二甲雙胍通過LncRNA-H19抑制非小細胞肺癌A549遷移及侵襲的機制研究

劉凱 李勃 吳向天 明懷德

非小細胞肺癌占肺癌組織學亞型中的85%。肺癌轉移是影響其預后的關鍵因素之一，進一步研究轉移相關機制則有利于改善肺癌病人的預后。二甲雙胍是最常用的2型糖尿病一線治療藥物，因其具有潛在的抗癌作用越來越受到學界的關注。有研究表明，二甲雙胍與標準一線化療聯合可顯著改善非糖尿病晚期非小細胞肺癌病人的預后[1]。LncRNA參與了眾多生物學過程，包括細胞增殖和腫瘤轉移[2]。LncRNA-H19具有促進腫瘤的作用，本研究探討二甲雙胍是否通過LncRNA-H19發揮抑制非小細胞肺癌A549的作用。

材料與方法

一、材料

1. 細胞株:A549人非小細胞肺癌細胞株購于美國ATCC細胞庫。

2.細胞實驗相關試劑:DMEM細胞培養基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、100 U/ml青霉素+鏈霉素、lipofactemine3000、TRIzol試劑均購自美國Invitrogen公司；基質膠購自于康寧公司；引物合成項目購自上海生工生物工程股份有限公司；RNA反轉錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit)、real-time PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ)均購自日本Takara公司；pc-H19過表達質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

二、方法

1.細胞培養： A549人非小細胞肺癌細胞株培養于含雙抗的10% FBS的DMEM培養基中。

2.過表達質粒轉染：本研究所涉及pcH19過表達質粒由吉瑪基因設計、合成、驗證。使用Lipofactemine3000進行轉染，48 小時后進行后續實驗。

3.細胞RNA抽提及qRT -PCR ： 使用TRIzol法提取細胞RNA并檢測濃度，反轉錄為cDNA后進一步進行qRT-PCR。qRT-PCR程序使用產品說明書推薦程序。本實驗涉及引物序列如下：U6(人)，F-5'-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，R-5'-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3'；LncRNA-H19(人)，F-5'-TGCTGCACTTTACAACCACTG-3'，R-5'-ATGGTGTCTTTGATGTTGGGC-3'。以U6表達量作為內參，并使用2-△△Ct值計算靶基因的相對表達量。

4.細胞遷移及侵襲實驗：將基質膠鋪于Transwell的上層小室中，成膜后進行侵襲實驗(遷移實驗無需使用基質膠)。上層小室中加入約5×104個細胞，下層小室加入含20% FBS的完全培養基。培養48小時后取出小室，經PBS清洗、4%多聚甲醛固定后使用結晶紫染色，棉簽拭去上層未遷移細胞后顯微鏡觀察拍攝，統計各組細胞遷移、侵襲的情況。

三、統計學方法

結果

1.二甲雙胍抑制A549細胞的遷移及侵襲能力:Transwell遷移的結果與對照組結果比較見圖1A。 40 mM二甲雙胍處理A549細胞48小時可顯著抑制腫瘤細胞的遷移能力，差異有統計學意義(P<0.05)；Transwell侵襲實驗的結果與對照組比較見圖1B。 結果提示,40 mM二甲雙胍同樣可以抑制A549細胞的侵襲能力，差異有統計學意義(P<0.05)。

A:Transwell遷移的結果與對照組結果比較。B:Transwell侵襲實驗的結果與對照組結果比較注：使用Transwell實驗分別驗證二甲雙胍對于A549細胞遷移及侵襲能力的抑制作用。aP<0.05。Ctrl為對照組，進行t檢驗圖1 二甲雙胍抑制A549細胞的遷移及侵襲能力

2.二甲雙胍抑制LncRNA-H19的表達:qRT-PCR結果顯示，40 mM二甲雙胍處理48小時可以顯著抑制A549細胞中LncRNA-H19的表達量,差異有統計學意義(P<0.05)。轉染過表達載體48小時后可顯著提升A549細胞中H19的表達量，差異有統計學意義(P<0.05)，差異有統計學意義(P<0.05)。進一步使用二甲雙胍處理可以抑制H19過表達載體的作用，降低肺癌細胞系中H19的表達，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：使用qPCR分別檢測二甲雙胍抑制A549細胞內H19表達的作用、pc-H19的過表達效能以及二甲雙胍對于pc-H19過表達作用的拮抗效果。aP<0.05；bP<0.01；cP<0.001。Ctrl vs MET，Ctrl vs pc-H19，pc-H19 vs pc-H19+MET，分別進行t檢驗圖2 二甲雙胍抑制LncRNA-H19的表達

3.二甲雙胍通過LncRNA-H19抑制A549遷移及侵襲:Transwell遷移的結果與對照組結果比較見圖3A，MET可以顯著抑制A549細胞的遷移能力，差異有統計學意義(P<0.05)。而pc-H19轉染后可以顯著促進A549細胞的遷移能力(P<0.05,圖3A)，而MET可以顯著抑制過表達H19的促進腫瘤遷移的能力(P<0.05,圖3A)。Transwell侵襲實驗也得出相同趨勢的結論，即MET可能通過拮抗H19發揮抑制A549侵襲能力的作用(P<0.05,圖3B)。

注：使用Transwell實驗分別檢測過表達LncRNA-H19、過表達H19+二甲雙胍處理48小時對于A549細胞遷移能力(A)及侵襲能力(B)的影響。aP<0.01；bP<0.001；cP<0.001。使用單因素方差分析。圖3 二甲雙胍通過LncRNA-H19抑制A549遷移及侵襲

討論

本研究表明，二甲雙胍在體外實驗中具有抑制非小細胞肺癌細胞系A549遷移及侵襲的作用，可能與抑制LncRNA-H19的表達有關。二甲雙胍廣泛應用于糖尿病的臨床治療，越來越多的臨床研究支持二甲雙胍具有一定的抗癌作用。研究發現，與2型糖尿病病人相比，不合并2型糖尿病的非小細胞肺癌病人的生存率更佳[3]。研究人員進一步發現，使用二甲雙胍是非小細胞肺癌合并2型糖尿病病人具有良好預后的獨立因素之一[3]。除合并2型糖尿病的肺癌病人外，一項薈萃分析表明，二甲雙胍暴露與肺癌病人生存率提高顯著相關[4]。關于二甲雙胍抑制腫瘤、改善預后的機制研究主要集中于調節細胞凋亡和自噬，影響細胞增殖和死亡[5]，增強免疫細胞的抗癌活性[6]，抑制癌細胞的上皮-間充質轉化和轉移[7]，以及改善肺癌病人的耐藥性并提高療效[8]。這些發現均支持了二甲雙胍對非小細胞肺癌的潛在治療效果。

LncRNA-H19具有促癌作用，多種腫瘤中均表達上調。在肺癌組織中H19也呈現上調趨勢，促進肺癌細胞發生上皮-間充質轉化及轉移[9-10]。H19可通過多種途徑促進腫瘤的增殖及轉移能力，Gao等[9]發現，H19可通過調節肺癌細胞中CDH1啟動子的甲基化表達水平，調控腫瘤細胞的上皮-間充質轉化過程、增殖、腫瘤干細胞特性、抗凋亡、遷移以及侵襲能力。Liao等[10]發現，H19可促進肺癌細胞中間充質標志物(波形蛋白和N-鈣黏蛋白)的表達，降低了上皮標志物(E-鈣黏蛋白)的表達，從而增強了癌細胞的侵襲能力。另外一項薈萃分析發現，H19的多態性(rs217727和rs2839698)與肺癌發生風險增加之間存在關聯[11]，這表明H19的異常表達可促進癌癥進展。一項以中國人群為基礎的病例對照研究顯示，H19基因的4個單核苷酸多態性(rs2067051、rs217727、rs2839698和rs4929984)是中國非小細胞肺癌人群中最常見的基因型。其中rs2067051和rs217727多態性對非小細胞肺癌的易感性有潛在影響[12]。Gupta等[13]報道，從痰樣本中獲得的三個LncRNAs(SNHG1、H19和HOTAIR)被證明是診斷鱗狀細胞癌的高度敏感的生物標志物組合。這些結果均顯示了H19在肺癌發生、診斷、治療中的重要作用。這些結果進一步支持我們的發現，LncRNA-H19/β-catenin通路是二甲雙胍治療肺癌的潛在靶點之一。今后的研究將進一步深入挖掘LncRNA-H19促進非小細胞肺癌增殖及轉移的機制，發現下游相關靶基因并進一步研究二甲雙胍通過H19發揮抑癌作用的分子機制。