人源性腎癌異體移植模型的建立及分析

李錦楠 崔亮 肖旭仁 吳學杰 代曉飛 李景敏

傳統的移植瘤模型是把人體腫瘤細胞或鼠源性腫瘤細胞通過體外篩選穩定的細胞系，然后將其注射到不同程度的免疫缺陷的小鼠皮下組織或者原位從而構建穩定的移植瘤模型。連續傳代的腫瘤細胞通常無法適應外界環境，導致原代腫瘤喪失了異質性，因此不能精準判斷原始腫瘤的生物學特征[1]。目前，最準確的模型是病人來源的腫瘤異種移植物(patient derived xenografts，PDX)，將術后取下的新鮮腫瘤組織塊移植到存在免疫缺陷的小鼠上，已被證明適用于多種癌癥，包括膀胱癌，乳腺癌，胰腺癌，肺癌，結腸癌，肝癌以及黑色素瘤[2-8]。這些模型反映了原始腫瘤的異質性，在體外實驗無法重現的原位腫瘤基質間的相互作用。研究表明這樣的方法是適合在免疫缺陷的小鼠體內發展RCC PDX模型[9-10]。PDX模型的最突出的優點是保留了臨床病人腫瘤的特點：主要體現在原始腫瘤的組織學特征和病人腫瘤特有的基因組特征以及原始腫瘤的異質性，均高度保存在PDX模型移植瘤中[10]。PDX模型移植瘤也包含從臨床病人來源的腫瘤基質、免疫細胞及腫瘤生長微環境[10]。目前，PDX腫瘤模型有可能是目前具有臨床相關性較好的癌癥模型，其在預測的藥物作用平臺方面上升到了一個新的高度，能夠更加準確的概括病人治療的療效。為了分析腫瘤的生物學特點，我們以腎癌病人新鮮腎癌組織為標本來源進行移植，構建小鼠移植瘤模型，進行觀察。

材料與方法

一、材料

用于建立模型的新鮮腎癌組織手術標本來源于我院泌尿外科病人，術前診斷均為腎癌，病人編號1，65歲，男，腫瘤直徑7 cm×7 cm×5.5 cm，病理類型為腎透明細胞癌，無瘤栓，無肉眼血尿；病人編號2,29歲，女，腫瘤直徑8 cm×7 cm×6 cm，病理類型為腎實質內多形性上皮樣細胞腫瘤，無瘤栓，無肉眼血尿；病人編號3,67歲，男，腫瘤直徑2.1 cm×1.8 cm×1.5 cm，病理類型為腎透明細胞癌，無瘤栓，無肉眼血尿；病人編號4,65歲，男，腫瘤直徑5.5 cm×7 cm×5 cm，病理類型為腎透明細胞癌，有瘤栓，無肉眼血尿；病人編號5,70歲，女，腫瘤直徑3.8 ×3.5 ×3.5 cm，病理類型為腎透明細胞癌，無瘤栓，無肉眼血尿；病人編號6,60歲，男，腫瘤直徑6 cm×6 cm×4.5 cm，病理類型為腎透明細胞癌，無瘤栓，有肉眼血尿；病人編號7,61歲，男，腫瘤直徑5.8 cm×5.5 cm×5 cm，病理類型為腎透明細胞癌，無瘤栓，無肉眼血尿。術中標本切除后，立即放入0 ℃含10%的胚牛血清的DMEM培養基中，運送至實驗室，所構建的移植瘤模型腫瘤組織，術后常規病理診斷為腎癌。應用NOD-SCID小鼠：該小鼠是NOD小鼠和SCID(severe combined immunodeficiency)小鼠雜交后得到的，其中SCID小鼠是非肥胖型糖尿病或重癥聯合免疫缺陷小鼠，是在prkdcscid基因位點發生純合子基因突變形成的，T細胞和B細胞喪失基本功能，并且NOD小鼠的巨噬細胞存在功能缺陷、補體和NK細胞功能降低。本實驗所用的NOD-SCID小鼠均是在SPF條件下飼養的6～8周雌/雄小鼠。

二、方法

1、腎癌PDX NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型的建立：6～8周齡的NOD-SCID小鼠飼養在SPF級屏障環境中，適應環境不少于3天。將從手術室獲得的腎癌手術標本，放入冰浴的含10%的胎牛血清的DMEM培養基里。運送至實驗室，在超凈臺內，將冰DMEM培養基倒掉，加入無菌生理鹽水，反復洗滌3次。將所有臨床標本倒入放有無菌生理鹽水的小皿中，并將較大塊的腫瘤組織分離成體積<3 mm×3 mm×3 mm的組織碎片，并相應的去除壞死組織以及包膜等的結締組織。將組織平均分成多份，放入提前混勻的加有75 μl PBS和75 μl Matrigel基質膠的EP管中，放在冰上保存。取NOD-SCID小鼠，按照70 mg/kg的比例，采用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉的方式麻醉小鼠，碘伏消毒小鼠背部皮膚，無菌棉球擦拭干凈，用高溫高壓滅菌過的眼科組織剪開背部皮膚，切口約0.4～0.5 cm，使用組織鉗鈍性剝離皮下組織，用移液器抽出150 μl含有Matrigel的組織塊注入皮下組織，用5/0絲線縫合傷口，碘伏消毒。重復上述做法分別接種于背部左上、左下、右上、右下4個位置。術后放回籠中待蘇醒。定期觀察小鼠傷口的恢復情況、精神、活動、毛發及飲食情況等；觀察并記錄局部皮下移植瘤體積、成瘤時間、成瘤概率、存活和死亡率。最后處死小鼠取出移植瘤，觀察其外觀、大小，并分別作常規病理切片HE染色，觀察腫瘤組織的形態學特征。

2、腎癌PDX NOD-SCID小鼠原位腎包膜下移植瘤模型的建立：術前準備及麻醉同方法1，于小鼠背部中段剪開一約2 cm切口，鈍性分開皮下組織，尋找到脊柱中下段，用眼科剪打開小鼠腹腔，在肝臟靠脊柱內側尋找腎臟，并完整暴露腎臟，用20 G套管針行腎包膜下穿刺，注意輕柔，誤損傷腎實質，用無齒眼科鑷從破口處將腎包膜提起，將小塊腫瘤組織利用另一把眼科鑷輕輕放入包膜下，并向上推至包膜完整部位，需注意小鼠腎臟較脆，易出血損傷，操作需輕柔。腎臟還原原位，用5-0絲線連續縫合腹壁，再用5-0絲線單純間斷縫合皮膚，將傷口表面血漬用碘伏擦凈，放入籠中等待蘇醒。

結果

1、小鼠荷瘤生長情況及成瘤潛伏期：腎癌標本移植后成瘤潛伏期分別為74天，86天，65天，58天，53天及47天，平均約63.83天，于種植部位可捫及花生粒大小的腫瘤，皮下活動度小，呈紅色，質地稍硬呈實體腫塊，隨后腫瘤體積逐漸增大，小鼠出現程度不等的消瘦、活動度減弱等惡病質情況。

2、小鼠腫瘤生長速度及成瘤率：臨床病人腎癌活體標本在經過處理后，在NOD-SCID小鼠皮下行原代移植，每例臨床標本移植2只小鼠，共14只。結果，6只小鼠成功移植，分別來自6例不同的臨床病人。因此，原代小鼠的移植成瘤率為42.86%。計算相對腫瘤體積(相對腫瘤體積=0.52×長徑×短徑2)。見表1。

表1 移植瘤生長體積變化(mm3)

3、小鼠移植瘤病理學檢查：將所有成瘤小鼠做常規病理切片，HE染色，可觀察到除3號小鼠屬于瘤樣增生外，其他人腎癌移植瘤均可看到腎臟透明細胞癌的特征。見圖1～3。

結節內可見邊緣處為腫瘤細胞密集似有排列，鮮見核分裂相。瘤樣增生可能性大圖1 移植腫瘤組織(HE×100)

可見腫瘤局部區域為腫瘤細胞部分有排列，鮮見核分裂相。屬于高分化腎透明細胞癌圖2 移植腫瘤組織(HE×100)

腫瘤結節內可見邊緣處有癌細胞密集，可見核分裂相。癌結節中心可見大片的紅染壞死區域，多為崩解碎裂的腫瘤細胞。屬于低分化腎透明細胞癌。圖3 移植腫瘤組織(HE×100)

討論

腎癌發病率約為全身惡性腫瘤發病率的2%～3%[11]，男性發病率是女性的2倍，其中80%以上是來源于近曲小管的透明細胞癌，并以每年2%的比例遞增[12]。手術切除是臨床上最常見的治療方式。臨床上一些局部進展期的腎癌并不少見，約20%～30%病人明確診斷腎癌時已發生淋巴結轉移和腎靜脈甚至腔靜脈癌栓形成，此類病人術后多預后不良，仍有20%～30%病人3年內出現復發及轉移，大大降低了病人的生存時間及生存率[13]。傳統的放化療對腎癌治療不敏感，特別是手術無法切除的晚期腎癌病人，預后較差[14]。

但目前從成功治療荷瘤動物模型到應用于臨床腫瘤治療的轉化過程中，平均成功率不足8%[18]。影響轉化率的最主要的原因是：傳統的移植瘤模型是把人體腫瘤細胞或鼠源性腫瘤細胞通過體外篩選，并通過細胞傳代培養獲得穩定的細胞系，然后將其注射到不同程度的免疫缺陷的小鼠皮下組織或者原位從而構建穩定的移植瘤模型。在建構移植瘤模型時，連續傳代的腫瘤細胞一般不能適應外界環境，從而喪失了原代腫瘤的異質性，不能反應原始腫瘤的生物學特征[1]。用于單一細胞株上的抗腫瘤療法難以轉化到復雜多變的臨床病人中。

隨著精準醫療的提出與興起，對于疾病個性化治療的模式成為熱點，PDX模型具有無可替代的優點，它是把病人術后的活體腫瘤組織移植到不同成度免疫缺陷的小鼠上，得到人源性腫瘤異種移植小鼠。

根據不同腫瘤類型，研究的問題不同，以及預期的結果不同，重要的是選擇一個準確PDX模型。當選擇合適的免疫缺陷小鼠時需要考慮以下幾個因素，包括背景特征(如腫瘤的移植敏感性)，內源性免疫功能(如B或T細胞的存在)，繁殖能力，壽命和遺傳特征。

本研究選用6～8周雌/雄NOD-SCID小鼠進行實驗，NOD/SCID小鼠是NOD小鼠和prkdcscid基因位點發生純合子基因突變的SCID小鼠雜交后得到的，其中SCID小鼠T細胞和B細胞喪失基本功能，NOD小鼠的巨噬細胞存在功能缺陷、補體和NK細胞功能降低。因此此種小鼠的腫瘤移植成活率較裸鼠要高。

在腎癌PDX模型的制作方法上，本實驗選用了兩種腫瘤移植方法：皮下移植及腎包膜下移植。皮下移植的PDX模型已經廣泛開展，由于其簡單的步驟及腫瘤大小的容易測量，適用于對PDX模型的大量擴增。原位移植模型是表現出更加相似于臨床病人腫瘤的生物學行為，尤其是在腫瘤發生、發展、轉移等方面，表現出了極大的相似性。但對于不同腫瘤的PDX模型而言，需要有訓練有素的外科手術技能相支持。

本研究所構建成功的腎癌PDX模型中，移植瘤與臨床病人術后腎癌病理檢查有相似的組織學特征，腫瘤細胞部分有排列且腫瘤呈實質狀，細胞胞體較大，胞膜清晰，胞漿較寬且透明、胞核大小不一，可見核分裂相。根據病人病理類型不同以及相同病理類型的腫瘤分化程度不一，相對應的PDX模型的移植瘤的病理結果也不同，可見2號病人腫瘤病理類型為腎實質內多形性上皮樣細胞腫瘤，PDX模型移植瘤病理為瘤樣增生。其余臨床病人的病理結果均為腎臟的透明細胞癌，腎癌PDX模型移植瘤的病理結果也為不同分化程度的腎透明細胞癌。因此，說明腎癌PDX移植瘤在其發生發展的過程中，保留了病人原始腫瘤的組織學特性以及生物學特性，同時也保留了不同病人間腫瘤的異質性。