高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器法測(cè)定尿素乳膏含量

柳冬梅，趙慧

尿素是一種極性小分子，由二氧化碳和液氮經(jīng)化學(xué)反應(yīng)后脫水而制得，又稱為碳酰胺或脲，具有較強(qiáng)的末端紫外吸收［1］。

泰州市中醫(yī)院的尿素乳膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱中國(guó)藥典）均采用顯色后紫外-可見分光光度法，具有重現(xiàn)性差，操作繁瑣及不適合批量分析等問題［2］。因此，有必要開發(fā)一種新方法用于測(cè)定尿素乳膏的含量，解決現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法的可操作性及重現(xiàn)性等問題。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前尿素乳膏的測(cè)定方法主要有電位滴定法，紫外-可見分光光度法及高效液相色譜法（HPLC）［3-5］。其中HPLC大多選用氨基柱和紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，存在靈敏度低，色譜柱消耗大，檢測(cè)成本高等問題［6-8］。電霧式檢測(cè)器（CAD）響應(yīng)信號(hào)依賴于被測(cè)物的絕對(duì)質(zhì)量，可用于分析各種半揮發(fā)性或不揮發(fā)性的酸性、堿性、中性、非極性及極性的兩性離子［9-19］。

本研究起止時(shí)間為2019年5月至2020年3月，通過建立HPLC-CAD法測(cè)定尿素乳膏的含量，新建的方法具有操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，可為尿素乳膏的質(zhì)量控制提供新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥高效液相色譜儀（型號(hào)UltiMate 3000，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、CAD（型號(hào)CoronaVeo SD，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），電子天平（型號(hào)XPR-225，瑞士Mettler公司）

15%的尿素乳膏（泰州市中醫(yī)院，批號(hào)20190125、20181220、20181101，規(guī)格15%）；尿素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100288-201302）；乙腈（色譜純，Merck公司）；乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水均由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件 采用Waters XBridge Amide酰胺色譜柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；水-乙腈（10∶90）為流動(dòng)相；柱溫為35℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；CAD參數(shù)設(shè)置：霧化溫度為35℃，冪率為0.9，過濾常數(shù)為10 s，采集頻率為10 Hz。

1.2.2 溶液制備 精密稱取尿素對(duì)照品25 mg，置量瓶中，加乙醇適量，超聲使其完全溶解后，用乙醇稀釋使成濃度為每毫升中約含1 mg尿素的溶液，搖勻，作為儲(chǔ)備液。

精密量取儲(chǔ)備液適量，分別用乙醇定量稀釋制成濃度為每毫升中約含0.5 mg、0.2 mg、0.1 mg、0.05 mg、0.02 mg、0.01 mg及0.005 mg尿素的溶液，作為系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

稱取尿素乳膏樣品約1.3 g（約相當(dāng)于尿素200 mg），精密稱定，置100 mL量瓶中，加乙醇適量，于60℃的水浴中加熱20 min使其完全溶解后，冷卻至室溫，用乙醇定容，搖勻，置冰浴中冷卻，濾過，棄去初濾液；精密量取續(xù)濾液10 mL，置100 mL量瓶中，用乙醇定容，搖勻，作為供試品溶液。

精密量取儲(chǔ)備液10 mL，置50 mL量瓶中，加乙醇定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

根據(jù)泰州市中醫(yī)院尿素乳膏的配方制備空白基質(zhì)，精密稱取空白基質(zhì)1.3 g，置100 mL量瓶中，按照供試品溶液配制的方法，同法制備空白溶液。

1.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與破壞性試驗(yàn) 分別精密吸取空白溶液，尿素對(duì)照品溶液及尿素乳膏供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1），結(jié)果表明，溶劑對(duì)尿素主峰無干擾，尿素乳膏基質(zhì)中的輔料及其他成分對(duì)測(cè)定無干擾，理論塔板數(shù)按尿素色譜峰計(jì)算大于15 000。

圖1 空白溶液（A）、供試品溶液（B）、對(duì)照品溶液（C）的高效液相色譜圖

精密稱取尿素對(duì)照品10 mg，5份，分別置20 mL量瓶中，加乙醇適量使其完全溶解，分別經(jīng)過堿（0.1 mol/mL氫氧化鈉）破壞，酸（0.1 mol/mL鹽酸）破壞，光照（4 500 lx）破壞，氧化（30%過氧化氫）破壞及高溫（水浴加熱）破壞后，得到相應(yīng)的破壞性溶液。

精密量取破壞溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖2）。結(jié)果表明，各破壞條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)峰對(duì)測(cè)定均無干擾，表明新建的方法分離效果好，專屬性強(qiáng)。

圖2 破壞性試驗(yàn)色譜圖

1.2.4 線性與范圍 精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各10 μL，依次注入液相色譜儀，進(jìn)樣分析并記錄各色譜圖。以尿素色譜峰峰面積（Y）作為縱坐標(biāo)，濃度（X）作為橫坐標(biāo)，繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程：Y=2712X-13.726，r=0.999。結(jié)果表明尿素在0.005～0.5 g/L的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.5 進(jìn)樣精密度與重復(fù)性 精密吸取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定。6次測(cè)定的主峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為0.52%（n=6），結(jié)果表明該液相色譜儀的進(jìn)樣精密度良好。

分別精密稱取尿素乳膏樣品（批號(hào)20181220）6份，制備相應(yīng)的供試品溶液，進(jìn)樣分析，測(cè)定尿素乳膏的含量。結(jié)果尿素含量為標(biāo)示量的97.9%（n=6），RSD為0.91%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

1.2.6 定量限（LOQ）和檢測(cè)限（LOD） 將“1.2.2”項(xiàng)下最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液逐級(jí)稀釋，并依次進(jìn)樣測(cè)定。按信噪比（S/N）=10計(jì)算，該方法測(cè)定尿素的定量限為5 ng；按S/N=3計(jì)算，該方法測(cè)定尿素的檢測(cè)限為2.5 ng。

1.2.7 溶液的穩(wěn)定性 取同一份尿素乳膏供試品溶液（批號(hào)20181220），分別在0 h、4 h、8 h和12 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果主峰峰面積的RSD為0.53%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

1.2.8 回收率試驗(yàn) 稱取空白基質(zhì)各6份，精密稱定，分別置100 mL量瓶中，再依次精密加入尿素對(duì)照品適量，制備6份供試品溶液。依次進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，見表1。

表1 回收率結(jié)果

1.2.9 耐用性 調(diào)節(jié)流動(dòng)相中乙腈和水的比例，柱溫及流速等參數(shù)，考察尿素色譜主峰的理論塔板數(shù)，對(duì)稱因子及其與各雜質(zhì)峰之間的分離情況。結(jié)果表明，尿素色譜峰的對(duì)稱因子均小于1.2，且雜質(zhì)對(duì)尿素測(cè)定無干擾，結(jié)果表明該方法耐用性良好。

1.2.10 樣品測(cè)定 分別稱取尿素乳膏樣品和尿素對(duì)照品適量，制備尿素乳膏供試品溶液與對(duì)照品溶液，每批樣品分別制備2份供試品溶液，每份分別進(jìn)樣2次，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算尿素標(biāo)示量的百分含量，批號(hào)20181101、20181220、20190125的三批次樣品檢測(cè)含量分別為95.6%、98.0%、92.5%，對(duì)應(yīng)的RSD分別為0.38%、1.20%、0.41%。

2 討論

2.1 色譜柱的選擇本研究采用酰胺色譜柱進(jìn)行尿素乳膏的研究分析。XBridge Amide色譜柱使用穩(wěn)定的三鍵鍵合式的酰胺官能團(tuán)作為鍵合相，其選擇性與氨基柱相近，但是化學(xué)性質(zhì)更加穩(wěn)定，因此該色譜柱耐受性更強(qiáng)，穩(wěn)定性更高，壽命更長(zhǎng)，更適合于極性物質(zhì)的分析［20］。

2.2 CAD的相關(guān)參數(shù)設(shè)置CAD影響信號(hào)響應(yīng)的參數(shù)主要有三類：①采集頻率和過濾常數(shù)。通過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，采集頻率和過濾常數(shù)的增大，色譜圖中基線波動(dòng)越小，同時(shí)色譜峰的平滑度也越好，通過試驗(yàn)比較最終設(shè)置采集頻率和過濾常數(shù)分別為10 Hz和10 s。②霧化溫度。CAD主要通過加熱進(jìn)行霧化，且待測(cè)物的信號(hào)響應(yīng)與其霧化程度息息相關(guān)，因此試驗(yàn)分別考察55℃和35℃兩種不同霧化溫度對(duì)信號(hào)響應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著霧化溫度的升高，尿素色譜峰的響應(yīng)明顯降低，不利于尿素的檢測(cè)，最終選用35℃的霧化溫度。③冪率。冪率是CAD特有的線性校正參數(shù)，不同類型的化合物具有不同的最優(yōu)冪率，實(shí)驗(yàn)考察不同的冪率（0.8、0.9、1.0、1.1）對(duì)線性的影響，結(jié)果見表2。研究發(fā)現(xiàn)冪率為0.9時(shí)，尿素在0.005～0.500 g/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系最佳。

表2 冪率（PFV）參數(shù)優(yōu)化