寧夏老齡枸杞園撂荒過程中土壤理化性質和細菌群落變化特征

韓新寧，張 慧，張俊華，王 芳，李 明

（1.寧夏師范學院化學化工學院，寧夏 固原 756000；2.寧夏師范學院數學與計算機科學學院，寧夏 固原 756000；3.寧夏大學生態環境學院，銀川 750021；4.寧夏大學地理科學與規劃學院，銀川 750021；5.寧夏大學食品與葡萄酒學院，銀川 750021）

0 引 言

寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）是寧夏的支柱產業之一。隨著種植年限的延長，枸杞園土壤有機質和養分含量先增加后減少，約9年時肥力質量最高，然后開始退化[1]，微生物多樣性逐漸降低、數量減少[2,3]，對根系生物活性的毒害作用增大[4]；約12年后枸杞品質和產量顯著下降，一般植株砍伐后改種其他作物，但棄耕現象也時有發生。農田棄耕撂荒是一種生態系統的自然恢復措施，對不同恢復階段土壤肥力和微生物群落進行研究，能夠及時了解土壤質量變化趨勢，改進土壤管理措施，有助于土壤資源的可持續利用[5]。

土壤類型、撂荒年限及土壤深度對土壤理化性狀和微生物群落影響都較大[6,7]。如川中丘陵區耕地撂荒后土壤砂粒增加，粉粒減少；撂荒后土壤有機碳、全鉀、堿解氮略有增加，全氮顯著增加，C/P 和N/P 極顯著升高，而全磷、有效磷、速效鉀和C/N 顯著降低[8]。昆明東北部的耕地撂荒后土壤全氮增加61.5%，而堿解氮增幅并不顯著；隨著撂荒年限的增加，20～40 cm 有機質、全氮、全磷波動中呈現上升趨勢；土壤酶活性則表現為表層高于下層[9]。Nyamadzawo等[10]和Datta等[11]都發現撂荒后土壤碳含量和有機碳儲量在表層顯著提高，但隨著深度的增加逐漸降低[12]。Hepp 等[13]和Meyer 等[14]指出撂荒4年及更長時間后土壤總有機碳和易氧化有機碳含量呈下降趨勢。黃土高原撂荒地有機碳、全氮、MBC、MBN、全FAME、真菌、細菌和G-含量均高于農用地，有助于改善該地區土壤微生物特性[15]。微生物群落物種豐富度在撂荒前15年呈上升趨勢，之后迅速下降[6]。目前，關于耕地撂荒的環境效應是積極還是消極，一直存在爭論[16]。

雖然目前寧夏老齡枸杞園撂荒現象并不普遍，但已有增加趨勢，而關于撂荒對土壤質量的影響卻鮮見報道。為此，本研究系統探究了寧夏老齡枸杞園不同撂荒年限土壤理化性質和細菌群落組成及多樣性變化趨勢，然后分析了二者的相互關系，旨在為撂荒枸杞園土壤質量演變、復耕和綜合治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

寧夏中衛市中寧縣（105°26ˊ～106°7ˊE，37°09ˊ～37°50ˊN）是寧夏枸杞品質最好、種植面積最大的地區。選擇該縣種植12年以上的老齡枸杞園5 處，2017年還在采摘中，但由于枸杞品質和產量嚴重下降，從2018年開始同時被農戶棄耕撂荒（撂荒后枸杞植株均沒挖走，但大多已逐漸枯死，園內也沒有任何水、肥、藥管理，雜草叢生）。本研究于2017-2021年7月底連續5年（分別表示撂荒前對照、撂荒第1年、第2年、第3年和第4年，編號分別為CK、A1、A2、A3和A4）在距離枸杞植株冠層正下方采集0～20 和20～40 cm 土壤樣品（D1 和D2）。每個土樣均選擇在5 棵枸杞植株下采集，相同土層混勻后保留1.0 kg立即封口并放入保溫箱帶回實驗室。土樣剔除雜質后，測定含水量，并將剩余樣品分為兩份，一份-20 ℃保藏，用于土壤微生物群落的測定，另一份風干后測定土壤基本理化性質指標。

1.2 土壤基本理化性質測定方法

土壤含水量—烘干法；pH值—酸度計法；全鹽—質量法；有機質—外加熱法；全氮—凱氏定氮法；堿解氮—堿解擴散法；速效磷—Oslen 法；速效鉀—乙酸銨提取-火焰光度計法；銨態氮—蒸餾法；硝態氮—紫外分光光度法。

1.3 微生物測定方法

土壤DNA提取。采用Power soil DNA Isolation Kit 土壤微生物總DNA 提取試劑盒提取土壤細菌總DNA。提取后的DNA 產物經瓊脂糖凝膠電泳后進行檢測，合格DNA 稀釋至1 ng/L 保存于-80 ℃用于PCR擴增。

PCR 擴增及測序。細菌核糖體編碼基因相應區段的擴增及測序服務由北京諾禾致源生物信息公司完成。土壤DNA 提取完成后，進行16S rDNA 的V4 區擴增，所用引物為515F/806R （5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。高通量測序由諾禾致源Illumina HiSeq 2500 平臺運行，最后所測得數據在250～300 bp 之間產生。

1.4 數據統計分析

數據分析采用Excel、SPSS 20.0 和CANOCO 4.5 軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 撂荒枸杞園土壤基本理化性狀

與撂荒前相比，枸杞園撂荒后0～40 cm 土層含水量普遍顯著增加（表1）；含鹽量、全氮、NH4+-N和NO3--N含量均顯著下降。撂荒第4年表層土壤含水量、有機質和堿解氮比對照土壤分別增加18.55%、23.70%和60.15%，而含鹽量、全氮、速效磷、NH4+-N 和NO3--N 分別降低68.70%、47.78%、30.94%、34.34%和91.50%。隨著撂荒年限的增加，0～20 cm 土層有機質、堿解氮和速效磷含量整體顯著增加，全氮則逐漸減少；pH、全鹽、速效鉀、NH4+-N 和NO3--N 含量變化無規律；20～40 cm土層各理化指標變化也無明顯規律。

表1 不同撂荒年限枸杞園土壤基本理化指標變化情況Tab.1 Soil physicochemical properties at different abandoned ages in Lycium barbarum L.old orchard

2.2 撂荒枸杞園土壤微生物群落多樣性

撂荒第1年枸杞園0～20 cm 土壤Richness、Shannon、Chao1 和ACE 都小于撂荒前（表2），但20～40 cm 各指標均顯著高于撂荒前（除Shannon未達顯著水平）。從撂荒第1年到第3年，表層土壤Richness、Shannon、Chao1 和ACE 均逐漸增大，且除Shannon外增幅都達顯著水平，第4年時又有所降低，各指數水平與撂荒第2年相當。在20～40 cm 土層，撂荒第2年到第4年，土壤Richness、Shannon、Chao1 和ACE 均逐漸增大，其中Richness、Chao1 和ACE 增幅均達顯著水平。所以，在老齡枸杞園撂荒過程中，細菌多樣性指數有增大趨勢，但表層與表下層變化規律不盡相同。

表2 不同撂荒年限枸杞園土壤細菌群落多樣性指數Tab.2 Characteristics of diversity of soil bacterial communities at different abandoned ages

2.3 撂荒枸杞園土壤細菌群落組成

在門水平上，枸杞園0～40 cm 土層撂荒前后土壤相對豐度最高的3 個優勢菌門依次均為Proteobacteria、unidentified_Bacteria 和Acidobacteriota（圖1）。在相對豐度較高的前10 個菌門中，與對照相比，撂荒園Proteobacteria、Acidobacteriota和Nanoarchaeota 相對豐度分別增加15.19%、28.38% 和53.11%，但Bacteroidota、Actinobacteriota 和Cyanobacteria 相對豐度分別減少26.72%、40.09%和46.13%。撂荒園土壤中，不同土層優勢菌門相對豐度差異也較大：0～20 cm 土層Proteobacteria、Bacteroidota 和Actinobacteriota 分別比20～40 cm高25.26%、160.37%和32.02%，而Chloroflexi、Crenarchaeota和Nanoarchaeota 比20～40 cm 低31.88%、74.03% 和74.00%。隨撂荒年限的增加，表層Proteobacteria、Actinobacteriota 相對豐度逐漸增大，unidentified_Bacteria、Acidobacteriota則有逐漸減小的趨勢。

圖1 撂荒枸杞園土壤細菌優勢菌門相對豐度Fig.1 Relative abundances of dominant bacteria at phylum level in soil at different abandoned ages

2.4 撂荒枸杞園土壤細菌群落結構組成分析

通過高通量測序，對數量在前30 位的屬做熱圖進行分析（圖2）。撂荒后土壤優勢菌屬為MND1、Sphingomonas、RB41、Pseudomonas 和Nitrosarchaeum 等，撂荒前土壤優勢菌屬為Pseudomonas、MND1、RB41、Nitrosarchaeum 和Sphingomonas等。與撂荒前相比，撂荒后土壤Hymenobacter、Limnobacter、Cavicella、Polaromonas、Luteolibacter、Planococcus、Nafulsella、Brevundimonas、Devosia、Massilia 和Sphingomonas 數量分別增加了13.18、8.97、6.24、4.02、3.42、2.69、2.25、2.11、2.02、1.28 和0.99 倍，增幅均達極顯著水平，而Candidatus_Methylomirabilis、Flavisolibacter、unidentified_Chloroplast、Pseudomonas、Sphingobacterium、Salinimicrobium、Pontibacter和Lysobacter 分別降低了91.37%、72.98%、64.79%、59.24%、53.94%、44.23%、42.64%和37.17%。雖然撂荒后0～20 cm 土層和20～40 cm 土層數量最多的3 個屬都是Sphingomonas、RB41 和MND1，但0～20 cm 土層Sphingomonas 比20～40 cm 高84.16%，而RB41和MND1則低了25.04%和25.82%。

圖2 不同撂荒年限土壤屬水平優勢細菌相對豐度Fig.2 The relative percentages of the bacterial genus in soil at different abandoned ages

2.5 撂荒枸杞園土壤微生物群落結構主成分分析

主坐標分析（PCoA）是一種常用的數據降維方法，可反映各個樣本群落組成的相似性或差異性。樣本間距離越小，細菌群落組成的相似度越高；反之，細菌群落組成的差異性越大[17]。由圖3可以看出，撂荒前和撂荒第1年的土壤與撂荒2～4年的土壤細菌群落結構差異較大，表層微生物群落結構間差異大于表下層。

圖3 不同撂荒年限土壤細菌群落主坐標分析Fig.3 Principal coordinates analysis of bacteria communities structures of soil at different abandoned ages

2.6 撂荒枸杞園土壤基本理化性質與微生物群落的關系

Pearson 相關分析表明（表3），土壤含鹽量、全氮和NO3--N 含量與撂荒枸杞園土壤細菌群落多樣性指標關系較密切，且多樣性指數普遍與這3個指標呈顯著或極顯著負相關關系。在10 個優勢菌門中，除unidentified_Bacteria 和Firmicutes和各理化指標關系較差外，其他8種優勢菌門與其普遍有較強的相關性，其中，Cyanobacteria、Bacteroidota、Proteobacteria、Actinobacteriota 與土壤養分呈極顯著正相關關系，而Crenarchaeota、Acidobacteriota、Chloroflexi、Nanoarchaeota 與養分普遍呈顯著或及顯著負相關關系；Cyanobacteria、Bacteroidota 與土壤含水率、pH 均呈顯著或極顯著負相關；Acidobacteriota 與pH 和全鹽呈極顯著負相關，而Actinobacteriota則與這兩個指標呈極顯著正相關關系。

3 討 論

3.1 撂荒枸杞園土壤基本理化性質變化

連作常造成土壤養分失衡、微生物多樣性下降[18]。老齡枸杞園由于枸杞產量和品質嚴重下降，故被棄耕撂荒。隨著撂荒年限的增加，枸杞根系逐漸死亡，自然植被大量生長，每年都有較多枯落物進入土壤，經微生物分解后逐漸轉化為有機質和養分[19]，所以表層土壤有機質、堿解氮、速效磷逐漸增加。Yang 等[20]研究指出，短期撂荒能顯著提高表層土壤總有機碳含量，而較深土層的碳固持能力會變弱，與本研究結論一致。隨著撂荒年限的增加，土壤全氮含量逐漸降低，可能是因為枸杞園撂荒前每年都施用較多氮肥，在撂荒前期還有部分未被枸杞植株和其他植物吸收利用，所以全氮含量較高，撂荒后不再施肥，枯落物和死亡根系增加的氮不足以支持植物的吸收利用，故全氮含量逐漸降低。同時，研究區土壤為砂質壤土，氮在土壤中的轉化和移動性較強，土壤中的氮可能隨著雨水流失或通過反硝化作用轉化損失到空氣中[21]。土壤NH4+-N 和NO3--N 是植物吸收利用的主要氮形態，隨著撂荒年限的增加，NH4+-N 和NO3--N 呈非線性變化，與以往研究一致[22]。

3.2 撂荒枸杞園土壤細菌多樣性與組成變化

由于退耕第1年枸杞園耕作施肥等管理措施才停止，當時土壤退化較嚴重，短期內還未得到明顯恢復，所以撂荒第1年土壤細菌多樣性指數仍較低。此后，伴隨大量草本植物入侵，根系分泌物增多，增加了土壤中有機質和養分的含量，為利用這些物質的細菌群落代謝和合成提供了養分來源，直接或間接促進微生物群落多樣性發展[19,23]，所以土壤細菌多樣性指數逐漸增大。到撂荒第4年時，適應性強的草本植物逐漸變為優勢種群，其他植物逐漸消失，植物群落多樣性減少，間接引起表層土壤中細菌群落多樣性減小，但表下層受根系分布、土壤溫度、濕度、呼吸等因素的影響，對植物群落的變化反饋較慢[24]，故表下層土壤多樣性指數仍高于撂荒第3年。本研究土壤Proteobacteria 和Acidobacteriota 的相對豐度表現為撂荒初期高于撂荒后期，這可能與Proteobacteria 和Acidobacteriota屬于寡營養型反硝化微生物有關，它們在養分有效性較低的環境中反而具有較高的相對豐度[25]；而Chloroflexi 和Actinomycetes 屬于富營養型反硝化細菌門[26]，處于撂荒后期群落具有充足的有效養分，因此撂荒后期相對豐度較高。撂荒第2年Sphingomonas 和Lysobacter 數量較第1年急劇增加，但Bacillus 急劇減少。以往研究表明，Sphingomonas 能促進芳香族化合物的降解，對于保護環境具有潛在的應用價值[27]，Hymenobacter 嚴格耗氧，具有多種植物促生特性[28]，撂荒后這兩種屬的數量顯著增加，說明撂荒后土壤呼吸顯著增強[25,29]；撂荒土壤Limnobacter 和Cavicella 數量比對照高8.97 倍和6.24倍，這兩種屬都是有機污染物降解菌/多環芳烴（PAHs）降解菌[28,30]；Bacillusa 具有較高的抗逆性，能夠在環境惡劣的條件下存活[23]，撂荒第2年后土壤有機質和養分都逐漸增加，土壤環境逐步改善，所以Bacillus 減少，這都是撂荒能夠逐漸提升地力的證據。

3.3 枸杞園撂荒過程中土壤理化性質與細菌群落的關系

土壤理化性質是土壤細菌群落結構組成門變化的主要影響因子[31]。Tajik 等[32]開展了伊朗北部森林生態系統中土壤理化性質與土壤微生物之間的關系研究，結果表明土壤有機質、pH值、電導率和全氮均會對土壤微生物適宜習性有顯著影響。本研究中，土壤水分、pH 與Cyanobacteria、Bacteroidota、Acidobacteriota 和Actinobacteriota 呈顯著或極顯著相關關系，說明pH 是影響土壤細菌組成的關鍵因子[31]。在已有報道中，Proteobacteria 被認為與碳利用有關，是世界上最為普遍的菌門[31]，Acidobacteriota 與土壤養分有較強相關性[33]，本研究也證實了這些結論。Lauber 等[34]研究指出酸性土壤Bacteroidota與土壤pH 呈顯著正相關，而本研究結果顯示Bacteroidota 與pH 呈顯著負相關，這是由于研究區土壤屬于堿化土壤，與李晶晶和續勇波[35]等在堿化土壤上的結論一致。Na 等[36]等研究發現，土壤有效磷含量是影響連作枸杞非根際土壤細菌群落的主要因素，本研究中多個優勢菌門與有效磷都呈極顯著相關關系，說明土壤有效磷對撂荒枸杞園土壤細菌群落也有顯著影響[37]。整體來講，在本研究土壤理化性狀中，全氮、含水率、速效磷、速效鉀、NO3--N 與細菌群落相關性更強。說明枸杞園撂荒過程中對土壤細菌群落而言，土壤水分和養分是其主控因素。

4 結 論

（1）枸杞園撂荒能夠顯著增加0～40 cm 土層含水量、有機質和堿解氮含量，降低含鹽量、全氮、NH4+-N 和NO3--N 含量。撂荒年限越長，0～20 cm 土層有機質、堿解氮、速效磷含量越高，全氮含量越低。

（2）撂荒前3年，表層土壤細菌多樣性指數逐漸增大。撂荒后土壤優勢菌門 Proteobacteria、Acidobacteriota 和Nanoarchaeota 相對豐度分別比撂荒前增加15.19%、28.38%和53.11%，Bacteroidota、Actinobacteriota 和Cyanobacteria 相對豐度分別減少26.72%、40.09%和46.13%。不同撂荒年限、不同土層優勢菌門相對豐度差異也較大。

（3）在屬水平上，與對照相比，撂荒園土壤有益菌Hymenobacter、Limnobacter 和Cavicella 數量顯著增加，而Candidatus_Methylomirabilis 和病原菌Flavisolibacter 等顯著降低，說明撂荒后土壤細菌群落向著有益菌數量增多、病原菌數量減少的良好態勢變化。

（4）寧夏老齡枸杞園在撂荒過程中土壤全氮、含水量、速效磷、速效鉀和NO3--N 與土壤細菌群落多樣性及優勢菌門相對豐度相關性較強。