ADP-核糖基化樣因子4C在腦膠質瘤中的表達及對替莫唑胺敏感性的影響

朱平華 王文華 別峰偉 高江濤

神經膠質瘤作為常見的原發性腦腫瘤，具有惡性度高、增值快、侵襲性強等特征，其中多形性膠質母細胞瘤(GBM)約占所有顱內腫瘤的40%，預后較差，平均存活期僅為14個月[1-2]。膠質瘤的手術、放化療方面在近年來取得了顯著的進步，但是其治療效果未達到理想[3]。烷化劑替莫唑胺(temozolomide,TMZ) 作為新一代化療藥物，是目前治療GBM最為治療效果最好的化療藥物，主要通過對多重DNA位點甲基化來發揮細胞毒性作用[4-5]。由于GBM細胞對烷化劑存在化療抵抗，因此TMZ輔助治療延長GBM患者的存活期的程度有限，大概3個月作用[6]。APD-核糖基化因子4C(ADP-ribosylation factor4C，ARL4C)屬于ARF亞家族成員之一，參與細胞內的囊泡運輸和信號轉導過程，有研究證實ARL4C參與腫瘤的發生發展，但具體機制尚不清楚[7-8]。因此本研究探討ADP-核糖基化樣因子4C在腦膠質瘤中的表達及對替莫唑胺敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年2月至2020年2月本院收治腦膠質瘤患者45例。納入標準：①符合《神經膠質瘤WHO(2007)分級標準》[9]，經手術后病理確診為腦膠質瘤；②KPS評分>60分；③血常規及其他生化指標基本正常； ④患者簽署自愿受試同意書，患者及其家屬需簽署知情同意書。排除標準：① 合并精神疾病患者；②合并其他惡性腫瘤患者；③合并其他器官嚴重性病變患者。

1.2 RT-qPCR檢測ARL4C表達水平

檢測腦膠質瘤組織中ARL4C的mRNA表達水平，使用RevertAid First Strand cDNA sythesis kit 試劑盒將提取的總RNA反轉錄為cDNA。使用Lightcycler 480 SYBR Green Ⅰ Master 試劑盒進行RT-qPCR，以GAPDH作為內參基因。mRNA的相關定量用2-△△Ct法。擴增條件為95 ℃預變性15 min；95 ℃ 15 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 s，40 ℃ 1 min，以上共進行40個循環。

1.3 治療方法及化療耐藥分析

所有患者均采用替莫唑胺(江蘇天士力帝益藥業有限公司，國藥準字H20040637)化療，口服替莫唑胺實際劑量為75 mg/m2·d-1，持續6 周。長期給予患者口服保肝、升血藥物輔助治療。用藥時間與劑量根據患者反應情況酌情增減。治療過程中，密切觀察患者臨床表現，每周復查患者血、尿、便常規，隔周復查患者主要生化物學指標。若不良反應較為嚴重，且對癥治療無明顯效果，給予減量或者停藥處理。患者可根據耐藥評價標準[10]分為敏感和耐藥，敏感為患者在化療完成后處于完全緩解狀態，后期復發間隔6個月以上，耐藥為患者在化療完成后處于癥狀未緩解狀態或者處于完全緩解狀態但是后期復發間隔在6個月以內。

1.4 RT-qPCR檢測ARL4C表達水平

檢測腦膠質瘤組織中ARL4CmRNA表達水平，使用RevertAid First Strand cDNA sythesis kit 試劑盒將提取的總RNA反轉錄為cDNA。使用Lightcycler 480 SYBR Green Ⅰ Master 試劑盒進行RT-qPCR，以GAPDH作為內參基因。mRNA的相關定量用2-△△Ct法。擴增條件為95 ℃預變性15 min；95 ℃ 15 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 s，40 ℃ 1 min，以上共進行40個循環。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 ARL4C表達與腦膠質瘤臨床病理特征的關系

結果顯示，ARL4C mRNA表達水平與淋巴結轉移、WHO分級密切相關(P<0.05)，而與腫瘤大小、性別、年齡無關(P<0.05)，見表1。

表1 ARL4C表達與腦膠質瘤臨床病理特征的關系

2.2 腦膠質瘤耐藥情況與ARL4C水平的關系

敏感組患者ARL4C水平顯著低于耐藥組(P<0.05)，見表2。

表2 腦膠質瘤耐藥情況與ARL4C水平的關系

2.3 ARL4C水平對化療藥物敏感性的多因素分析

根據Logistic多因素回歸分析結果，ARL4C表達水平均是影響腦膠質瘤對化療藥物敏感性的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 ARL4C水平對化療藥物敏感性的多因素分析

3 討論

膠質瘤是一種中樞神經系統內常見的原發性腦腫瘤，一般起源于白質的膠質細胞，浸潤性星形膠質細胞瘤是最為常見的膠質瘤[11]。根據其惡性程度分為四級，其中Ⅰ、Ⅱ級神經膠質細胞瘤的惡性程度較低，預后較好；高級別星形膠質細胞瘤包括Ⅲ級和Ⅳ級，其中Ⅲ級為多形性膠質細胞瘤，包括多形性星形膠質細胞瘤、多形性寡突星形角質細胞瘤和多形性寡突膠紙細胞瘤，Ⅳ級為膠質細胞瘤[12-13]。但是通過手術、放療、化療及靶向治療等手段緩解病情、延長生存時間、改善生存質量[14]。手術治療是目前治療腦膠質瘤的首選，主要是從腦內切除瘤組織，但往往不能將瘤細胞完全從腦內清除，通常還需要進行放化療治療[15]。替莫唑胺作為烷化劑，可通過輔助化療延長患者生存期[16]。替莫唑胺是目前公認的治療多形性神經膠質母細胞瘤最有效的化療藥物，能夠通過對腫瘤細胞DNA多重點位甲基化發揮細胞毒性作用，但是大多數患者會出現耐藥[17-18]。替莫唑胺主要通過DNA鳥嘌呤6位氧的甲基化發揮細胞毒作用[19]。替莫唑胺盡管能顯著延長膠質瘤患者的存活期，但程度有限，主要在于多形性膠母細胞瘤細胞對烷化劑的存在化療抵抗[20]。其具體機制是DNA鳥嘌呤6位氧甲基轉移酶的高表達導致的固有性耐藥與接受替莫唑胺化療后DNA錯配修復系統相關基因表達的下降或缺失所引起的獲得性耐藥[21]。

ARL4C屬于一類小G蛋白，是Ras相關GTP酶的亞家族，主要參與介導細胞的擴散和遷移過程[22]。ARL4C作為ARL4家族的成員之一，被認為是腫瘤發生、發展的關鍵基因[23]。ARL4C參與了多種生理功能，比如AI依賴性膽固醇分泌過程[24]。有研究報道在人腎癌細胞中ARL4C與α-微管蛋白之間存在相互作用，ARL4C在結腸癌和肺腺癌中均呈現高表達，與胃癌的腹膜傳播以及不良預后密切相關[25]。本研究中ARL4C mRNA的表達水平與淋巴結轉移、WHO分級密切相關，提示ARL4C 表達與腦膠質瘤的臨床病理特征相關，與已有的研究結果一致[26]。此外還發現敏感組患者ARL4C水平顯著低于耐藥組。ARL4C水平表達水平均是影響腦膠質瘤對化療藥物敏感性的獨立危險因素，提示ARL4C與替莫唑胺的敏感性存在相關性，但是具體機制尚不明確，還需進一步研究驗證。

綜上所述，本研究中ADP-核糖基化樣因子4C在腦膠質瘤中的表達與淋巴結轉移、WHO分級關系密切，且與替莫唑胺敏感性有關，旨在為腦膠質瘤的治療提供臨床指導意義。但是本研究存在一定的局限性，納入樣本量不足以及選取中心單一，需要進一步擴大樣本量以及更具前瞻性的研究試驗。