長鏈非編碼RNA LINC00662靶向微小RNA-103a-3p對黑色素瘤細胞增殖和周期的影響

郭春輝，梁科峰，張小偉

皮膚黑色素瘤在皮膚惡性腫瘤中排行第三，大約占皮膚癌的10%，具有高侵襲、惡化程度高、預后差等特點［1-2］。據報道，在亞洲國家黑色素瘤的發病率遠低于歐非國家，而現在中國黑色素瘤新發現的病例以每年約2萬例的趨勢上升［3-5］。目前關于黑色素瘤的治療首選還是以臨床外科治療為主，以延長病人的生存時間［6］。雖然黑色素瘤在治療方面取得了較大的進展，但是其發病率和死亡率依然居高不下［7］。因此，需要尋找與皮膚黑色素治療相關的新靶標以及分子機制。

大多數研究表明，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，LncRNAs）和miRNA（MicroRNAs）在人類疾病的發生和發展中發揮著重要作用［8-9］，且長鏈非編碼RNA可以通過調控miRNA的表達參與癌癥細胞的增殖、凋亡、周期和轉移等。研究表明，LINC00662在結腸癌［9］、宮頸癌［11］、肺癌［12］、胃癌［13］等腫瘤中有相關的報道，而在皮膚黑色素瘤中的表達和作用機制研究未見報道。本研究通過生物信息學網站預測了LINC00662的3’UTR存在miR-103a-3p連續的結合位點。有研究表明，miR-103a-3p在肺癌中表達下調，過表達miR-103a-3p能夠抑制肺癌細胞的增殖、遷移等［14］。楊雨澎等［15］研究表明，過表達miR-103a-3p抑制肝癌細胞的增殖、阻止細胞周期阻滯。關于LINC00662和miR-103a-3p在皮膚黑色素瘤中功能尚不清楚。因此，本研究于2018年10月至2020年2月，以黑色素瘤為研究對象，觀察沉默LINC00662、抑制miR-103-a-3p對黑色素瘤細胞增殖、周期的影響，為黑色素瘤的治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料皮膚黑色素瘤組織及正常組織的樣本均從平煤神馬醫療集團總醫院于2018年10月至2020年2月確診的26例皮膚黑色素瘤病人中獲得，切除后立即存放到液氮中，-80℃保存，直至實驗使用。所有病人或其近親屬知情同意，且本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 試劑與細胞人皮膚黑色素瘤細胞株A375、A875、B16、SK-MEL-2和HEMa-LP均購自復旦大學細胞庫；10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公 司 ；小 干 擾RNA陰 性 對 照（si-NC）、LINC00662小干擾RNA（si-LINC00662）、miRNA抑制劑陰性對照（anti-miR-NC）和miR-103a-3p抑制劑（anti-miR-103a-3p）購于上海吉瑪公司；LipofectamineTM2000試劑盒均購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、CCK-8試劑盒、RIPA緩沖液均購自上海碧云天生物科技有限公司；細胞周期蛋白1（Cyclin D1）、增殖細胞核抗原（PCNA）和β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自美國Abcam公司。

1.3 細胞培養與轉染將解凍后的人皮膚黑色素瘤細胞株A375、A875、B16、SK-MEL-2和HEMa-LP分別接種于含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素于5%二氧化碳37℃條件下培養箱中進行孵育。取對數生長期A375細胞，接種到6孔細胞培養板中，密度為2.5×105，待細胞密度融合至70%～80%時，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書操作，分別將si-NC、si-LINC00662、anti-miR-NC和anti-miR-103a-3p轉染至A375細胞。然后隨機分四組：si-NC組、si-LINC00662組、si-LINC00662+antimiR-NC組 和si-LINC00662+anti-miR-103a-3p組。轉染48 h后，檢查轉染效率。

1.4 qRT-PCR檢測LINC00662和-miR-103a-3p表達水平按照Trizol法提取各組A375細胞的總RNA，測定濃度和純度，按照逆轉錄試劑盒操作步驟進行合成cDNA，按照實時熒光定量PCR試劑盒步驟進行操作。LINC00662正向引物為：5'-TGGACATCTGTCTGGAGG-3'，反向引物為：5'-GGCTGAGGCATAAGAATCG-3'；β-actin正 向 引 物 為 ：5'-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'；反向引物為：5'-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'；miR-103a-3p正向引物為：5′-ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGTACAGGG-3′，反向引物為：5′-TGGTGTCGCGTGGAGTCG-3′；U6正 向 引 物 為 ：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物 為 ：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。LINC00662和miR-103a-3p分別以β-actin和U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算LINC00662和miR-103a-3p表達水平。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖收集A375細胞，制備單細胞懸液，加入到96孔板中，5×103個/孔，并設置6個重復。分別在培養24 h、48 h、72 h時，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h。按照CCK-8試劑盒步驟進行操作，使用酶標儀在450 nm下檢測光密度（OD）值。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期收集轉染48 h后的A375細胞，用胰蛋白酶消化細胞，PBS重懸細胞，4℃靜置24 h后，離心棄上清，PBS洗滌2次，1 000 μL PBS重懸，轉管，室溫下Annexin-V-FITC和PI進行染色15 min，流式細胞儀檢測細胞周期情況。

1.7 Western blotting檢測Cyclin D1、PCNA表達使用RIPA緩沖液試劑盒提取A375細胞的總蛋白，用BCA法檢查蛋白的濃度。經10%SDS-PAGE電泳轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h，取膜，4℃標記一抗過夜孵育，PBS清洗3次，1 h室溫下進行二抗孵育，取膜。PBS清洗3次，加入ECL化學發光液，顯色，曝光。計算分析Cyclin D1和PC-NA蛋白的相對表達量。

1.8 熒光素酶報告基因實驗驗證靶向關系將構建的LINC00662-WT（突變型）和LINC00662-MUT（野生型）載體，分別將miR-NC或miR-103a-3p轉染到A375細胞。轉染48 h后，收集細胞，加入裂解液，離心收集上清，使用雙熒光素酶報告基因檢查系統檢測熒光速酶活性。

1.9 統計學方法所有試驗數據均采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析與作圖，數據表示均為3個獨立實驗的，兩組間比較通過t檢驗，多組間比較通過單因素方差分析。通過Pearson分析兩組之間的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LINC00662在皮膚黑色素瘤的組織和細胞中的表達qRT-PCR結果顯示，與正常組織1.24±0.50相比，皮膚黑色素瘤組織的LINC00662表達4.17±1.27，顯著升高（t=10.95，P＜0.001），而人皮膚黑色素瘤 細 胞 株A375、A875、B16和SK-MEL-2中 的LINC00662的 表 達量（5.62±0.43、5.01±0.83、2.94±0.53、4.97±0.43）均 顯著高于HEMa-LP細胞1.00±0.07（F=40.91，P＜0.001）。

2.2 沉默LINC00662對皮膚黑色素瘤細胞增殖和周期的影響結果顯示，與si-NC組相比，si-LINC00662組的LINC00662表達、細胞增殖水平顯著降低（表1）。流式細胞術檢測結果顯示，相較于si-NC組 ，si-LINC00662組G0/G1期 的 細 胞 比 例 增多、S期細胞比例減少。

表1 沉默LINC00662對細胞增殖的影響/

表1 沉默LINC00662對細胞增殖的影響/

組別si-NC si-LINC00662 t值P值重復次數3 3 LINC00662 1.00±0.06 0.48±0.06 10.61＜0.001 OD值0 h 0.29±0.04 0.28±0.04 0.31 0.775 24 h 0.52±0.03 0.38±0.04 4.85 0.008 48 h 0.71±0.05 0.50±0.08 3.86 0.018 72 h 0.84±0.04 0.59±0.07 5.37 0.006

Western blotting檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-LINC00662組的Cyclin D1、PCNA蛋白表達顯著降低，見表2，圖1。

圖1 各組細胞增殖相關蛋白表達

表2 沉默LINC00662對細胞周期和增殖相關蛋白表達的影響/

表2 沉默LINC00662對細胞周期和增殖相關蛋白表達的影響/

注：Cyclin D1為細胞周期蛋白1，PCNA為增殖細胞核抗原。

組別si-NC si-LINC00662 t值P值重復次數33 G0/G1 57.4±5.2 74.7±4.8 4.23 0.013 S 34.7±3.5 20.5±3.0 5.34＜0.001 G2/M 7.8±0.6 7.4±0.5 0.89 0.425 PCNA 0.99±0.05 0.53±0.06 10.20 0.001 Cyclin D1 1.00±0.01 0.56±0.06 12.53＜0.001

2.3 miR-103a-3p在黑色素瘤組織和細胞中的表達qRT-PCR檢測顯示，與正常組織1.17±0.32相比，黑色素瘤組織中的miR-103a-3p為0.64±0.21，明顯降低（t=7.06，P＜0.001）；而人皮膚黑色素瘤細胞株A375、A875、B16和SK-MEL-2的miR-103a-3p的表 達 水 平（0.32±0.04、0.38±0.03、0.59±0.10、0.40±0.06）均 顯 著 低 于HEMa-LP細 胞0.99±0.04（F=63.25，P＜0.001）。

2.4 LINC00662與miR-103a-3p靶向結合利用在線軟件Starbase預測LINC00662與miR-103a-3p靶向結合位點（圖2），雙熒光素酶報告實驗進一步驗證其靶向關系，結果顯示，miR-103a-3p顯著降低了LINC00662-WT的螢光素酶活性，但對LINC00662-MUT的熒光素酶活性無明顯影響（表3）。對LINC00662和miR-103a-3p進行相關分析，顯示LINC00662和miR-103a-3p負相關。

圖2 Starbase軟件預測LINC00662與miR-103a-3p靶向結合位點

表3 雙熒光素酶報告基因實驗驗證LINC00662與miR-103a-3p靶向關系/

表3 雙熒光素酶報告基因實驗驗證LINC00662與miR-103a-3p靶向關系/

組別miR-NC miR-103a-3p t值P值重復次數3 3 LINC00662-WT 1.01±0.02 0.46±0.05 17.69＜0.001 LINC00662-MUT 0.99±0.07 0.99±0.06 0.00＞0.999

2.5抑制miR-103a-3p部分回復了沉默LINC00662對皮膚黑色素瘤細胞增殖和周期的影響qRT-PCR結果顯示，si-LINC00662組的miR-103a-3p的表達明顯高于si-NC組（表4）。與si-LINC00662+anti-miR-NC相 比，si-LINC00662+antimiR-103a-3p組的miR-103a-3p表 達 降低、G0/G1期細胞比例減少，細胞增殖水平升高、S期細胞比例增加以及Cyclin D1、PCNA蛋白表達也明顯升高（圖3，表5）。

表4 抑制miR-103a-3p逆轉了沉默LINC00662對細胞的增殖作用/

表4 抑制miR-103a-3p逆轉了沉默LINC00662對細胞的增殖作用/

注：①與si-NC組比較，P＜0.05。②與si-LINC00662+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別si-NC si-LINC00662 si-LINC00662+anti-miR-NC si-LINC00662+anti-miR-103a-3p F值P值重復次數3 3 3 3 miR-103a-3p 1.00±0.06 1.83±0.20①1.86±0.07 1.33±0.07②38.75＜0.001 OD值0 h 0.33±0.02 0.31±0.05 0.28±0.04 0.31±0.04 0.84 0.511 24 h 0.54±0.06 0.40±0.05 0.42±0.05 0.47±0.05 4.21 0.046 48 h 0.74±0.03 0.52±0.03①0.55±0.05 0.68±0.05②19.34 0.001 72 h 0.93±0.03 0.58±0.06①0.64±0.05 0.78±0.05②30.77＜0.001

表5 抑制miR-103a-3p逆轉了沉默LINC00662對細胞周期和增殖相關蛋白表達的作用/

表5 抑制miR-103a-3p逆轉了沉默LINC00662對細胞周期和增殖相關蛋白表達的作用/

注：PCNA為增殖細胞核抗原，Cyclin D1為細胞周期蛋白1。①與si-NC組比較，P＜0.05。②與si-LINC00662+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別si-NC si-LINC00662 si-LINC00662+anti-miR-NC si-LINC00662+anti-miR-103a-3p F值P值重復次數3333 G0/G1 55.8±2.4 70.1±3.2①71.1±4.1 59.2±1.8②19.74＜0.001 S 36.2±2.5 21.8±2.8①21.5±2.5 32.7±3.0②23.18＜0.001 G2/M 8.0±0.6 8.1±0.8 7.4±1.1 8.0±0.5 0.50 0.693 PCNA 1.00±0.05 0.51±0.05①0.48±0.06 0.69±0.08②45.60＜0.001 Cyclin D1 0.99±0.06 0.52±0.01①0.51±0.07 0.73±0.05②55.09＜0.001

圖3 各組細胞增殖相關蛋白表達

3 討論

皮膚黑色素瘤是由黑色素細胞中的黑色素生成的，是一種常見的惡性皮膚腫瘤，處于晚期的皮膚黑色素病人，目前尚無有效的治療途徑［16］。lncRNA在惡性黑色素瘤的細胞功能研究中起著至關重要的作用。有研究表明，抑制lncRNA TUG1表達能以抑制黑色素瘤細胞生長［17］。袁春蓉、劉勇寧［18］研究表明，SNHG3通過調節miR-186-5p，抑制黑色素瘤的生長。lncRNA-MEG3在黑色素瘤組織和細胞中表達下調，與不良的預后顯著相關，通過miR-499-5p的過表達抑制了黑色素瘤細胞的增殖和細胞 周 期 阻 滯［9］，這 與 前 人 的 研 究 結 果［18］相 反 。LINC00662作為新發現LncRNA，有研究表明，通過Linc00662在前列腺細胞表達上調，可促進細胞的增殖［20］。王君蓮等［11］研究表明，LINC00662通過miR-409-5p在宮頸癌中發揮著致癌作用。LINC00662在結腸癌中表達上調，高表達LINC00662通過上調miR-340-5p的表達，抑制結腸癌細胞的生長［21］。以上研究表明LINC00662在癌癥中發揮著重要作用。

本研究結果表明，與正常組織和皮膚黑色素細胞，通過檢測LINC00662表達量，發現皮膚黑色素瘤組織和細胞中高表達，表明LINC00662可能在皮膚黑色素瘤組織中發揮著一定的作用。進一步研究表明，沉默LINC00662的表達，與si-NC組相比，LINC00662表達水平降低，細胞增殖受到抑制，細胞G0/G1期的細胞比例增多、S期細胞比例減少，與增殖、周期相關蛋白Cyclin D1、PCNA表達水平降低。lncRNA可以海綿吸附下游的miRNA，調控miRNA的表達進而影響腫瘤的發生與發展［22］。有研究表明，AGAP2-AS1通過調節下游miR-16-5p，促進肝癌的轉移和復發［23］。為了進一步探究LINC00662在皮膚黑色素瘤中調控的下游靶基因，本研究通過在線預測軟件和雙熒光素酶實驗驗證了LINC00662與miR-103a-3p可以靶向結合，且呈負相關。有研究表明 ，LINC00662靶 向 調 控miR-497-5p表 達 ，抑 制LINC00662的表達可以抑制結直腸癌細胞生長，阻滯細胞周期［24］。在骨肉瘤的研究中，LINC00662表達上調，通過干擾LINC00662調控miR-15a-5p對骨肉瘤細胞的增殖、遷移等［25］。miR-103a-3p，也可稱為miR-103，可以調節腫瘤細胞分子機制，如增殖、凋亡、周期等［26-27］。有研究表明，過表達miR-103a-3p可以抑制甲狀腺癌細胞、肺癌細胞的生長和轉移［14，28］。本研究結果發現，與正常組織和皮膚黑色素細胞，miR-103a-3p在皮膚黑色素瘤組織和細胞株中的表達下調，這與多人的研究結果一致，在此證實了miR-103a-3p在癌癥中的抑癌作用。進一步實驗證明，抑制miR-103a-3p可以逆轉沉默LINC00662對皮膚黑色素瘤細胞的增殖、周期的影響，說明LINC00662可以通過調控miR-103a-3p的表達進而影響皮膚黑色素瘤中的作用。

綜上所述，沉默lncRNA LINC00662的表達可以抑制皮膚黑色素瘤的增殖，以及細胞周期阻滯，其機制可能與miR-103a-3p有關，為皮膚黑色素的靶向治療提供合理依據。