開始至出現任何部位復發轉移的時間。采用SPSS 21.0統計軟件。分類資料的兩兩比較采用卡方檢驗、或Fisher's 精確檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier方法，組間比較應用Log-Rank 檢驗，預后分析采用COX風險比例回歸模型。

2 結果

2.1 胞漿HuR表達水平與臨床病理特征的相關性

HuR弱表達者81例(77.1%)，強表達者24例(22.9%)。患者中位年齡43歲(26～50歲)，均為絕經前。全組患者的臨床病理特征見表1。分析HuR胞漿水平與臨床病理特征的相關性，結果顯示，HuR強表達與Ki-67增殖指數高顯著相關(P=0.006)。見表1。

表1 胞漿HuR表達水平與臨床病理特征的相關性

2.2 不同臨床病理特征及胞漿HuR表達水平與患者生存的相關性

全組5年OS率為96.1%(101/105)，5年DFS率為82.9%(87/105)。單因素Kaplan-Meier生存分析(Log-rank檢驗)結果顯示：對OS和DFS有顯著影響的因素為Ki-67指數、HuR表達水平，見表2。COX多因素預后分析顯示，腋窩淋巴結轉移狀態、Ki-67指數、HuR表達水平是獨立的預后因素，見表3。

表2 不同臨床病理特征及胞漿HuR表達水平患者的5年DFS及OS分析

表3 COX多因素分析結果

3 討論

HuR是一種RNA結合蛋白，在人體組織內廣泛表達。HuR主要定位于細胞核，當受到細胞因子、低氧等刺激時，可從細胞核穿梭至細胞質。胞質內HuR通過RNA識別模體(RRMs)與靶基因mRNA 3'UTR的富含AU的元件(AREs)相結合，從而增加mRNA的穩定性，增強靶基因的表達。HuR可影響多種癌基因、抑癌基因的表達，胞漿內HuR水平的升高與乳腺癌、胃癌、卵巢癌、結腸癌等多種惡性腫瘤的發生、發展相關[17]。此外，也有報道顯示HuR表達水平與他莫昔芬敏感性相關。但是HuR對乳腺癌預后的影響結果仍不一致。本研究首次在接受他莫昔芬輔助治療的絕經前、雌激素受體陽性乳腺癌患者中證實HuR強表達與Ki-67增殖指數高相關，HuR強表達患者預后不佳。

既往研究中，HuR表達水平與乳腺癌患者預后的關系不一致。Giaginis等的研究發現HuR高表達與腫塊大、分期晚、ER陰性相關，且HuR高表達的患者總生存期和無病生存期更短[18]。另外還有四項研究也分別在208例浸潤性乳腺癌、125例浸潤性乳腺癌、139例接受紫杉醇聯合蒽環新輔助治療的乳腺癌患者、525例非-BRCA1/2突變乳腺癌患者中證實，HuR高表達與腫瘤侵襲性高、預后不佳相關[13,19-21]。以上五項研究的結果與我們的研究結果是一致的，提示HuR胞漿表達水平越高，腫瘤侵襲性越強，乳腺癌患者預后越差。但是也有研究得出相反的結果。在Ortega 的研究中[22]，HuR mRNA 表達水平越低，早期乳腺癌患者疾病復發風險越高。Yuan的研究也證實，預后差以及出現轉移并死于乳腺癌的患者，HuR轉錄水平更低[23]。分析這些研究結果的不一致性，發現原因可能包括以下方面：首先，前5項研究以及我們的研究檢測的是HuR蛋白水平，而后兩項研究檢測的是HuR mRNA水平，轉錄后水平的調控可能導致結果不一致；其次，檢測蛋白或mRNA的抗體不同可能導致結果不同；最后，通過分析這些研究中入組的乳腺癌患者的基本特征，我們發現在前5項證實HuR表達水平高預示預后差的研究中，激素受體陽性患者所占的比例更高(超過60%)，而在后2項HuR表達水平高者生存期長的研究中，激素受體陰性患者居多。如Yuan的研究中雌激素受體陰性者占68%。可見HuR可能在不同分型的乳腺癌患者中具有不同作用。

事實上，已經有一些基礎研究證實HuR在不同分型乳腺癌中發揮不同作用。在MCF-7細胞株中(激素受體陽性乳腺癌細胞株)，敲除HuR可導致cyclin D1下調，從而降低細胞生長。而在 MDA-MB-231細胞株中(三陰性乳腺癌細胞株)，敲除HuR可降低MMP-9水平，從而減弱細胞侵襲性但不影響細胞生長[24]。Gubin的研究也證實 HuR過表達可顯著降低三陰性乳腺癌的腫瘤生長和腫瘤體積。他們發現HuR可通過影響三陰性乳腺癌的血管形成從而影響腫瘤生長[25]。然而，目前還沒有HuR表達水平與不同分子分型臨床患者預后的相關研究。我們的研究首次在激素受體陽性乳腺癌患者中證明，HuR胞漿高表達與激素受體陽性乳腺癌預后不佳相關。

由于我們入組的均為接受他莫昔芬治療的患者，本研究結果也提示HuR胞漿水平高可能與他莫昔芬治療不敏感相關。Hostetter以及Tan的研究支持我們的結果。前者在他莫昔芬敏感細胞株MCF-7以及他莫昔芬耐藥細胞株BT474中證實，降低HuR胞漿表達水平可以提高細胞株對于他莫昔芬的敏感性[26]。Tan等在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細胞株中證實，miR26a/b與HuR的相互作用可以在轉錄后水平增加HER-2的表達，從而導致他莫昔芬耐藥[11]。目前已有許多學者正在研究HuR相關治療，今后有望通過這一手段逆轉他莫昔芬的耐藥，提高內分泌治療的療效。

綜上所述，本研究中，HuR胞漿表達水平高與Ki-67增殖指數高相關，再次證實HuR胞漿表達水平高的腫瘤侵襲性強。此外，本研究首次在接受他莫昔芬輔助治療的雌激素受體陽性乳腺癌患者中證實，HuR胞漿表達水平高與患者預后不佳相關，今后可能通過靶向HuR進一步提高他莫昔芬敏感性，改善患者生存。