大豆響應低磷脅迫的XTH基因鑒定及XTH38調節根系生長研究

張亞楠，王 婷，歐斯艷，李方劍，黃麗雅，麥翠珊，王金祥*

（1 華南農業大學資源環境學院/華南農業大學根系生物學中心，廣東廣州 510642；2 廣東省農業農村污染治理與環境安全重點實驗室，廣東廣州 510642）

細胞壁修飾酶在調節細胞壁的可塑性方面發揮重要作用。木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶 (xyloglucan endotransglycosylases/hydrolases, XTHs)是一類參與纖維素/木葡聚糖交聯和重塑的酶，XTH在細胞伸長過程中作用于微絲-基質界面[1–2]，保持細胞壁的厚度、完整性和強度[3–5]。擬南芥 (Arabidopsisthaliana)和水稻 (Oryzasativa) 基因組分別有33和29個XTH基因[6]。已經發現超表達AtXTH19和AtXTH2促進側根的發育，提高植物的耐鹽性[7]，超表達AtXTH30增強對鹽脅迫的敏感性[8]，超表達辣椒 (C.annuumcv.Pukang)CaXTH3提高擬南芥的耐旱性和耐鹽性[9]。AtXTH21功能喪失限制主根的生長，其通過改變木聚糖的質量和纖維素的沉積調節根的生長[10]。超表達胡楊 (Populuseuphratica)PeXTH的煙草更耐鹽[11]。這些研究說明，XTH基因在植物生長發育和響應非生物逆境方面起重要作用，但對于大豆XTH在生長發育和耐受逆境方面的功能還不清楚。

本研究通過生物信息學分析，明確大豆 (Glycine max) 基因組含有61個XTH基因家族成員；根據氨基酸序列進行進化分析，將大豆XTH家族分為3個亞組；通過定量PCR鑒定出受低磷(LP)誘導的XTH基因，尤其是GmXTH38在根葉均受LP誘導。在正常養分條件下，超表達GmXTH38導致擬南芥主根變短、側根數增多和側根密度增加。與Col-0相比，在LP、低鐵(LFe)和高鐵(HFe，鐵毒) 脅迫條件下，超表達GmXTH38的擬南芥主根變短、側根數減少、側根密度減少。與Col-0相比，超表達GmXTH38導致擬南芥側根形成對LP的敏感性增加；超表達GmXTH38導致擬南芥側根密度在低鐵或高鐵條件下下降程度更多，增加擬南芥主根生長對低鐵或高鐵的敏感性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大豆品種為粵春03-3 (YC03-3)，擬南芥野生型為哥倫比亞 (Columbia-0，Col-0) 生態型。

1.2 大豆GmXTH的生物信息學分析

以擬南芥XTH氨基酸序列為參考，通過BLASTP比對，在植物基因組數據庫Phytozome (http://www.phytozome.org/index.php) 中獲得大豆XTH基因編碼的氨基酸序列；基于大豆基因組序列，確定GmXTH基因的全長序列，外顯子和內含子數目，GmXTH基因上游2000 bp的核苷酸編碼序列，以及大豆、擬南芥和水稻等XTH的氨基酸序列。

在 ExPaSy (https://wed.expasy.org/protparam) 網站獲得GmXTHs的等電點、分子量；使用MEGA7.0.26(http://http//www.megasoftware.net) 構建 GmXTHs進化樹；通過MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)分析GmXTH蛋白和啟動子的基序信息，利用TBtools軟件繪圖。利用大豆基因組數據庫SoyBase (https://www.soybase.org) 分析大豆GmXTH家族基因在大豆不同組織和不同發育時期的表達模式，繪制熱圖。

1.3 大豆的低磷脅迫處理

參考文獻方法[12]，進行大豆水培和養分脅迫處理。YC03-3的種子用10% NaClO滅菌，在沙子中萌發。為了探索GmXTH38對磷鐵養分脅迫的響應，首先將大豆幼苗在完全的 Hoagland 溶液 (pH 5.9) 中培養14天。然后將具有第一片三出復葉的大豆幼苗分別轉入高磷 (HP，500 μmol/L KH2PO4)、低磷 (LP，25 μmol/L KH2PO4) 營養液中培養 14 天。大豆在遮陰網室進行培養，營養液每3 h通氣15 min，每2天更換一次營養液[12]。

1.4 實時熒光定量PCR

用perlprimer設計實時熒光定量PCR特異引物(附表1)。反應在定量 PCR 儀 (Applied Biosystems 7500，Foster City，USA) 進行，用 SYBR Green I dye(Takara Bio Inc.，Otsu，Japan) 進行分析。反應條件為：初始變性 95℃，5 min，40 個循環 (95℃ 10 s、60℃20 s、72℃ 20 s)。以看家基因GmEF1α(Glyma.17G 186600) 或AtEF1α(At1G07940) 作為內參。

附表1 載體構建及定量PCR相關引物列表Supplyment table 1 Vector construction and quantitative PCR related primers list

續附表1 Supplyment table 1 continued

1.5 GmXTH38超表達基因株系的獲得及檢測

基于重組克隆方法[13]，通過PCR將GmXTH38的開放閱讀框 (ORF) 進行擴增，將克隆片段轉入雙元載體pMDC32，然后用農桿菌GV3101對擬南芥進行花序浸泡法轉化，通過潮霉素篩選獲得單拷貝插入的轉基因材料。通過PCR進一步確定超表達GmXTH38的轉基因擬南芥。

1.6 GmXTH38啟動子活性分析

首先通過TSSP程序 (http://www.softberry.com)預測GmXTH38啟動子，然后通過PCR擴增啟動子片段 (長度為 2000 bp)。基于重組克隆方法[13]，將GmXTH38啟動子克隆轉入GUS報告基因載體pMDC162，轉化擬南芥[14]，通過潮霉素篩選獲得單拷貝插入的轉基因材料。純化的T3代植株進行GUS染色，在體視顯微鏡下觀察拍照，分析啟動子活性。

1.7 低磷、低鐵和高鐵脅迫條件下GmXTH38超表達株系根系生長分析

將酒精消毒的超表達GmXTH38株系 (#1和#2)和Col-0種子播種于1/2 MS培養基，置于4°C處理2天。然后于人工氣候培養箱進行培養，光溫周期分別為 16 h/8 h (光照/黑暗)和 22℃/20℃ (白天/黑夜)，光照強度為 100 μmol/(m2·s)，相對濕度為 70%。2天后挑選長勢一致的幼苗分別移入高磷 (HP：1.25 mmol/L KH2PO4)、低磷 (LP：0 mmol/L KH2PO4)、高鐵 (HFe: Fe-EDTA 500 μmol/L)、中鐵 (MFe: Fe-EDTA 50 μmol/L)、低鐵 (LFe: Fe-EDTA 0 μmol/L)固體培養基上，7天后測定相關指標，每個處理4個重復，HP和MFe培養基的P和Fe含量是植物正常生長需求量。根據參考文獻，本研究中擬南芥HFe培養條件視為鐵毒 (鐵過量) 處理。

1.8 數據分析

用SPSS20.0進行數據分析，計算平均值和標準誤，用Student’st-test進行差異顯著性分析；用OriginPro8繪圖。

2 結果與分析

2.1 GmXTHs家族成員理化性質分析

相對于擬南芥基因組，大豆基因組更大更復雜。為全面分析大豆XTH基因家族，我們結合兩個方法鑒定大豆XTH基因家族。方法一是通過關鍵詞PF06955 在 Phytozome 網站 (www.phytozome.org) 進行檢索，發現大豆基因組 (GlycinemaxWm82.a2.v1版本) 共有61個基因編碼XTH；方法二是以33個擬南芥XTH的氨基酸序列為種子序列，通過BLASTP程序對大豆蛋白質組進行迭代比對。基于兩種方法分析的結果，確定大豆基因組有61個XTH基因。大豆GmXTH家族成員分布在1～5號、7～20號染色體上，其中定位13號和17號染色體上的GmXTH基因數目最多，分別為9和7個。根據GmXTH在染色體上的位置，命名為GmXTH1至GmXTH61(附表2)。

通過ExPaSy網站對GmXTH蛋白進行分析，發現GmXTH分子量范圍為13.0～40.5 KDa，氨基酸數目在115～347 (附表2)；22個GmXTH的等電點小于7，其他39個XTH蛋白的等電點均大于7 (附表2)。

附表2 GmXTH家族成員基因的基本信息Supplyment table 2 Basic information of GmXTHs

續附表2 Supplyment table 2 continued

2.2 XTHs的系統進化分析

根據文獻和比對分析，發現擬南芥和水稻XTH基因家族分別有33和29個成員(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。我們利用MEAG7.0.26重建大豆、水稻和擬南芥的XTHs系統進化樹。如圖1所示，大豆、擬南芥、水稻的XTH家族可分為3個亞組；其中GmXTH38與擬南芥XTH9、XTH23位于同一亞組，GmXTH38與后兩者的氨基酸同源性分別為83.1%和63.4%。

圖1 GmXTH系統進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of GmXTH

2.3 大豆GmXTH保守基序、啟動子和蛋白質結構域分析

通過對GmXTH進行保守結構域分析，發現除GmXTH33外，其他GmXTH均含有3個基序。與GmXTH38的基序排列極為相似的有GmXTH2、12～19、30～31、36、46～48，表明這些蛋白可能具有相似的功能(圖2)。如圖2B所示，基序1～3中分別包含XTH蛋白特有的保守序列。

圖2 GmXTH蛋白基序 (A) 和保守結構域分析 (B)Fig.2 Analysis of motif (A) and conserved domain of GmXTH protein (B)

為進一步了解GmXTH的啟動子順式調控元件，我們利用MEME程序對GmXTH啟動子序列進行了保守核苷酸基序 (motif) 的分析。GmXTH的啟動子包含的基序類型相似，有3種基序類型 (Motif 1～3)，其中GmXTH9、GmXTH12、GmXTH14、GmXTH26、GmXTH29、GmXTH52均含有3種類型的基序，其余GmXTH啟動子中僅包含其中1～2種基序 (圖3)。與GmXTH38的基序排列極為相似的有GmXTH18、GmXTH34、GmXTH51，且它們僅含有1個基序。這表明可能有共同的轉錄因子結合在這些XTH啟動子元件上調控其轉錄。

圖3 GmXTH啟動子基序 (A) 和保守結構域分析 (B)Fig.3 Analysis of motif (A) and conserved domain of GmXTH promoter (B)

2.4 GmXTHs家族成員在大豆不同器官的表達水平

為了確定GmXTH基因的表達模式，我們使用公開的大豆全基因組轉錄組數據(www.soybase.org) 進行分析。如圖4所示，GmXTH基因在各器官廣泛表達，GmXTHs具有不同的組織特異性表達模式。15 個GmXTHs (XTH2、6、10、13～15、19、22、25、27、32、33、39、45、61)在根表達量較高；6 個GmXTHs (XTH13、29、32～34、55)在根瘤表達量較高。

圖4 GmXTH基因家族在不同器官的表達模式Fig.4 The expression patterns of GmXTH gene family in different organs

2.5 GmXTHs對低磷脅迫的響應

為明確GmXTHs對LP脅迫的響應，我們前期對大豆LP脅迫14天的葉進行轉錄組分析，已上傳相關數據至 NCBI (accession number：PRJNA48973)，發現GmXTHs家族中有5個基因 (GmXTH24、28、38、41和52) 對LP有較明顯的響應。本研究進一步通過定量PCR對這5個GmXTH基因響應LP脅迫進行了分析(圖5)。GmXTH24在葉的表達量顯著高于根，但GmXTH24在根葉均不受LP誘導，這與轉錄組結果不一致；GmXTH28也是在葉的表達量高于根，GmXTH28在根顯著受LP誘導，其表達量是HP(對照) 處理的 9.8倍 (P<0.01)。值得注意的是，GmXTH38在大豆根和葉都明顯受LP誘導，LP在根和葉中的相對表達量分別是HP的15.3和4.4倍；GmXTH41明顯受LP誘導，LP在根和中葉的相對表達量分別是HP的 39.1和 2.5倍 (P<0.05)；而GmXTH52僅在大豆根受LP誘導，與HP相比，LP誘導倍數高達14.2倍 (P<0.05)。后面的試驗針對GmXTH38開展。

2.6 GmXTH38啟動子活性分析

定量PCR分析已證明GmXTH38在大豆根、葉均受LP誘導 (圖5)。我們進一步分析了GmXTH38啟動子活性及其對LP的響應。GUS染色結果顯示(圖6)，HP條件下，整個擬南芥幼苗 (如葉、主根、側根) 均能觀察到GUS染色；LP條件下，地上部和地下部染色更深，范圍更大，說明GmXTH38啟動子活性受低磷促進。暗示GmXTH38可能在大豆根系響應LP脅迫方面起作用。

圖5 GmXTHs對低磷脅迫的響應Fig.5 Responses of soybean GmXTHs to low phosphorus stress

圖6 GmXTH38啟動子活性Fig.6 Promoter activity of GmXTH38

2.7 低磷條件下GmXTH38超表達對擬南芥根系生長的影響

為揭示GmXTH38的功能，我們將GmXTH38在擬南芥進行異源表達，通過半定量PCR鑒定到2個純合的超表達GmXTH38株系#1和#2 (附圖1)。因LP誘導GmXTH38在根的表達(圖5)，我們將轉基因株系進行LP處理，研究超表達GmXTH38對擬南芥根系生長的影響。

附圖1 GmXTH38過表達株系的鑒定Supplement figure 1 Identification of overexpressing GmXTH38 lines

在HP處理下，與Col-0比，超表達GmXTH38材料#1和#2的主根長分別被抑制了34.22%和37.65%(圖7a、c)；LP處理7天，#1和#2的主根長分別被抑制了30.59%和29.58% (圖7b、c)。與HP處理相比，LP處理的Col-0的主根長被抑制了50.03%，而超表達的2個株系主根長分別被抑制了47.27%和43.56% (圖 7a、b、c)。說明超表達GmXTH38降低主根生長對LP的敏感性。

與Col-0相比，超表達材料#1和#2在HP下生長7天的側根數 (包括側根原基) 顯著減少，分別被抑制了69.70%和65.15% (圖7a、d)。LP條件下Col-0、#1和#2的側根數明顯比HP條件下的多。在LP條件下，與Col-0相比，#1和#2的側根數分別被抑制了46.63%和41.01% (圖7b、d)。與HP相比，LP處理下Col-0的側根數增加了1.70倍，而#1和#2株系側根數分別增加了3.75和3.57倍 (圖7a、b、d)。

LP處理明顯增加Col-0、#1和#2的側根密度。與HP比，LP條件下Col-0的側根密度增加了4.63倍，而#1和#2株系側根密度分別增加了10.97和8.07倍 (圖7e)。這說明超表達GmXTH38增加側根形成對LP的敏感性。

圖7 低磷處理對野生型和轉基因擬南芥生長的影響Fig.7 Effects of low phosphorus treatment on the growth of wild type and transgenic Arabidopsis thaliana

2.8 GmXTH38調節擬南芥根系在低鐵和高鐵條件下的生長

基于磷營養和鐵營養之間存在密切的關系，土壤或培養介質鐵存在會降低磷的有效性。我們進一步研究了超表達GmXTH38對擬南芥根系在低鐵(LFe) 或高鐵 (HFe，鐵毒) 下生長的影響。與 MF (中鐵，對照)比，HFe條件下Col-0、#1和#2的主根長分別被抑制了31.87%、34.67% 和 42.82% (圖8 a、b、d)，LFe處理下Col-0、#1和#2的主根長分別被抑制了 66.51%、68.33% 和 73.17% (圖8 b、c、d)。這些結果表明，超量表達GmXTH38增加擬南芥主根生長對LFe或HFe的敏感性。

LFe和HFe脅迫均抑制側根形成 (圖8)。與MF相比，HFe處理下的Col-0、#1和#2側根數分別被抑制了 88.27%、90.48%、69.23% (圖 8a、b、e)，Col-0、#1和#2的側根數在LF條件下分別被抑制了74.40%、92.86%、69.23% (圖 8b、c、e)。HFe條件下，與Col-0相比，#1和#2的側根數分別被抑制63.64% 和 45.45% (圖 8e)。

與MFe比，LFe條件下Col-0、#1和#2的側根密度分別下降了62.01%、68.33%和69.58%，HFe條件下Col-0、#1和#2的側根密度分別下降了22.16%、34.67%和42.82% (圖8f)。這表明GmXTH38超量表達導致擬南芥側根形成對LFe或HFe更敏感。

3 討論

XTH是一類參與纖維素/木葡聚糖交聯的構建和重塑的酶，在調節細胞壁的伸長方面起重要作用。然而，人們對大豆中的這類酶知之甚少。本研究發現，大豆基因組含有61個XTH基因，進化分析表明GmXTH可分為3個亞組 (圖1)。大豆XTH基因數目遠高于水稻和擬南芥XTH基因數目，這可能與大豆基因組在進化過程中出現兩次基因組復制有關，也暗示大豆XTH家族的功能更復雜。

通過啟動子元件分析，發現GmXTH24、28、38、41和52都含有 G-box 元件 (CACGTG) (附表3)。G-box元件與基因轉錄響應光、激素和環境因子有關[15–16]。受低磷誘導的OsPTF1和GmPTF1的啟動子均含有G-box元件[17]，兩者都屬于bHLH型轉錄因子，調節水稻和大豆磷營養。此外，GmXTH38、41和52都含有W-box元件(附表3)。W-box元件是WRKY轉錄因子結合位點[18]。WRKY6通過結合PHO1啟動子內的兩個W-box元件負調控PHO1的表達，在低磷條件下，WRKY6抑制PHO1的轉錄[18–20]；WRKY42也可以直接結合PHO1啟動子的W-box，WRKY42與WRKY6相互作用抑制PHO1的表達[20–21]；WRKY45與PHT1(PHOSPHATETRANSPORTER1)啟動子的兩個W-box元件結合，直接上調PHT1轉錄[22]。擬南芥和水稻部分低磷響應基因啟動子中存在P1BS元件，而MYB類轉錄因子PHR1通過結合P1BS (PHR1 binding sequence)元件調控下游基因的轉錄[23]。我們發現GmXTH28和GmXTH38的啟動子含有P1BS元件。這些結果暗示，大豆bHLH、WRKY以及PHR1類轉錄因子可能調節GmXTHs的轉錄。此外，GUS分析均證實GmXTH38啟動子活性受LP誘導 (圖6)，與定量PCR結果一致 (圖5)。

附表3 五個受低磷調控基因中磷相關的啟動子元件Supplyment table 3 Five phosphorus-related promoter elements in low phosphorus-regulated genes

對GmXTH38進行同源性比對發現，它與AtXTH9相似度為83.1%，與AtXTH23相似度為63.4%。已有研究表明，XTH9超表達增加側根長度，并增加對低硝酸鹽脅迫的耐受性[24]；AtXTH19和AtXTH23的超表達促進側根的發育并增強鹽脅迫耐受性，而AtXTH23單突變和AtXTH19/AtXTH23雙突變對鹽脅迫敏感，側根較少[7]。本研究發現，超表達GmXTH38在植物正常生長養分條件下抑制主根生長和側根形成(圖7)。GmXTH38在大豆根、葉均受LP誘導(圖5)，而磷與鐵養分存在密切關系。在HP條件下，超表達GmXTH38抑制主根的生長、側根的數目和側根密度 (圖7)。但是否是抑制主根分生區活性；影響側根的起始或突破表皮等需進一步研究。另一方面，超表達GmXTH38改變擬南芥對磷缺乏的敏感性，表現為主根生長對LP的敏感性降低，而側根形成對LP的敏感性增加，側根密度增加更多 (圖7)。文獻報道，低磷抑制野生型擬南芥Col-0主根生長，增加側根密度，且依賴于生長素信號轉導途徑[25]，我們結果與此文獻一致。這是否與生長素信號途徑耦聯值得進一步研究。

值得注意的是，我們發現超表達GmXTH38導致擬南芥對鐵饑餓 (LFe)和鐵毒 (HFe)更敏感，表現為主根長和側根密度都會受到強烈的抑制(圖8)。這暗示，超表達GmXTH38會強化鐵缺乏或過量對根系生長發育的調控?；诒狙芯拷Y果，推測GmXTH38在調節磷鐵養分互作方面起作用。

圖8 不同鐵濃度處理對野生型和轉基因擬南芥生長的影響Fig.8 Effects of different iron concentrations on the growth of wild and transgenic Arabidopsis thaliana

4 結論

GmXTH38可能在根系響應低磷和鐵脅迫方面起重要作用，調節主根的生長和側根形成。超表達GmXTH38改變了擬南芥主根和側根對磷、鐵等養分脅迫的敏感性。本研究為今后揭示GmXTH調節磷、鐵養分脅迫的分子機制打下了基礎，今后需要創制大豆GmXTH相關的基因編輯材料，以便對其調節根系應答磷鐵養分脅迫的機制進行深入研究。