微小RNA-525-5p通過靶向RECQ樣蛋白5調控乳腺癌放射敏感性

梁猛

保乳術后的放射治療在臨床上已經很成熟，可以保留大多數早期乳腺癌病人的器官；即使乳房切除后，放射治療仍然是防止術后局部復發的有效手段［1-2］。然而，放射抗性是影響乳腺癌病人預后的重要因素［3-4］。miRNA在癌癥中的功能得到普遍認可，其不僅參與癌癥的發生發展，在癌癥的放化療抗性中可具有重要作用［5-6］。研究報道微小RNA-525-5p（miR-525-5p）可抑制宮頸癌細胞的增殖和轉移［7］。朱長春等［8］在乳腺癌放射治療的研究中報道，miR-525-3p為乳腺癌細胞輻照后表達異常升高的miRNA之一，具有成為放射治療新靶點的潛力。然而miR-525-5p對乳腺癌放射敏感性的影響及機制尚未清楚。RECQ解旋酶（recQ helicase）為DNA解旋酶，被稱為“基因的守護者”，包括RECQL1、WRN、BLM、RECQL4和RECQL5等成員，其表達水平與乳腺癌病人的預后密切相關［9-10］。RECQL5基 因 與DNA復制、修復和轉錄密切相關，Peng等［11］報道，三陰性乳腺癌細胞中的RECQL5功能受損，導致DNA損傷持續存在、G2停滯，最終導致增殖停止，表明RECQL5可能是TNBC的潛在治療靶點。RECQL5高表達促進非小細胞肺癌的轉移和對順鉑的耐藥性［12］，但是RECQL5在乳腺癌中的功能研究甚少。因此，本研究在2019年6月至2020年6月開展，旨在探討miR-525-5p、RECQL5對人乳腺癌細胞MDAMB-231輻射照射敏感性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、BT474、非惡性乳腺上皮細胞MCF-10A均購自美國菌種保藏中心；DMEM培養基購自invitrogen公司；胎牛血清購自上海江林生物科技有限公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑購自美國Sellect公司；LipofectamineTM2000購自上海陽光生物科技有限公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自上海玉博生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）購自武漢邁博瑞生物膜技術有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-Fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒購自上海臻諾生物有限公司。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、BT474以及正常乳腺上皮細胞MCF-10A使用DMEM培養基（10%胎牛血清）在37℃、5%二氧化碳的恒溫細胞培養箱中進行常規培養。

1.2.2 轉染和分組 將正常培養的MDA-MB-231、MCF-7、BT474、MCF-10A細胞分別標記為MDA-MB-231組、MCF-7組、BT474組、MCF-10A組。將MDA-MB-231細胞按隨機數字表法分為miR-525-5p模擬物（miR-525-5p mimics）陰性對照（miR-NC）組、miR-525-5p組、RECQL5小干擾RNA陰性對照（si-NC）組、RECQL5小干擾RNA（si-RECQL5）組、miR-525-5p+RECQL5過表達空載體（pcDNA）組、miR-525-5p+RECQL5過表達載體（pcDNA-RECQL5）組。處理方法：按照脂質體LipofectamineTM2000的說明書操作，將miR-NC、miR-525-5p mimics、si-NC、si-RECQL5、miR-525-5p mimics+pcDNA、miR-525-5p mimics+pcDNA-RECQL5轉 染至MDA-MB-231細 胞，轉染4 h后，補充培養基繼續培養48 h，在進行轉染效率的檢測。確定轉染成功后方可用于后續試驗。

1.2.3 miR-525-5p、RECQL5 mRNA的qRT-PCR檢測實驗 取適量對數生長期“1.2.2”各組細胞，提取細胞總RNA后，快速將其合成cDNA，再用qRT-PCR試劑盒進行miR-525-5p、RECQL5檢測。以U6、GAPDH為 內 參 ，用2-ΔΔCt=［（CTmiRNA-CTU6）Treatment group-（CTmiRNA-CTU6）Control group］計算miR-525-5p的 表 達 ，2-ΔΔCt=［（CTRECQL5-CTGAPDH）Treatment group-（CTRECQL5-CTGAPDH）Control group］計算RECQL5的表達。信物序列（5'-3'）：miR-525-5p正向引物CUCCAGAGGGAUGCAC，反向引物GTGCAGGGTCCGAGGT；U6、GAPDH均采用通用內參引物序列。RECQL5引物由上海吉瑪公司設計合成。

1.2.4 RECQL5的蛋白檢測實驗 取適量對數生長期“1.2.2”各組細胞，冰上用蛋白裂解液充分裂解并提取總蛋白，定量后用沸水浴法進行變性。將蛋白用聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，再將蛋白轉移到PVDF膜。將膜用脫脂奶粉封閉2 h后浸入一抗（1∶1 500）溶液中孵育過夜（4℃）。結束后再將膜浸入二抗（1∶1 000）溶液中孵育2 h（37℃）。用超敏ECL電化學發光試劑盒對膜進行顯影曝光，再用Image J分析條帶灰度值。

1.2.5 細胞凋亡檢測 按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒要求操作，首先將“1.2.2”各轉染組細胞用500 μL的結合緩沖液懸浮，然后依次加入Annexin V-FITC、PI，避光反應后上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。細胞總凋亡率（%）為Annexin V-FITC染色陽性細胞百分比與PI陽性染色細胞百分比之和。

1.2.6 克隆形成實驗檢測細胞的輻射敏感性 先用Siemens Primμs直線加速器6 mV高能X線，設置劑量率3 Gy/min，以0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy垂直照射10 cm×10 cm范圍，距靶源30 cm，在輻射照射結束后放置在37℃，5%二氧化碳培養箱中常規培養傳代，約培養4 d。平皿底部出現肉眼可見的小白點，用甲醇固定（15 min）和吉姆薩染色（25 min），最后在顯微鏡下觀察細胞的克隆數，并計數。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-525-5p與RECQL5的結合力 用生物信息學在線預測網站Target Scan（http：//www.targetscan.org/）預測miR-525-5p的靶標。為了驗證miR-525-5p與RECQL5之間的 靶 向關系 ，將RECQL5 3′UTR-WT（含RECQL5 3′UTR片 段）和RECQL5 3′UTR-MUT（含RECQL5 3′UTR片段突變體）克隆至載體psi-CHECK2中，構建熒光素酶報告載體psiCHECK2-RECQL5-3′UTR WT、psiCHECK2-RECQL5-3′UTR MUT。再用LipofectamineTM2000法分別將其與miR-525-5p、miR-NC、miR-525-5p抑制物（anti-miR-525-5p）、anti-miR-525-5p陰性對照（anti-miR-NC）共轉染至MDA-MB-231，24 h后，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊操作并分析檢測結果。

1.2.8 統計學方法 實驗數據的分析使用SPSS 21.0軟件，數據相關圖片的繪制使用GraphPad Prism 6.0，計量資料用表示，多組間數據比較采用單因素方差分析+LSD-t檢驗，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞中miR-525-5p、RECQL5的表達與MCF-10A組 相 比，MDA-MB-231、MCF-7、BT474組細胞中miR-525-5p mRNA表達顯著降低，RECQL5 mRNA和蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）。選擇與正常細胞差異有統計學意義的MDA-MB-231細胞進行后續試驗研究。見圖1，表1。

圖1 RECQL5蛋白的表達

表1 miR-525-5p、RECQL5在乳腺癌細胞中的表達/

表1 miR-525-5p、RECQL5在乳腺癌細胞中的表達/

注：MCF-10A為人非惡性乳腺上皮細胞，MDA-MB-231、MCF-7、BT474為人乳腺癌細胞，miR-525-5p為微小RNA-525-5p，RECQL5為RECQ樣蛋白5。①與MCF-10A組比較，P＜0.05。

組別MCF-10A MDA-MB-231 MCF-7 BT474 F值P值重復次數9999 miR-525-5p mRNA 1.01±0.08 0.28±0.02①0.33±0.02①0.42±0.03①508.74＜0.001 RECQL5 mRNA 1.00±0.08 1.68±0.15①1.58±0.12①1.48±0.11①58.98＜0.001 RECQL5蛋白0.99±0.07 1.43±0.11①1.38±0.12①1.53±0.14①39.55＜0.001

2.2 細胞凋亡及過表達miR-525-5p調節乳腺癌細胞的輻射敏感性與miR-NC組相比，miR-525-5p組MDA-MB-231細胞中miR-525-5p表達顯著升高，細胞凋亡率顯著升高，在2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy輻照下，細胞存活分數均顯著降低（P＜0.05），見表2；圖2，3。miR-NC組、miR-525-5p組的單擊多靶模型的參數值見表3，放射增敏比（SER）值為1.659，具有增敏作用。

表2 過表達miR-525-5p對乳腺癌細胞輻射敏感性的影響/

表2 過表達miR-525-5p對乳腺癌細胞輻射敏感性的影響/

注：miR-NC為微小RNA-525-5p模擬物陰性對照，miR-525-5p為微小RNA-525-5p。

組別miR-NC miR-525-5p t值P值重復次數99 miR-525-5p 1.00±0.06 1.86±0.07 27.98＜0.001凋亡率/%7.43±0.54 25.76±1.15 43.28＜0.001存活分數2 Gy 0.89±0.06 0.67±0.54 1.22＜0.001 4 Gy 0.75±0.07 0.41±0.04 12.65＜0.001 6 Gy 0.55±0.05 0.04±0.01 30.01＜0.001 8 Gy 0.34±0.03 0.03±0.01 29.41＜0.001

圖2 過表達miR-525-5p調節乳腺癌細胞的凋亡

表3 miR-NC組、miR-525-5p組的單擊多靶模型參數

2.3 miR-525-5p靶向RECQL5結果如圖4A所示，生物信息學預測顯示，miR-525-5p與RECQL5存在靶向互補結合位點。與miR-NC組相比，miR-525-5p組WT-RECQL5細胞的熒光活性顯著降低0.23±0.02，1.00±0.08；與miR-NC組相比，miR-525-5p組細胞中RECQL5相對蛋白表達量顯著降低0.20±0.02，1.01±0.08，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-525-5p組細胞中RECQL5相對蛋白表達量顯著升高1.79±0.16，1.00±0.09（圖4B，P＜0.05）。

圖4 RECQL5的3’UTR中含有與miR-525-5p互補的核苷酸序列和RECQL5蛋白表達

2.4 敲減RECQL5對乳腺癌細胞輻射敏感性的影響與si-NC組相比，si-RECQL5組MDA-MB-231細胞中RECQL5表達顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，在2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy輻照下，細胞存活分數均顯著降低（P＜0.05），見表4，圖5。si-NC組、si-RECQL5組的單擊多靶模型的參數值見表5，SER值為1.882，具有增敏作用。

表5 si-NC組、si-RECQL5組的單擊多靶模型參數

圖5 敲減RECQL5對乳腺癌細胞輻射敏感性的影響：A為流式細胞儀檢測細胞凋亡；B為Western blotting檢測RECQL5蛋白表達

表4 敲減RECQL5對乳腺癌細胞輻射敏感性的影響/

表4 敲減RECQL5對乳腺癌細胞輻射敏感性的影響/

注：RECQL5為RECQ樣蛋白5，si-NC為RECQ樣蛋白5小干擾RNA陰性對照，si-RECQL5為RECQ樣蛋白5小干擾RNA。

組別si-NC si-RECQL5 t值P值重復次數99 RECQL5 1.73±0.14 0.86±0.07 16.68＜0.001凋亡率/%7.50±0.51 23.16±2.01 22.66＜0.001存活分數2 Gy 0.89±0.09 0.67±0.06 6.10＜0.001 4 Gy 0.75±0.07 0.41±0.04 14.62＜0.001 6 Gy 0.55±0.05 0.04±0.01 30.01＜0.001 8 Gy 0.34±0.03 0.03±0.01 29.41＜0.001

2.5 過表達RECQL5逆轉miR-525-5p對乳腺癌細胞輻射的增敏作用與miR-525-5p+pcDNA組相比，miR-525-5p+pcDNA-RECQL5組MDA-MB-231細 胞中miR-525-5p表達顯著降低，細胞凋亡率顯著降低，在2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy輻照下，細胞存活分數均顯著升高（P＜0.05），見表6，圖6。miR-525-5p+pcDNA組、miR-525-5p+pcDNA-RECQL5組的單擊多靶模型的參數值見表7，SER值為1.286，具有增敏作用。

表6 過表達RECQL5對miR-525-5p的乳腺癌細胞輻射增敏作用的影響/

表6 過表達RECQL5對miR-525-5p的乳腺癌細胞輻射增敏作用的影響/

注：RECQL5為RECQ樣蛋白5，miR-525-5p為微小RNA-525-5p，miR-525-5p+pcDNA為微小RNA-525-5p與RECQ樣蛋白5過表達空載體，miR-525-5p+pcDNA-RECQL5為微小RNA-525-5p與RECQ樣蛋白5過表達載體。①與miR-525-5p+pcDNA組比較，P＜0.05。

組別miR-525-5p miR-525-5p+pcDNA miR-525-5p+pcDNA-RECQL5 F值P值重復次數999 RECQL5 0.32±0.03 0.30±0.02 0.81±0.08 292.56＜0.001 miR-525-5p 1.00±0.08 0.98±0.07 0.46±0.04①196.19＜0.001凋亡率/%24.81±2.11 24.14±2.02 8.65±0.79①246.48＜0.001存活分數2 Gy 0.69±0.07 0.66±0.06 0.85±0.07①21.02＜0.001 4 Gy 0.41±0.07 0.38±0.04 0.72±0.05①106.30＜0.001 6 Gy 0.05±0.01 0.04±0.01 0.57±0.05①919.00＜0.001 8 Gy 0.04±0.02 0.03±0.01 0.38±0.04①510.43＜0.001

表7 miR-525-5p+pcDNA組、miR-525-5p+pcDNARECQL5組的單擊多靶模型參數

圖6 乳腺癌細胞凋亡及RECQL5蛋白表達：A為流式細胞儀檢測細胞凋亡；B為Western blotting檢測RECQL5轉染情況

3 討論

miRNA是一種有19-25個核苷酸組成的內源性、穩定的非編碼小分子RNA，其可沉默靶基因的轉錄，抑制蛋白的翻譯，進而參與癌癥的進展［13］。Anne等［14］報道miR-525-3p在宮頸癌細胞、骨肉瘤細胞和臍靜脈細胞融合細胞輻射照射后的表達水平明顯上調，增強輻射照射的敏感性，并且miR-525-3p可靶向β抑制蛋白1（β-arrestin 1，ARRB1）、硫氧還蛋白（thioredoxin，TXN1）和熱休克蛋白A9（heatshock protein A9，HSPA9），揭示miR-525-3p的上調及其直接靶標ARRB1、TXN1和HSPA9的下調是輻射后細胞存活的關鍵作用，提示miR-525-3p可能是改善放射敏感性的潛在靶標。Mark等［15］發現，在膀胱癌和乳腺癌中miR-525-3p為DNA修復基因結合位點miRNA之一，其表達水平異常下調，且對放射治療后膀胱癌、乳腺癌病人的生存率具有明顯的調控作用。令人遺憾的是，miR-525-5p對乳腺癌細胞輻射照射的敏感性的調控并未深入探究。本研究檢測了乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7、BT474中miR-525-5p的表達，結果顯示，miR-525-5p異常降低，為其在癌癥中的功能研究奠定基礎；進一步研究發現，過表達miR-525-5p可促進乳腺癌細胞的凋亡，增強癌細胞對輻射照射的敏感性，為提高乳腺癌的放射治療的療效提供新的作用靶點；通過生物信息學分析、雙熒光素酶報告基因檢測實驗及Western blotting證實miR-525-5p可負向調控RECQL5的表達。

RECQL5是RecQ家 族DNA解 旋酶的成員，在同源重組、堿基切除修復、復制和轉錄中具有關鍵作用［16］。Lin等［17］研 究發現胃 癌 組織中RECQL5 mRNA的表達顯著下調，RECQL5的低表達與腫瘤的浸潤深度，組織學分化程度和TNM分期顯著相關，提示胃癌病人的預后較差。Arora等［18］的研究中發現，乳腺癌中RECQL5的表達水平明顯升高，這與高組織學分級、更高的有絲分裂指數、去分化、多形性和生存率低顯著相關，揭示了其在乳腺癌中的致癌功能，提示RECQL5是一種有前途的乳腺癌生物標志物。Sun等［19］發現，RECQL是一種潛在的乳腺癌易感基因，其突變有助于家族性乳腺癌的發展。因此，我們推測RECQL5在乳腺癌放射治療中具有增敏作用。本研究檢測了乳腺癌細胞中RECQL5的表達，發現RECQL5高表達，這與前人的研究結果均相一致；進一步研究發現，敲減RECQL5可促進乳腺癌細胞凋亡，增強其對輻照的敏感性，更重要的是，過表達RECQL5可逆轉miR-525-5p對乳腺癌細胞輻照的增敏作用，這不僅說明RECQL5具有輻照增敏作用，其輻照增敏功能還受miR-525-5p的逆向調控。這些結果為增強乳腺癌放射治療的療效提供新靶點，探索miR-525-5p、RECQL5在乳腺癌中的功能機制提供更充分的實驗依據。

綜上所述，miR-525-5p可增強乳腺癌細胞對輻射照射的敏感性，這可能與其靶向RECQL5促進癌細胞凋亡有關，為乳腺癌的放射治療提供新方向。