鹽度對籠目海帶配子體生長發育的影響

陳書秀 孫娟 李霞 趙楠 史良 李曉捷

(山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術研究中心，山東省海藻與海參技術創新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術重點實驗室，山東煙臺 264003)

籠目海帶(Saccharinasculpera)又稱厚葉切氏海帶、厚葉解曼藻，隸屬于褐藻門、褐藻綱、海帶目、海帶科，其營養豐富，是海帶中的優勢品種。該藻體內含有優質巖藻聚糖硫酸酯、褐藻膠等各種活性成分，其酶解產物或水提物又含有各種次級代謝產物和揮發性風味物質[1]。根據這些活性成分，可以研發各類保健類食品、醫藥產品等[2-3]。因此，籠目海帶的市場需求日益增大。近年來，有關籠目海帶的報道主要針對其黏性多糖的性質、褐藻膠的提取方法以及多糖的生物活性的研究等方面[4-12]，對于籠目海帶養殖育苗方面的研究較少[13-14]。利用配子體進行育苗是推進籠目海帶大規模育苗及海上養殖的新技術工藝，其中配子體的快速同步促熟是該工藝的關鍵技術。陳書秀等[13-14]研究發現，籠目海帶配子體發育的最適溫度為8～12 ℃，在光照強度20 μmol·m-2s-1下，20L(光照)∶4D(黑暗)的光照周期對配子體發育最有利。

除了溫度、光照、營養鹽等環境因子以外，鹽度也對海藻生長、發育及繁殖起著重要作用。當海藻處于鹽分逆境時，海藻的生長受阻，其光合生理作用也會受到影響。如在低鹽度條件下，壇紫菜(Porphyrahaitanensis)和裂片石莼(Ulvafasciata)的有效光化學速率和光合放氧速率均受到顯著影響[15-16]。劉萌萌等[17]研究表明，鹽度達到15后穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)生長停滯，藻體逐漸死亡。宋新丹等[18]研究發現，鹽脅迫逆境會顯著影響羊棲菜(Sargassumfusiforme)幼體的光合放氧能力。另外，鹽度對海藻的游孢子附著或配子體萌發等有顯著影響，萱藻(Scytosiphonlomentaria)孢子附著的最適鹽度為30，鹽度過低(≤24)或過高(≥40)都會造成孢子死亡[19]?？资?UlvapertusaKjellm)在鹽度20和25的條件下最有利于其體細胞轉化成繁殖細胞，而在鹽度5的條件下體細胞僅有少數繼續發育[20]。

本研究以籠目海帶雌、雄配子體為試驗材料，通過顯微觀察配子體的生長發育狀態，計算配子體發育率等，探究不同鹽度對籠目海帶配子體生長發育的影響，旨在探索有利于籠目海帶配子體發育的最適鹽度條件，為籠目海帶配子體規?；瘮U增培養及育苗提供數據參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及培養條件

試驗用海帶配子體為籠目海帶。取適量的雌、雄配子體分別用孔徑50 μm(300目)篩絹過濾，獲得2～5個細胞的細胞段懸濁液。然后按照雌、雄質量比2∶1混合均勻，取10 mL懸濁液加入直徑12 cm的培養皿中，在不同的溫度下進行培養，光周期為10L∶14D，光照強度為20 μmol·m-2s-1。在不同鹽度的海水中添加NaNO3、KH2PO4、檸檬酸鐵作為培養液，培養液中總有效氮為10 mg/L，有效磷為1 mg/L，有效鐵為0.05 mg/L。采用海水素配制鹽度分別為15、20、25、30、35、40、45的海水，每個處理組設3個重復，每3 d鏡檢觀察并更換培養液，培養周期為30 d。

1.2 配子體生長、發育指標的測定

在顯微鏡下觀察配子體的生長發育狀態，每3 d拍照1次，試驗周期為30 d。

配子體發育率的計算：每個培養皿隨機觀察10個100×視野，分別統計卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細胞數，發育率(%)=100×(卵囊形成數+排卵數+孢子體數)/總細胞數。

1.3 數據處理

用SPSS 19.0軟件對發育率數據進行單因子方差分析和多重比較分析，設P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。采用EXCEL軟件作圖。

2 結果

2.1 不同鹽度對籠目海帶配子體細胞形態的影響

當鹽度為45時，籠目海帶配子體克隆系僅進行營養生長而不進行發育，整個試驗觀察期內均無卵囊形成，其外觀形態變化見圖1-a～c。在鹽度20～35的條件下，15 d后，約有3%的雌配子體發育為成熟的卵囊(見圖1-d)；15～28 d，大部分配子體萌發成為成熟卵囊、排卵并形成幼苗(見圖1-e～f)。

a.打碎后的雌配子體；b.雌配子體營養生長初期；c.雌配子體營養生長后期；d.雌配子體卵囊形成；e.雌配子體排卵；f.幼孢子早期形態。圖1 籠目海帶雌配子體生長發育過程

第28天時，不同鹽度下籠目海帶配子體生長發育狀態見圖2。當鹽度為45時，隨著培養時間的延長，籠目海帶配子體細胞段分支顏色加深，細胞質分布均勻，細胞段數目增多，配子體的細胞數量顯著高于其他各組(見圖2-g)；鹽度40處理組與鹽度45處理組沒有顯著差異，僅在第28天時觀察發現有極少量的孢子體(見圖2-f)；在鹽度為20、25和30的條件下，配子體發育率在60%～80%，其中50%左右為多細胞孢子體(見圖2-b～d)；鹽度35處理組最終的卵囊形成率、排卵率及小苗率顯著低于鹽度20～30處理組(見圖2-e)；而鹽度15處理組的配子體細胞膨大呈球形，后期大量死亡，極少數的存活細胞生長極度緩慢且不進行發育(見圖2-a)。

a.鹽度15；b.鹽度20；c.鹽度25；d.鹽度30；e.鹽度35；f.鹽度40；g.鹽度45。圖2 不同鹽度下籠目海帶配子體生長發育狀態(第28天)

2.2 不同鹽度對籠目海帶配子體由營養生長轉向發育生殖的影響

在海帶配子體發育成幼苗的過程中，雌配子體卵囊形成、排卵和幼苗出現時的形態變化明顯，易于觀察和統計，因此選擇發育率，即卵囊形成數、排卵數和幼孢子體數之和占總細胞數的百分比作為衡量海帶配子體發育的指標[21]。

不同鹽度、培養天數對籠目海帶配子體發育的方差分析結果見表1。由表1可以看出，鹽度(P<0.001)、培養天數(P<0.001)及二者交互作用(P<0.001)對籠目海帶配子體的發育均有極顯著的影響。第1行校正模型中的F=88.479，P<0.001，表明所用模型有統計學意義。鹽度的偏Eta2(0.952)>(培養天數×鹽度)的偏Eta2(0.933)>培養天數的偏Eta2(0.906)，表明這3個因素對籠目海帶發育的影響效應為：鹽度>培養天數×鹽度>培養天數。

表1 不同鹽度、培養天數對籠目海帶配子體發育的方差分析結果

不同鹽度條件下籠目海帶的發育情況見表2。配子體發育培養第15天，在鹽度20～35處理組發現有卵囊形成并排卵，其他鹽度處理組的配子體均處于營養生長。鹽度15、45處理組在整個培養周期中均未見配子體發育，鹽度40處理組僅在第28天觀察到少量的孢子體。多重比較結果表明，在整個培養周期中，鹽度對籠目海帶配子體發育率有顯著的影響(P<0.05)(見表3)。從第19天開始，鹽度20～30處理組的發育率顯著高于其他各組(P<0.05)。第28天，鹽度25、30處理組的最終發育率為79.26%、71.36%，鹽度20處理組的最終發育率為58.87%(見表3)。

表2 不同鹽度條件下籠目海帶的發育情況 單位：%

表3 鹽度對籠目海帶配子體發育率的影響 單位：%

綜上所述，在鹽度20～35條件下，籠目海帶配子體均可正常發育。從最終發育率及幼孢子體存活率情況可見，最適于籠目海帶配子體發育的鹽度為25～30，適當降低海水鹽度有利于促進配子體由營養生長轉向發育生殖。高鹽度(35～45)更有利于配子體的營養生長，但對籠目海帶配子體的發育會產生抑制作用。

3 討論

鹽度作為海水介質的重要參數，對海藻生長、發育及繁殖起到重要作用。近幾年，有關鹽度變化對大型海藻生長影響的研究主要集中在成熟藻體，在海藻早期發育階段如游孢子或配子萌發等的研究較少。本試驗以籠目海帶配子體為材料，研究了不同鹽度對其配子體發育的影響，結果表明，在鹽度20～30條件下，籠目海帶配子體大部分(60%～80%)進入了生殖生長狀態，且其中50%以上為多細胞孢子體。在鹽度35的條件下，大部分籠目海帶配子體(80%～90%)維持在營養生長狀態，雖然小部分配子體(7.30%)進入了生殖生長狀態，但生殖生長明顯滯后于鹽度20～30處理組。在鹽度40和45條件下，所有海帶配子體維持在營養生長狀態。此結果與孔石莼[20]、寬礁膜[22]等海藻的早期發育條件相似。王帥[20]研究表明，孔石莼在低鹽度(鹽度5)條件下，其體細胞僅有少數繼續發育成繁殖細胞；鹽度在10～25的條件下對孔石莼體細胞成熟有一定的促進作用，其中鹽度為20和25時最有利于孔石莼體細胞轉化成繁殖細胞。王惠[22]研究表明，在低鹽度(鹽度10)條件下，寬礁膜游孢子不能正常萌發，在高鹽度(鹽度40)條件下，游孢子大部分處于休眠狀態，只完成細胞增大，不分裂。

本研究中，不同鹽度下籠目海帶最終發育率及幼孢子體存活率的結果表明，最適合于籠目海帶配子體發育的鹽度為25～30，適當降低鹽度有利于促進配子體由營養生長轉向發育生殖。高鹽度(35～45)更有利于配子體的營養生長，但會對籠目海帶配子體發育產生抑制作用。因此，在籠目海帶配子體培養過程中，可以通過鹽度的變化來調控配子體的生長發育。