代森錳及其代謝物的神經毒性影響與機制研究

劉朝陽,劉澤華,方艷艷,楊伯元

代森錳及其代謝物的神經毒性影響與機制研究

劉朝陽1,2,3*,劉澤華1,2,方艷艷1,2,楊伯元1,2

(1.中南財經政法大學環境與健康研究中心,湖北 武漢 430073；2.中南財經政法大學環境科學與工程系,湖北 武漢 430073；3.武漢大學人民醫院,湖北 武漢 430060)

以SH-SY5Y和PC12細胞為實驗模型,深入探討了代森錳(Maneb)及其代謝產物對多巴胺能神經細胞的毒性影響與機制.結果表明,Maneb的有機部分和金屬離子成分單獨暴露不具有明顯的毒性作用,聯合暴露具有協同效應,且對細胞活性的抑制程度與同一濃度水平的Maneb相當,其原因與誘導活性氧自由基生成、細胞凋亡相關.此外,蛋白免疫印跡法發現,Maneb下調Bcl-2的表達、上調Bax、細胞色素C的水平,同時激活Caspase-3,提示線粒體凋亡途徑在Maneb誘導多巴胺能神經細胞凋亡過程中的重要作用.

代森錳；SH-SY5Y細胞；PC12細胞；氧化應激；細胞凋亡

代森錳(Maneb)是一種典型的二硫代氨基甲酸酯類(DTC)殺菌劑,在農業生產中應用范圍廣泛[1],主要用于蔬菜、果樹的種植,可防治各種炭疽病、霜霉病、黑星病、疫病和斑點等[2].隨著該產品生產量和使用量的增加以及使用范圍的擴大,Maneb及其降解產物在地表水、飲用水、農作物和食品中都可被檢出[3-6],其對人類健康和環境安全的影響日益受到人們的關注.

目前關于Maneb毒性效應的研究表明其具有潛在的發育毒性和神經毒性.根據流行病學研究,在職業場景中單獨暴露于Maneb或者聯合暴露于Maneb和其它農藥均能顯著增加帕金森病(PD)的患病風險[7-8].體內研究表明,Maneb暴露可降低斑馬魚的生存能力和孵化率,并誘導脊索畸形導致發育毒性,而高濃度的Maneb暴露可產生神經毒性,使斑馬魚產生運動功能障礙[3,9].此外,Maneb可特異性地誘導多巴胺能神經元毒性損傷[10-11],且能誘導小鼠產生PD樣行為學和病理學改變[12],表現為運動功能障礙、大腦紋狀體多巴胺水平下降等[13].而根據體外研究結果顯示,Maneb的神經毒性機制研究集中在α-突觸核蛋白的聚集、蛋白質硫醇烷基化、線粒體功能障礙、谷胱甘肽氧化導致的氧化應激、細胞凋亡等途徑[14-19].Maneb由Mn2+和有機配體乙二硫代氨基甲酸酯(EBDC)共同構成,Maneb的溶液形式相對穩定,但也可能降解為Mn2+和游離的EBDC[3].以往的研究發現使用Maneb處理細胞后會導致細胞培養液中Mn2+的積累[20-22].此外,許多研究表明乙撐硫脲(ETU)是Maneb有機部分的主要降解和代謝產物[23-25].目前,Maneb的有機部分和金屬離子成分都已被證明具有潛在的毒性[20-21].然而Maneb針對多巴胺能神經細胞的主要毒性成分研究存在缺失,其致神經細胞的毒性效應和機制尚待闡明.

本研究選取Maneb及其代謝產物為研究目標,以多巴胺能神經細胞SH-SY5Y細胞和PC12細胞為模型,從細胞活力、細胞內活性氧自由基(ROS)生成、細胞凋亡水平來評價各毒素成分的單獨和聯合毒性效應,從而探討Maneb的主要毒性成分.此外,通過檢測不同濃度梯度Maneb處理下,細胞中線粒體凋亡途徑關鍵蛋白如Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平,以深入研究線粒體凋亡途徑在Maneb暴露致多巴胺能神經細胞凋亡中的作用,從而為進一步研究Maneb誘導神經細胞損傷機制提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 化學試劑 Maneb、代森鈉(Nabam)、ETU均購自阿爾塔科技有限公司(1ST21098, 1ST21096, 1ST21100, 1ST24013),MnCl2購于上海麥克林生化科技有限公司(M813486).Cell Counting KIT-8 (CCK-8)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(CK04);活性氧測定試劑盒購于南京建成科技有限公司(E004-1-1);細胞凋亡與壞死檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司(C1056);Bax抗體、Cytochrome C抗體購于Abcam公司(ab32503, ab133504), Bcl-2抗體購于Cell Signaling Technology公司(10571T),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體、Caspase-3抗體購于Proteintech公司(HRP- 60004, 19677-1-AP).

1.1.2 儀器設備 二氧化碳培養箱(HERAcell150i, Thermo Scientific);生物安全柜(HR40-IIA2, Haier);化學發光成像系統(ChemiDocTMTouch, Bio-Rad Laboratories);倒置熒光顯微鏡(IX73, OLYMPUS);酶標儀(SpectraMaxi3x, Molecular Devices).

1.1.3 細胞培養 人神經母瘤細胞SH-SY5Y和大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞PC12由武漢大學生命科學院提供,使用DMEM培養基(含10%胎牛血清,1%青霉素-鏈霉素溶液),置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中傳代培養,取對數生長期的細胞進行實驗.

1.2 實驗方法

1.2.1 Maneb及其代謝產物對細胞的暴露 使用二甲基亞砜(DMSO)溶解Maneb及其代謝產物,配置濃度為100mmol/L的儲存液于-80℃中保存, 10mmol/L的使用液于-20℃中保存,臨用前使用DMEM培養基稀釋至實驗處理濃度,并保證DMSO體積分數小于0.1%.處理細胞時,先將對數生長期細胞接種于培養皿或培養板中,在培養箱中培養24h后棄原培養基,加入含有設定濃度藥品的新培養基.根據以往的研究[15,21],本文使用Nabam和MnCl2分別模擬Maneb的有機主體和金屬離子成分.

1.2.2 細胞活性的檢測 使用CCK-8法測定細胞活性.將SH-SY5Y細胞和PC12細胞分別接種于96孔板中,約1×104細胞/孔,在37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24h后用于實驗.根據預實驗的結果,用不同濃度的毒素處理細胞,每個濃度至少設置3個重復.處理24h后,棄培養基,每孔加入100μL的新培養基,再加入10μL的CCK-8溶液,在37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養1h后,在450nm波段用酶標儀讀數.

1.2.3 細胞內ROS的檢測 使用DCFH- DA探針法檢測細胞內ROS的水平.將SH-SY5Y細胞和PC12細胞分別接種于12孔板中,約1×105細胞/孔,在37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24h后用于實驗.針對不同的毒素,使用相同的濃度(20μmol/L)處理細胞,每個濃度設置6個重復.在處理24h后,棄原培養基,加入500μL無血清DMEM培養基配置的濃度為10mmol/L的DCFH-DA染色液.在37℃、5% CO2恒溫培養箱中孵育20～30min,使用PBS洗滌3次后,直接在熒光顯微鏡中觀察并拍照.

1.2.4 細胞凋亡的檢測 使用Hoechst 33342/PI雙染法檢測細胞凋亡與壞死情況.將SH-SY5Y細胞和PC12細胞分別接種于12孔板中,約1×105細胞/孔,在37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24h后用于實驗.處理方式和濃度與1.2.3相同,染色液使用試劑盒中的緩沖液配置,每800μL的染色緩沖液中,Hoechst染色液和PI染色液各加入5μL.在4℃條件下孵育20～30min,使用PBS洗滌一次后,在熒光顯微鏡下觀察并拍照.記錄細胞的Hoechst藍色熒光和PI紅色熒光圖,并將兩種熒光圖重疊得到Merge處理的圖片.

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達水平 在細胞培養皿中分別培養并用Maneb處理SH-SY5Y和PC12細胞24h,使用含蛋白酶抑制劑的NP-40裂解液(NP- 40Lysis Buffer)提取并溶解細胞內蛋白,加入蛋白上樣緩沖液混合后,在100℃條件下煮沸10min制得蛋白樣.電泳時,每孔上樣量為10μg,60V恒壓電泳60min后調至120V恒壓電泳30min,使用蛋白轉印系統將蛋白轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂牛奶常溫封閉1h,孵育一抗,4℃過夜.次日,用洗膜緩沖液(TBST)洗6次,室溫孵育二抗1h,再次用TBST洗膜6次后,在化學發光成像系統中顯影.

1.2.6 統計學分析 熒光值和蛋白條帶灰度值均使用ImageJ軟件讀取分析.實驗數據均由SPSS statistics 22.0完成統計學分析,并使用Graphpad Prism 8.0制作圖表,結果均以平均值±標準差(±SD)表示,再使用單因素方差分析法比較各組之間的差異,以<0.05為顯著性標準.

2 結果與分析

2.1 Maneb及其代謝產物暴露下細胞形態變化觀察

A為SH-SY5Y細胞處理組;B為PC12細胞處理組;標尺=25μm

使用Maneb、Nabam、ETU、MnCl2分別處理SH-SY5Y和PC12細胞,白光下觀察對細胞密度和形態的影響如圖1所示.處理濃度在20μmol/L以上時,Maneb對SH-SY5Y細胞和PC12細胞都有明顯的損傷,主要表現在處理24h后細胞密度減小、貼壁率降低、細胞間隙增大且出現皺縮現象.作為Maneb的主要代謝產物,ETU和MnCl2在處理濃度大于600μmol/L時會出現類似現象;對于與Maneb有機部分相同的Nabam,其處理濃度在200μmol/L以上時能對細胞產生明顯的毒性作用.而將Nabam與MnCl2聯合暴露于細胞時,在30μmol/L的處理濃度下便能損傷大量細胞,其毒性作用與Maneb相當.

2.2 Maneb及其代謝產物對神經細胞的毒性

使用Maneb和Nabam分別處理SH-SY5Y和PC12細胞,通過CCK-8法檢測它們對細胞活性的影響,結果如圖2所示.Maneb濃度依賴性地影響細胞活力,隨著處理濃度的增加,細胞活力逐漸減少.在濃度為20μmol/L時,使用Maneb處理24h使細胞活力下降過半;Nabam在低濃度時對細胞活力沒有影響,處理濃度為400μmol/L時會使細胞活力大幅降低.

ETU、MnCl2以及Nabam與MnCl2聯合作用對SH-SY5Y和PC12細胞活力影響如圖2所示.處理時間為24h,處理濃度低于200μmol/L時,ETU和MnCl2的單一暴露對細胞活力的影響較小,其中MnCl2對細胞的刺激作用稍大于ETU.處理濃度低于200μmol/L時,Nabam對細胞活力影響較小.而使用Nabam聯合MnCl2處理細胞時,二者毒性表現為協同作用,在20μmol/L的濃度條件下使細胞活力大幅下降,對細胞活力的影響遠大于單一暴露.這與2.1中細胞形態觀察結果一致.

圖2 Maneb及其代謝產物對多巴胺能神經細胞活力的影響

A、B為SH-SY5Y細胞處理組;C、D為PC12細胞處理組

2.3 Maneb及其代謝產物對神經細胞ROS水平的影響

在20μmol/L的濃度條件下,分別使用Maneb、Nabam、ETU、MnCl2以及Nabam+MnCl2處理SH-SY5Y細胞和PC12細胞24h.如圖3所示,單一暴露處理中,Maneb處理組誘導細胞產生的ROS與對照組及其他單一藥物處理組相比差異極顯著(<0.01).ETU和MnCl2處理組與對照組相比基本沒有差異,Nabam處理組能誘導細胞產生極少的ROS,與對照組相比有顯著差異(<0.05).聯合暴露中,Nabam與MnCl2的同時處理可誘導細胞產生大量ROS,與Nabam和MnCl2單一處理組相比差異極顯著(<0.01),與Maneb單一處理誘導的ROS生成量相當,呈現協同作用.

圖3 Maneb及其代謝產物對多巴胺能神經細胞ROS水平的影響

A、B分別為SH-SY5Y和PC12細胞ROS熒光圖;C為柱形統計圖

字母表示多巴胺能神經細胞暴露于20μmol/L濃度的各毒素產生ROS的差異性,字母相同代表差異性不顯著(>0.05),字母不同代表差異性顯著(<0.05);熒光圖標尺=50μm

A、B分別為SH-SY5Y和PC12細胞凋亡熒光圖;C為柱形統計圖

字母表示多巴胺能神經細胞暴露于20μmol/L濃度的各毒素發生凋亡的差異性,字母相同代表差異性不顯著(>0.05),字母不同代表差異性顯著(<0.05);熒光圖標尺=50μm

2.4 Maneb及其代謝產物對神經細胞凋亡的影響

與2.3的處理方式類似,在20μmol/L的濃度條件下,分別使用Maneb、Nabam、ETU、MnCl2以及Nabam+MnCl2處理SH-SY5Y和PC12細胞24h,Maneb及其代謝產物對細胞凋亡水平的影響如圖4所示.對于單一暴露,在Maneb處理組中,細胞凋亡率與對照組和其他處理組相比具有顯著差異,說明Maneb可誘導細胞凋亡且毒性顯著高于其代謝產物.對于Nabam和MnCl2的聯合暴露,其誘導的細胞凋亡水平顯著高于Nabam和MnCl2單一暴露的結果,表明它們對細胞凋亡的誘導也具有協同作用.

2.5 Maneb對神經細胞內線粒體凋亡途徑相關蛋白表達水平的影響

圖5 Maneb對神經細胞內線粒體凋亡途徑相關蛋白表達的影響

A、C分別為SH-SY5Y和PC12細胞的WB條帶圖;B、D分別為A、C對應的柱形統計圖

與對照組相比,*<0.05,**<0.01,***<0.001,****<0.0001

在不同濃度的Maneb中暴露24h后,SH-SY5Y細胞和PC12細胞內線粒體凋亡途徑中的關鍵生物標志物Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cytochrome C (Cyt C)的蛋白表達水平的變化見圖5.與對照組相比,Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白表達水平均呈上升趨勢,Bcl-2呈下降趨勢,其變化程度與Maneb的暴露劑量呈正相關.Maneb的處理濃度達10μmol/L以上時,Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白表達水平呈顯著上升,Bcl-2表達水平呈顯著下降.這些結果表明, Cyt C和Caspase-3可能在Maneb引起的細胞凋亡中起重要作用,而Bax和Bcl-2蛋白水平的改變也預示著線粒體凋亡途徑被激活.

3 討論

3.1 Maneb對神經細胞毒性的主要毒性成分

以往對于Maneb毒性作用的討論主要分為三類:一是金屬離子成分,尤其是Mn2+導致了細胞毒性.多項研究證實,在體內和體外模型中,使用Maneb處理后會導致體內和體外模型中Mn2+濃度顯著增加[20,26-27].因此,Maneb有可能通過改變細胞內的金屬濃度來破壞金屬穩態.Vaccari等[28]的研究表明,是Maneb的金屬離子成分Mn2+而非有機部分,抑制了腦突觸囊泡中的谷氨酸轉運蛋白.二是Maneb的有機部分而非金屬離子導致了神經細胞毒性.Soleo等[29]發現代森錳鋅(Mancozeb)和代森鋅(Zineb, ZB)對于原代中腦細胞的毒性作用相當,從而支持了這一觀點.三是Maneb的毒性可能是涉及有機部分和金屬離子成分的共同作用機制,這主要是通過研究Nabam和MnCl2聯合暴露的毒性來證實的[24,30].

本研究發現MnCl2在較高濃度下會抑制細胞增殖和細胞活性,但在與Maneb相同的處理條件下,MnCl2并未產生毒性效應,這與以往的研究結果相同.Carmona等[22]比較了不同存在形式的錳對多巴胺能神經細胞的毒性,結果發現Maneb的毒性最大且顯著大于MnCl2和硫酸錳(MnSO4).Hoffman等[21]指出MnCl2會導致細胞中的Mn顯著積累,但在Maneb的毒性濃度下并不會對細胞產生毒性.另一項研究以結腸細胞為模型,發現Maneb毒性顯著大于與其有機部分相同的Zineb,而MnCl2的毒性與ZnCl2相當[20],說明決定Maneb毒性作用大小的并非金屬離子成分.

表1 EBDC類物質及其降解產物的化學結構

在毒性效應層面上,本研究發現處理濃度為20μmol/L時,在SH-SY5Y和PC12細胞中,Maneb可顯著誘導ROS的生成,并導致細胞凋亡,但相同處理條件下MnCl2暴露并沒有產生毒性效應.Domico等[31]使用MnCl2處理大鼠中腦多巴胺能細胞和γ-氨基丁酸(GABA)能細胞時,在相同濃度條件下,其產生的ROS遠低于Maneb.這些結果表明Mn2+并不能完全解釋Maneb的細胞毒性,Maneb的有機部分在細胞毒性過程中也發揮著重要作用.另外,由于Nabam有著與Maneb相同的核心有機成分,多項研究使用Nabam研究Maneb有機部分的毒性作用[20-21,24,31],結果與本研究一致,即Nabam僅在較高的濃度下才會產生細胞毒性.又因為Maneb的有機部分會降解和代謝為ETU,本研究發現ETU對多巴胺能神經細胞活性影響較小,在Maneb的毒性濃度下對細胞活性氧水平和細胞凋亡率并無影響,這與以往的研究結果類似[24,31].Maneb和ETU的化學結構見表1.綜上,僅有機部分也不能完全解釋Maneb的細胞毒性作用.

本研究提出Maneb的有機部分和金屬離子成分的協同毒性效應,將細胞同時暴露于Nabam和MnCl2,以模擬Maneb的化學結構.結果顯示,Nabam與MnCl2聯合暴露的毒性顯著高于此二種毒素單獨處理細胞時的毒性,對SH-SY5Y和PC12細胞活性的損傷效果與Maneb相近,在相同處理濃度下其導致細胞產生ROS的水平和誘導細胞凋亡的水平與Maneb相當.Hoffman等[21]使用Nabam和MnCl2聯合處理結腸細胞時,在與Maneb相同的濃度范圍內,導致了細胞存活率的降低,同時細胞產生的過氧化物水平與Maneb相近.這些數據都支持了Maneb的有機部分和金屬離子部分之間的協同毒性機制.此外,在有機部分發揮毒性作用的機理研究中, EBDC類殺菌劑的有機配體具有與Cu2+、Zn2+螯合的能力,促進其在細胞內的積累,故有機部分導致的細胞內金屬濃度的上升很可能在Maneb細胞毒性中發揮作用.金屬在各種生化反應中充當著催化輔助因子,因此,它們的濃度受到生物系統的嚴格調節,而這種穩態控制會被細胞內金屬離子的積累所破壞.在Maneb暴露于細胞時,還會導致Mn2+在細胞內的積累,而這些金屬離子的積累會進一步導致ROS的產生.

總之,Maneb的有機部分可以與一些過渡金屬離子螯合,促進其在細胞內的積累,但毒性作用有限.Hoffman的結論表明[20-21],暴露于Maneb時,其有機部分會導致HT-29細胞和Caco2細胞中Mn、Zn和Cu的顯著積累,細胞內金屬濃度的快速增加改變了金屬穩態,產生金屬超載狀態,導致氧化損傷,進而產生細胞毒性.Maneb的毒性可能是其有機部分和金屬離子成分協同作用產生的.

3.2 Maneb暴露致神經細胞凋亡的作用及機制

針對Maneb暴露對多巴胺能神經細胞的毒性作用,本研究使用CCK-8法揭示了其對SH-SY5Y和PC12細胞增殖活性的抑制,在此基礎上,進一步對Maneb抗增殖作用的深層次機理進行探討,即從ROS生成、細胞凋亡通路的分子層面闡述其致神經細胞的損傷機制.

ROS是氧化應激的指示物,可作為信號轉導分子直接或間接調節基因的表達從而導致細胞毒性[32],其穩態濃度的增加會干擾細胞代謝、誘導細胞凋亡或壞死[33],而線粒體是細胞內ROS的主要來源[34].有研究提出,Maneb會誘導還原性谷胱甘肽(GSH)的上調,但在與百草枯共同作用時并不能增加SH-SY5Y細胞中ROS的積累[19],低濃度Maneb的暴露并不會對大鼠神經干細胞ROS的穩態和抗氧化系統產生影響[10].本研究中,毒性濃度的Maneb可顯著誘導SH-SY5Y和PC12細胞中的ROS生成,引起細胞凋亡和壞死,進而抑制了細胞增殖.如3.1所述,Maneb可能通過擾亂細胞內的金屬穩態導致ROS的增多,而ROS的產生可能會與線粒體的損傷相互促進而加強細胞毒性,并誘導細胞凋亡.

細胞凋亡是程序性細胞死亡過程,在生物體正常發育、細胞內環境穩態的維持過程中均發揮著重要作用,而細胞凋亡失調或過度凋亡會導致多種疾病[35],如多巴胺能神經元的過度凋亡可導致帕金森病的發生[36].本研究中,Maneb在20μmol/L的濃度下可顯著導致SH-SY5Y和PC12細胞的凋亡.研究表明,細胞凋亡與線粒體功能異常密切相關,最主要的內源性凋亡途徑即是線粒體凋亡途徑[37].而在Maneb的毒性機制中,線粒體功能障礙是重要因素.Maneb可特異性損傷線粒體呼吸鏈復合物III即細胞色素C還原酶,但其具體的作用機制尚不清楚[16].最新的研究中,Anderson等[15,17]發現Maneb可通過其硫醇結構發揮毒性作用,Maneb的聚合物構型與線粒體蛋白的硫醇結構具有空間鄰近性,這有助于Maneb靶向針對線粒體關鍵代謝酶中高度敏感的蛋白質硫醇和Fe-S簇直接相互作用,導致線粒體功能失調.總之,Maneb誘導多巴胺能神經細胞凋亡的作用與其對線粒體功能的損傷密切相關,線粒體凋亡途徑可能是其誘導細胞凋亡的主要途徑.

3.3 Maneb暴露致神經細胞凋亡中的線粒體凋亡途徑

線粒體凋亡途徑中,在DNA損失、氧化應激等各種凋亡信號的刺激下,位于線粒體外膜上的Bcl-2家族蛋白表達異常,包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax間的相互作用,導致線粒體膜的通透性改變,從而降低線粒體的膜電位[38].而后處于線粒體膜間隙的細胞色素C被釋放至細胞質中,與胞質中的另一凋亡蛋白Apaf-1結合而激活Caspase級聯反應,進而誘導細胞凋亡[39].研究發現,Maneb可能激活線粒體通路,誘導細胞凋亡[40-41].本研究結果顯示, Maneb可抑制SH-SY5Y和PC12細胞的增殖,并誘導細胞凋亡,且能濃度依賴性上調Bax、Cyt C和Caspase-3的蛋白表達水平,下調Bcl-2蛋白表達水平.以上結果提示了Maneb誘導的SH- SY5Y和PC12細胞凋亡可能是通過線粒體凋亡途徑實現的.但關于Maneb激活線粒體凋亡途徑中的信號通路變化和具體分子機制有待進一步的研究.

總之,Maneb致SH-SY5Y和PC12細胞的損傷機理涉及氧化應激、細胞凋亡及凋亡信號轉導通路,其可能的途徑為:Maneb的有機部分和金屬離子成分導致了金屬離子如Cu2+、Zn2+、Mn2+在細胞內的積累,因此引起了SH-SY5Y和PC12細胞內氧化應激增強,產生了過多的ROS,加之其對線粒體呼吸鏈復合物III的特異性抑制,導致了線粒體功能障礙,進一步激活了線粒體凋亡通路中各分子Bax、Caspase-3表達升高,Bcl-2表達降低,同時使Cyt C從線粒體中釋放至胞漿,誘導細胞凋亡,并最終影響細胞增殖和活性.以上結果提示Bax和Bcl-2參與的線粒體凋亡途徑,在Maneb誘導多巴胺能神經細胞凋亡的過程中起重要作用.

4 結論

4.1 Maneb對多巴胺能神經細胞的毒性作用顯著強于其代謝產物.較低濃度的Maneb的代謝產物暴露對細胞形態、細胞活性、ROS水平、細胞凋亡的影響并不明顯.

4.2 Nabam和MnCl2聯合暴露時產生的毒性效應與Maneb單獨暴露相當,能顯著抑制多巴胺能神經細胞的細胞活性、提高ROS水平、誘導細胞凋亡.

4.3 Maneb會通過線粒體凋亡途徑誘導多巴胺能神經細胞凋亡.隨著Maneb暴露濃度的增加,細胞中Bcl-2的表達降低,Bax、Cyt C表達升高, Caspase-3水平上升.

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Neurotoxic effects and mechanisms of Maneb and its metabolites.

LIU Chao-yang1,2,3*, LIU Ze-hua1,2, FANG Yan-yan1,2, YANG Bo-yuan1,2

(1.Research Center for Environment and Health, Zhongnan University of Economics and Law, Wuhan 430073, China；2.Department of Environmental Science and Engineering, Zhongnan University of Economics and Law, Wuhan 430073, China；3.Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China)., 2022,42(9)：4399～4408

The toxicological effects and mechanisms of Maneb and its metabolites on dopaminergic cells were investigated in depth using SH-SY5Y cells and PC12 cells as experimental samples. The results showed that the organic and metal ion components of Maneb did not have obvious toxic effects when exposed alone, but had synergistic effects when exposed in combination, and the degree of inhibition to cells viability was comparable to that of Maneb at the same concentration level. The reasons for this were related to the generation of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis. In addition, the Western Blotting revealed that Maneb reduced the expression of Bcl-2, elevated the level of Bax and Cytochrome C and activated Caspase-3 in a dose-dependent manner, suggesting an important role of the mitochondrial apoptosis pathway in dopaminergic cells apoptosis induced by Maneb.

Maneb；SH-SY5Y cells；PC12 cells；oxidative stress；cell apoptosis

X171.5

A

1000-6923(2022)09-4399-10

2022-02-18

國家自然科學基金優秀青年基金項目(81822016),國家自然科學基金面上項目(81571249),中國博士后科學基金項目(2020M672420),高等學校學科創新引智基地(B21038)

*責任作者, 副教授, lcy@zuel.edu.cn

劉朝陽(1986-),男,湖北洪湖人,副教授,博士,主要研究方向為環境毒理與健康、環境健康風險評估.發表論文近40篇.