蛇床子素聯合 TRAIL 誘導人卵巢癌細胞的凋亡及其相關機制

司麗慧，林瑞新，吳乙時，李佳慧，崔君澤，楊淑莉*

(吉林大學第二醫院 1.婦產科；2.肝膽胰外科，吉林 長春130041)

卵巢癌是婦科病癥中致死率處于首位的惡性腫瘤，以上皮性癌最為多見，占比近70%[1]。針對此類疾病的治療，目前首選治療方案為手術聯合足療程化療，但在治療過程中患者易出現耐藥性，從而引發劇烈毒副反應，故應用極大受限[2]。對此，生物治療技術應運而生，其中以腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)為典型代表，其作為新型生物制劑，屬于TNF超家族范疇，可特異性誘使腫瘤細胞凋亡，呈無毒性，正常細胞組織生長分化不受影響，是一類具有潛力的抗癌藥物，但治療過程中部分患者耐藥性依舊存在，TRAIL臨床應用亦受到阻礙[3]。為增強其抗癌效用，進一步提升療效，輔以其他藥物聯合治療為現今研究熱點。而據報道證實[4]：蛇床子素作為傘形科植物中的一類純天然香豆素，除發揮抗變態反應、抗肝炎、抗病毒及抗骨質疏松效用外，還具有廣譜抗癌作用，在肺癌、肝癌及白血病等治療中均呈現良好抗癌活性。鑒于蛇床子素聯合 TRAIL 在卵巢癌抗癌作用中的研究所涉不多，本研究旨在探究蛇床子素聯合TRAIL在卵巢癌中的作用，并初步探究其機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料SKOV-3和OVCAR-3細胞株由吉林大學第二醫院實驗室提供，重組人TRAIL蛋白購于美國RD公司，蛇床子素、MTT、DMSO購自美國Sigma-Aldrich公司，caspase-3、caspase-9及其前體、凋亡酶激活因子(Apaf-1)、細胞色素C檢測試劑盒/抗體購自美國Cell Signaling公司，Apaf-1 siRNA購自上海吉瑪生物，蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購自美國Santa Cruz公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，Caspase活性檢測試劑盒由江蘇碧云天生物技術研究所支持。酶標儀為美國雷勃公司Thermo Multiskan MK3，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與處理 細胞培養于含10%新生牛血清的RPMI1640培養基，環境條件為37℃、5%CO2。分組施加蛇床子素(0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L)及TRAIL(0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL及40 ng/mL)，48小時后以MTT法檢測活性，Logit法計算半數抑制濃度(IC50)后，選取蛇床子素(50 μmol/L)、TRAIL(20 ng/mL)為最終試驗濃度。分別為蛇床子素組(OS組)，TRAIL組(TR組)，蛇床子素聯合TRAIL組(OT組)，空白對照組(Blank組)。

1.2.2最終濃度選擇 單一施以不同濃度蛇床子素(0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L)及TRAIL(0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL及40 ng/mL)，作用48 h后運用MTT法檢測細胞活性，經MTT檢測顯示，蛇床子素及TRAIL單一作用SKOV-3和OVCAR-3 48 h后，抑制率與濃度呈正相關。由Logit法計算半數抑制濃度(IC50)后，選取蛇床子素(50 μmol/L)、TRAIL(20 ng/mL)為最終試驗濃度開展研究。

1.2.3MTT法檢測細胞活性 取對數生長期的細胞，每孔5×103接種于96孔版，每孔內加入20 μl MTT檢測液，培養48小時后，每孔加200 μl DMSO，酶標儀測定吸光值。

1.2.4siRNA轉染 轉染前24 h，取對數生長期的細胞，胰酶消化后加完全培養基重懸，吸管吹打混勻制成細胞懸液。按1×106個/孔的細胞濃度將細胞接種至6孔板中，置37℃，5% CO2培養箱培養18-24 h，使其轉染前每孔細胞達到80%-90%的匯合率。轉染前3 h，去除原培養基，更換為不含血清和抗生素的新鮮基礎培養基。采用脂質體Lipofectamine 2000根據試劑盒說明書進行轉染，在37℃，5% CO2的條件下培養48小時。根據轉染及其后處理的不同，細胞分為蛇床子素、TRAIL聯合Apaf-1 siRNA組(si-OT組)，蛇床子素、TRAIL聯合陰性對照 siRNA組(NC-OT組)。

1.2.5凋亡檢測 收集各組細胞，按照PE Annexin V凋亡檢測試劑盒(BD，美國)說明操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡，并用配套軟件進行數據分析。

1.2.6ELISA檢測 設置標準品孔、0值孔、空白孔和樣品孔，標準品孔、0值孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體，恒溫箱溫育60 min，自動洗板機洗板，將底物A和B按1∶1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液，恒溫箱溫育15 min，所有孔加入終止液，在酶標儀上讀取各孔吸光度。

1.2.7Western blot檢測 RIPA提取總蛋白，對蛋白進行定量，采用SDS-PAGE對100 μg蛋白進行電泳，200 mA恒流電轉印120 min，將樣品轉移至PVDF膜上，將膜浸于含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h；加入一抗工作液，TBST洗3次，加入二抗，室溫搖床孵育1.5 h。TBST洗3次，使用EZ-ECL化學發光增強試劑盒對膜進行顯色反應。

1.2.8免疫共沉淀檢測 各組取2×106細胞行免疫沉淀。緩沖液裂解15 min后置于12 000 rpm離心10 min，取用上清液加入Apaf-1抗體孵育過夜，再加以蛋白G瓊脂糖珠行2小時孵育，經免疫沉淀2小時后，以Western blot試驗檢測pro-caspase蛋白。

1.3 統計學分析將所有實驗數據用SPSS22.0軟件行統計處理，計量資料以“均值±標準差”表示，運用非配對雙邊t檢驗，若P<0.05，則視作差異具備統計學意義。

2 結果

2.1 蛇床子素聯合TRAIL處理降低卵巢癌細胞活性并誘導凋亡

在MTT檢測與流式凋亡檢測結果中發現，與空白對照相比，加入藥物進行處理的另外三組的活性抑制率與誘導凋亡率均有顯著上升(P<0.05)，其中蛇床子素與TRAIL聯合使用顯示出了比單獨使用蛇床子素或TRAIL更高的活性抑制與誘導凋亡效果，此結果提示蛇床子素和TRAIL在抑制卵巢癌細胞活性與誘導其凋亡上具有協同作用。結果見表1及圖1A、1B。

表1 細胞活性抑制率及誘導凋亡率

圖1 細胞活性抑制率及誘導凋亡率

2.2 蛇床子素與TRAIL影響凋亡相關蛋白及細胞色素C表達

通過ELISA檢測caspase-3、caspase-9 及細胞色素C表達情況，結果顯示，TRAIL組細胞色素C呈高表達，蛇床子素組則與空白對照組細胞色素C表達水平無明顯差異，提示TRAIL在卵巢癌細胞中的機制為通過細胞色素誘導線粒體分泌至細胞質中；蛇床子素組caspase-9前體蛋白表達水平與空白對照組基本一致，可知其無法直接誘使Apaf-1與caspase-9前體蛋白結合；而在蛇床子素與聯合 TRAIL使用的組別中，caspase-9前體蛋白表達相對水平顯著提高，可見Apaf-1表達上調促進Apaf-1與caspase-9前體蛋白結合；經ELISA檢測結果顯示，蛇床子可通過上調Apaf-1表達促使caspase-3、caspase-9的活化。見表2、3與圖2。

表2 SKOV-3中caspase-3、caspase-9活化、細胞色素C及caspase-9 前體蛋白表達相對水平

表3 OVCAR-3中caspase-3、caspase-9活化 、細胞色素C及caspase-9 前體蛋白表達相對水平

圖2 SKOV-3與OVCAR-3中caspase-3、caspase-9活化 、細胞色素C及caspase-9 前體蛋白表達相對水平

2.3 蛇床子素與TRAIL影響Apaf-1表達水平

通過Western blot檢測Apaf-1表達水平發現，TRAIL組Apaf-1相對水平較空白對照組無明顯差異，而蛇床子素聯合TRAIL組Apaf-1則呈現顯著高表達，提示蛇床子素可能通過上調Apaf-1表達起到TRAIL增敏效用。影響Apaf-1的表達可能是蛇床子素與TRAIL處理起到效果的重要機制。結果見表4與圖3。

表4 SKOV-3中Apaf-1表達相對水平

圖3 SKOV-3中Apaf-1表達相對水平

2.4 Apaf-1通過與caspase-9前體的相互作用影響細胞凋亡

利用免疫共沉淀檢測Apaf-1與caspase-9前體的相互作用情況，結果顯示Apaf-1與caspase-9前體在卵巢癌細胞中存在相互作用(圖4)，提示Apaf-1通過此種相互作用影響卵巢癌細胞凋亡情況是蛇床子素與TRAIL誘導卵巢癌細胞凋亡的機制。對蛇床子素、TRAIL聯合Apaf-1 siRNA組(si-OT組)，蛇床子素、TRAIL聯合陰性對照 siRNA組(NC-OT組)兩組細胞進行的凋亡檢測與ELISA檢測結果顯示，在轉染Apaf-1 siRNA后，蛇床子素聯合TRAIL處理對卵巢癌細胞的凋亡誘導作用出現下降，提示Apaf-1的表達變化是蛇床子素聯合TRAIL影響卵巢癌細胞凋亡的重要一環。結果見圖5。

圖4 Apaf-1與caspase-9前體的相互作用情況

圖5 凋亡檢測與ELISA檢測結果

3 討論

卵巢癌作為盆腔深部隱匿性婦科腫瘤，首次確診多已為中晚期，因此最佳治療時機錯失，有效治療手段缺乏，其致死率在婦科惡性腫瘤中處第一位[5-6]。目前，以腫瘤細胞減滅術聯合鉑類、紫杉醇等藥物足療程化療為卵巢癌一線治療方案，可有效延長患者生存期[7]。據有關研究證實[8]：在化療初期階段，60%-80%卵巢癌患者具有較高敏感性，但在持續治療過程中，約75%以上晚期卵巢癌患者呈現耐藥性，由此引發的嚴重副作用使治療難度驟升。為此，醫學界以卵巢癌凋亡機理為切入點開展了諸多相關研究，旨在尋求一種更為有效的治療方案。

現如今，生物治療成為惡性腫瘤治療的第四大技術，在卵巢癌治療中已取得確切療效。TRAIL為首選生物治療藥物，于1995年首次發現，歸屬于TNF家族，因其腫瘤細胞凋亡屬特異性誘導，且不對正常細胞產生毒性，故其作為抗癌藥物潛能巨大[9]。但限于仍有部分腫瘤患者可對TRAIL治療產生耐藥性，因此，聯合增敏藥物，對其耐藥性加以逆轉，提升TRAIL殺傷腫瘤細胞能力，為現今研究熱點[10]。據相關研究發現[11]，單獨使用蛇床子素及TRAIL無法對腎癌細胞凋亡產生影響，但聯合使用，誘導腎癌細胞凋亡情況明顯，且線粒體膜電位水平明顯降低，細胞色素C釋放增加，由此證實蛇床子素可能為TRAIL增敏劑。蛇床子作為一類天然植物化合物，可在一定程度控制上皮-間充質轉變(EMT)過程，在炎癥及纖維化病癥中具有確切療效[12]。據Lu K等學者[13]研究報道，使用不同劑量的蛇床子素治療子宮內膜癌(Ec)，隨蛇床子素劑量上升可上調miR-424表達，從而使Ishikawa和KLE細胞增殖受到抑制并被誘導凋亡，蛇床子素已成為一種新型且具備潛力的子宮內膜癌抗癌藥劑。多方證據表明，蛇床子素具備成為卵巢癌治療藥物潛能。基于此，本文研究意欲探析蛇床子素聯合TRAIL 誘導人卵巢癌細胞的凋亡，并對其作用機理加以明確，旨在尋找一種新型卵巢癌治療策略。

本文結果顯示：蛇床子素+TRAIL組細胞活性抑制率及凋亡率均最高，且其中機制為Apaf-1表達上調促進了caspase-3、caspase-9活化。其中Apaf-1是線粒體通路中一個關鍵的促凋亡因子，在一定條件下能直接促進procaspase-9的活化和釋放，從而進一步活化caspase-3，導致細胞凋亡的發生。在本研究的實驗中，已經證實了Apaf-1在卵巢癌細胞中與caspase-9前體的相互作用。由此可知：蛇床子素聯合TRAIL治療具有協同效果，且可增強TRAIL抗癌效用，此過程與Apaf-1蛋白高度相關。另外可能的潛在機制在于[14]：蛇床子素聯合TRAIL可影響線粒體膜電位，從而增加細胞色素C等凋亡誘導因子釋放，細胞凋亡通路得以激活。有關線粒體膜電位變化的機制有待進一步實驗研究探索。

此外，作為 caspase 家族引起細胞凋亡的最主要的成分之一的caspase-9，其活化直接影響到通路進程，可有效激活caspase-3效應分子，促使腫瘤細胞DNA呈片段化導致細胞凋亡，在caspase-9活化過程中，Apaf-1蛋白的參與極為關鍵。本研究結果已證實：蛇床子素聯合TRAIL可促進Apaf-1表達上調，由此與caspase-9前體蛋白結合增強。這一機制與于有江等學者[15]所述研究有較大一致性，而Jiang G等學者[16]以卵巢癌細胞系A2780、OV2008及正常卵巢細胞IOSE80為實驗模型試驗，發現蛇床子素可通過G2/M阻滯抑制細胞增殖并誘使細胞凋亡，其中潛在機制與相對凋亡蛋白Bcl-2、Bax和caspase 3/9的調節有關。且據Bae H等學者[17]研究證實，蛇床子素可通過靶向調節磷脂酰肌醇3-激酶/促分裂原激活的蛋白激酶信號傳導途徑促進卵巢癌細胞凋亡，通過對斑馬魚異種移植測定，肯定了蛇床子素的藥理作用，故將其作為卵巢癌治療的有效藥物得到了有力佐證。本文的研究結果對上述發現具有補充意義。

綜上所述：蛇床子素聯合TRAIL治療卵巢癌可降低細胞活性，進而促使細胞凋亡，原因與其誘導卵巢癌細胞中細胞色素C的分泌及上調Apaf-1表達，從而通過Apaf-1與caspase-9相互作用，促進caspase-9的活化表達有關。蛇床子素與TRAIL聯合使用具有較高卵巢癌治療潛力，可為后續卵巢癌臨床治療提供重要參考。