miR-29a-3p與ELN在早產兒支氣管肺發育不良患兒中的表達意義

許花芬，馮 瓊，李春蕾

(海南省人民醫院海南醫學院附屬海南醫院新生兒科，海口 570311)

支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)大多數發生于胎齡<32周的早產兒，其發病不利于早產兒預后[1-2]。尋找BPD早期標志物進行診斷并干預，有利于降低發病率和致殘率。微RNA(microRNA，miR)-29a可抑制靶基因mRNA翻譯，從而對其發揮轉錄后調控作用[3]。彈性蛋白(elastin，ELN)可為各血管壁細胞提供骨架結構，與心血管疾病發生有關[4]。ZHONG等[5]研究顯示，BPD小鼠肺組織中miR-29a-3p表達上調，ELN表達下調，但目前仍缺少miR-29a-3p、ELN在BPD早產兒血清中的表達研究。因此，本研究通過檢測不同時間點血清miR-29a-3p、ELN的表達水平，探討二者在BPD早產兒中的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年7月本院新生兒科收治的131例早產兒為研究對象。納入標準：(1)所有BPD早產兒符合BPD診斷標準[6]，其診斷要點為：低出生體重，早產，超過21%的氧氣治療至少28 d或糾正胎齡36周仍需氧氣治療，伴有進行性或持續性呼吸功能不全，有明顯肺部影像學表現；(2)胎齡≤32周、體重≤1 500 g，存活28 d以上者；(3)早產兒病歷資料齊全，研究符合倫理標準，經家長同意，并簽署同意書。排除標準：(1)有其他嚴重肺部疾病者；(2)有嚴重肺外感染者；(3)有先天性心臟病、先天性畸形、先天性代謝紊亂者。根據BPD診斷標準將其分為BPD組(34例)和非BPD組(97例)。

1.2 方法

1.2.1資料采集

收集整理兩組胎齡、性別、出生體重、剖宮產、機械通氣時間、吸氧時間、最高氧濃度、院內感染等一般資料。

1.2.2血清miR-29a-3p、ELN水平檢測

采集兩組早產兒出生后第1、7、14天靜脈血標本，分離血清，保存備用。采用RNA提取試劑盒(北京康瑞納生物科技有限公司)提取血清總RNA，檢測濃度后逆轉錄試劑盒(定州百克賽斯生物科技有限公司)將其逆轉錄為目標cDNA。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-29a-3p水平，反應體系：cDNA模板(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Hieff qPCR SYBR?Green Master Mix(2×，上海翌圣生物科技股份有限公司)10 μL，Rox reference dye(50×，上海經科化學科技有限公司)0.4 μL，無核酸酶的水6.0 μL。選用U6為內參基因，采用2—ΔΔCT法計算血清miR-29a-3p相對表達水平。所用引物委托美國Invitrogen公司合成，miR-29a-3p上游引物5′-GTA TCC GGT GAG TCC AAG CGC-3′，下游引物5′-GCT AGA CAG ATC CCA GTA C-3′；U6上游引物5′-CAT GAT GCA CGG CAA AGC ATC-3′，下游引物5′-GTA ATT ACC CGT CTC CGT GTC-3′。采用ELISA法檢測血清ELN水平(試劑盒購自武漢益普生物科技有限公司)。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較

與非BPD組比較，BPD組機械通氣時間、吸氧時間更長，最高氧濃度、院內感染率更高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

續表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組不同時間點血清miR-29a-3p、ELN水平比較

早產兒出生后第7、14天，BPD組miR-29a-3p相對表達水平高于非BPD組，ELN低于非BPD組，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著時間推移，BPD組miR-29a-3p相對表達水平逐漸上升，ELN水平逐漸下降，不同時間點比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組不同時間點血清miR-29a-3p、ELN水平比較

2.3 BPD組miR-29a-3p、ELN水平與一般資料的相關性

Pearson法及Spearman法分析結果顯示，BPD組早產兒出生后第7天miR-29a-3p與ELN水平呈負相關(P<0.05)，且機械通氣時間、吸氧時間、最高氧濃度、院內感染與miR-29a-3p呈正相關，與ELN呈負相關(P<0.05)，見圖1、表3。

2.4 miR-29a-3p、ELN水平對早產兒BPD的預測價值

以是否發生BPD為狀態變量繪制ROC曲線，結果顯示，早產兒出生后第7天miR-29a-3p、ELN及其聯合預測BPD發生的AUC分別為0.863(0.773，0.953)、0.878(0.819，0.937)、0.949(0.905，0.993)，且聯合預測AUC均大于miR-29a-3p、ELN單獨預測AUC(Z=1.687、1.908，P<0.05)，靈敏度分別為76.5%、82.4%、94.1%，特異度分別為89.7%、79.4%、86.6%，見圖2。

2.5 影響早產兒BPD發生的多因素logistic回歸分析

將早產兒是否發生BPD作為因變量，多因素logistic回歸分析結果顯示，miR-29a-3p、ELN是早產兒BPD發生的獨立影響因素(P<0.05)，見表4。

圖1 BPD組miR-29a-3p與ELN水平相關性

表3 BPD組miR-29a-3p、ELN與一般資料的相關性分析

圖2 血清miR-29a-3p、ELN水平預測早產兒BPD的ROC曲線

表4 影響早產兒BPD發生的多因素logistic回歸分析

3 討 論

早產兒肺部慢性疾病BPD的發病率呈上升趨勢，且嚴重威脅早產兒生命安全[7]。研究顯示，機械通氣相關因素均是引起BPD發生的危險因素，機體長時間的高氧暴露，使體內氧化和抗氧化系統平衡被打破，體內氧化應激反應會導致肺組織的結構和功能出現異常[8]。實現BPD早期預測是改善早產兒肺功能發育的重要前提。

miR已被證實與BPD的發病機制有關，miR-29家族的miR-29a下調可減輕BPD小鼠的肺損傷、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡[9-10]。本研究結果顯示，隨時間推移，BPD早產兒血清miR-29a-3p水平逐漸上升，ELN水平逐漸下降，miR-29a-3p、ELN表達趨勢與ZHONG等[5]動物模型實驗結果一致。此外，HU等[3]研究中抑制miR-29a可減輕高氧誘導的新生小鼠BPD，與本研究結果中miR-29a-3p與BPD的關系基本一致。推測本研究中血清miR-29a-3p水平上升后對靶基因ELN發揮轉錄后調控作用，抑制其翻譯成蛋白，使其在肺組織中的彈性支架作用減弱，造成肺部發育不良，推動BPD的發生。此外，本研究相關性結果考慮可能是由于部分BPD早產兒出生后長時間暴露于機械通氣及高氧環境中，造成肺部反復感染，而肺部感染可能會引起血清miR-29a-3p表達水平升高，miR-29a-3p負調控ELN使其表達降低，影響肺部發育、造成肺損傷，而肺損傷又使吸氧時間、機械通氣時間延長，形成惡性循環，促進BPD的發生、發展。NDZI等[11]研究發現，與健康對照組相比，活動性肺結核患者中hsa-miR-29a-3p明顯上調，進一步證明了血清miR-29a-3p表達水平與肺部感染的關系。

本研究ROC曲線分析結果顯示，血清miR-29a-3p、ELN聯合預測BPD的AUC、靈敏度有明顯升高。結合多因素分析結果，推斷血清miR-29a-3p、ELN表達水平的良好調節可能是預防及改善BPD發生、發展的新策略。DENG等[12]研究顯示，異常肺泡形成和過度紊亂的ELN積聚也可能是BPD的主要病理特征。表明ELN過度表達和積聚同樣不利于支氣管肺發育，今后仍需進一步探究ELN在支氣管肺發育中的平衡狀態。

綜上所述，miR-29a-3p、ELN是BPD發生的影響因素，檢測早產兒血清miR-29a-3p、ELN表達水平可早期預測BPD發生。今后將擴大樣本量，探究機械通氣、吸氧時間等是否影響miR-29a-3p、ELN表達水平。