基于電子鼻和SPME/GC-MS 技術對勐海縣曬青茶的揮發性物質分析

劉學艷，黃飛燕，周啟武,

（1.滇西科技師范學院生物技術與工程學院，云南臨滄 677000；2.云南省紅茶工程技術研究中心，云南臨滄 677000）

曬青茶是國家地理標志產品普洱茶的唯一原料，由云南大葉種茶樹鮮葉經殺青-揉捻-干燥等加工而成。優質曬青茶條索完整、色澤調和均勻；茶湯綠黃明亮、香氣馥郁持久帶花果香，滋味醇厚回甘；氨基酸、茶多酚等內含成分豐富，既是曬青茶調節代謝性疾病等保健功能的基礎，也是高品質普洱茶香氣和滋味的物質基礎。隨著消費者對天然、本味、綠色食品的重視程度逐漸提高，曬青茶的品質已成為關注重點。學者也對曬青茶進行過大量研究，包括曬青茶的加工工藝、滅菌方法、農藥殘留等。

揮發性物質是茶葉在加工過程中通過氨基酸類、苯丙烷類、多酚類等代謝途徑產生的次生代謝產物，作為衡量茶葉香氣的重要因素，既是茶葉呈香的主體物質，也是茶葉生物活性的物質基礎。茶湯的茶香主要是由不同濃度的不同種芳香物質組合呈現，由大量帶芳香氣味的組分賦予了茶葉獨特的香氣。紅茶、白茶、綠茶、普洱茶、烏龍茶的揮發性物質研究取得重大進展，主要的十大揮發性物質已經明確。但作為普洱茶原料的曬青茶揮發性物質研究較少。研究曬青茶揮發性物質可以確定香氣種類及含量、發現優勢香氣物質及“日曬味”香氣骨架，從而輔助判斷香型、區別茶類；也為探究曬青茶的呈香機理、開發高香曬青茶提供理論依據。因此，研究曬青茶揮發性物質具有重要意義。

近年來，研究揮發性香氣物質的儀器主要有電子鼻、氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）以及氣相離子遷移譜儀（GC-IMS）；其中，電子鼻方便攜帶，檢測速度最快，可以根據揮發性物質對樣品進行快速的聚類分析；氣相色譜-質譜聯用儀靈敏度高，且與固相微萃取技術（SPME）聯合使用時，樣品前處理簡單，有機溶劑消耗少。SPME 與GC-MS 聯合可以對揮發性物質進行分離、鑒定，目前廣泛用于食品、茶葉等揮發性物質的分析檢測。如趙苗苗等將電子鼻和GC-MS 聯合測定臨滄市的曬青茶揮發性物質，認為兩者結合能夠相對全面地了解曬青茶揮發性物質；也有學者將電子鼻、HS-SPME-GC-MS、HS-GC-IMS 聯合使用，全面分析食品風味物質。據文獻報道，曬青茶的揮發性香氣物質主要包括醇類、醛類、酮類、烴類等。產地、樹齡、加工工藝（殺青方法、揉捻方法、干燥技術）等都會影響曬青茶揮發性物質；馬超龍研究發現，曬青茶加工過程中，醇類揮發性物質含量差異最大，尤其是揉捻葉中醇類物質占揮發性物質總含量的82.25%；戴兵等的研究指出，高壓脈沖電場處理可以提高曬青茶的醇類香氣物質。

西雙版納勐海縣是優質曬青茶的核心產地之一，大量的優質曬青茶產自格朗和鄉、南糯山鄉、西定鄉、勐宋鄉等。前人研究表明，勐海縣的曬青茶在水浸出物、茶多酚、兒茶素等內含成分上比勐臘縣、雙江縣的曬青茶豐富；在感官品質較臨滄市云縣、鳳慶縣等地的曬青茶更優，但關于勐海縣曬青茶揮發性物質的研究較少。綜上，本試驗采用電子鼻和SPME/GC-MS 聯用技術，對勐海縣8 份曬青茶樣品進行揮發性物質檢測和分析，旨在深入了解勐海縣曬青毛茶香氣的揮發性物質組分及含量，為探索西雙版納地區茶葉的“勐海味”奠定基礎，也為勐海縣曬青毛茶的拼配提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗供試材料來自于云南省西雙版納州勐海縣，于2017 年4 月按照一芽三葉的標準采摘勐海大葉種茶樹鮮葉，按照相同標準制成曬青毛茶（表1），密封保存在同樣的環境條件下，于同年7 月使用電子鼻和氣質聯用儀進行揮發性物質檢測。

表1 勐海縣曬青毛茶樣品信息Table 1 Sun-dried green tea samples informations of Menghai County

PEN3 便攜式電子鼻 德國Airsens 公司；HP78-90A-5975C GC-MS 氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent 公司；A13204-N 電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；DHG-9140 型電熱鼓風干燥箱 上海中友儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 電子鼻分析

1.2.1.1 電子鼻檢測條件 采用德國Airsens 公司PEN3 便攜式電子鼻（Portable Electronic Nose）進行檢測，樣品準備時間為5 s；進樣流量為300 mL/min；清洗通道200 s，平衡45 s，測定時間為60 s，取響應信號區間55～57 s 進行數據分析，具體傳感器性能描述見表2。

表2 電子鼻傳感器名稱與性能描述Table 2 Electronic nose sensor name and performance description

1.2.1.2 香氣采集方法 采用干茶法（稱取3 g 茶樣置入150 mL 錐形瓶中，用保鮮膜密封靜置30 min，將電子鼻香氣探測頭伸入錐形瓶中收集香氣數據）；茶湯法（取下保鮮膜，往錐形瓶中注入150 mL 沸騰的超純水，再用保鮮膜將瓶口密封，待茶湯冷卻45 min 至室溫后，采集茶湯香氣數據）；葉底法（將茶湯傾倒完全，再用保鮮膜將瓶口密封，待30 min 后進行葉底香氣采集）三種方法采集茶樣揮發性物質，每個茶樣平行測定3 次，再用電子鼻配套軟件Win-Muster，對數據進行LOD 和LDA 分析。

1.2.2 GC-MS 分析方法

1.2.2.1 香氣萃取方法（SPME）將茶樣置于干燥器內，實驗前準確稱取10.0 g 茶樣放入自制的頂空萃取瓶中，立即加入30 mL 100 ℃的高純水，加蓋密封后置于55 ℃水浴，6 min 后插入預先老化過的65 μm PDMS/DVB 萃取頭進行萃取，吸附時間45 min，取出后立即插入色譜進樣口中解吸附5 min，完成香氣采集。

1.2.2.2 GC 條件 采用HP-5MS 毛細管色譜柱（柱長30 m、內徑0.25 mm、液膜厚度0.25 μm）；載氣為氦氣（He），純度＞99.999%，流速1.0 mL/min；進樣口溫度為250 ℃，ECD 檢測器溫度250 ℃，起始柱溫為50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 升至250 ℃，分流進樣，分流比30:1。

1.2.2.3 MS 條件 離子源為EI，氣質接口溫度為280 ℃，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，電子倍增器電壓為1894 V。

1.2.2.4 定性和定量方法 根據氣相色譜/質譜聯用（GC-MS）分析得到揮發性成分的總離子色譜圖，通過計算機檢索，參考標準譜圖（NIST08 和NIST08s），同時結合相對保留時間，查閱茶葉香氣文獻資料及數據，對樣品揮發性成分進行定性，確認各峰化合物名稱；并用峰面積歸一化法分析各香氣組分相對含量，面積計算采用島津CR-2AX 色譜數據處理。

1.3 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2010 對實驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 電子鼻檢測結果分析

通過電子鼻儀器采集了8 個曬青茶的揮發性香氣物質信息后，對數據進行LDA 和LOD 分析。其中，LDA 分析法可以看出不同的香氣采集方法下，構成曬青茶揮發性物質的化合物種類，以及不同的化合物對香氣物質的貢獻率的高低。而LOD 分析可以看出不同樣品的揮發性物質的總體差異，對樣品進行聚類分析。

2.1.1 LOD 分析 8 個曬青茶揮發性物質信息的LOD 分析結果如圖1 所示。在Correlation-M 矩陣下，干茶法（圖1A）、茶湯法（圖1B）、葉底法（圖1C）的Linear Discriminant1 和 Linear Discriminant2 的貢獻率之和分別達到98.86%、98.64%、97.87%，能夠代表曬青茶樣品的揮發性物質信息。干茶法中，傳感器W1W 對第一主成分的貢獻率最大，傳感器W2S 對第二主成分的貢獻率最大，W1S 和W3S 次之。說明硫化物類、烴類、甲基類化合物對干茶香氣貢獻率較高。茶湯法中，傳感器W1W 對第一主成分的貢獻率最大，其次是W3S 和W5S；傳感器W3S對第二主成分的貢獻率最大，說明硫化物類、烴類（長鏈烷烴）、氮氧化合物類是茶湯的主要揮發性香氣物質；葉底法中，傳感器W1W 對第一主成分的貢獻率最大，其次是W2W；傳感器W3S 對第二主成分的貢獻率最大，其次是W5S 和W2S，說明硫化物類、芳香烴類、長鏈烷烴、氮氧化合物類、醇、醛、酮類對葉底的香氣貢獻率較高。綜合上述3 種香氣采集方法，可以看出硫化物類、烴類對曬青茶揮發性香氣貢獻率較高，其次是氮氧化合物、長鏈烷烴以及醇醛酮類；同時可以看出，干茶、茶湯、葉底的主要揮發性物質存在一定的差異。

圖1 電子鼻檢測結果LOD 分析Fig.1 LOD analysis of electronic nose detection results

2.1.2 LDA 分析 8 個曬青茶揮發性物質信息的LDA 分析結果如圖2 所示。在Corre-lation-M 矩陣下，干茶法（圖2A）、茶湯法（圖2B）、葉底法（圖2C）的Linear Discriminant1 和 Linear Discriminant2 的貢獻率之和分別達到82.25%、87.74%、94.26%，能夠代表曬青茶樣品的揮發性物質信息，且LDA 分析法可以將不同產地的曬青茶樣區分開來。由圖2 可知，茶湯法和葉底法將8 個茶樣分為4 組，其中NN、XD、BL、GL、ZJ 揮發性物質信息圖譜分布在相近區域，說明南糯山茶樣（NN）、西定茶樣（XD）、布朗山茶樣（BL）、格朗和茶樣（GL）、章家三隊茶樣（ZJ）的揮發性物質在種類和含量上都比較接近；BD、BJ、ZL 茶樣分別分布在三個區域，與其余5 個樣品距離較遠，說明巴達茶樣（BD）、布朗山邊境茶樣（BJ）、巴達章朗茶樣（ZL）的揮發性物質信息差異較大。但在干茶法中，GL 茶樣與NN、XD、BL、ZJ 茶樣的揮發性物質信息圖譜沒有分布在鄰近區域，說明干茶法與茶湯法、葉底法富集到的揮發性物質存在一定的差異。

圖2 電子鼻檢測結果LDA 分析Fig.2 LDA analysis of electronic nose detection results

2.2 GC-MS 檢測結果分析

通過SPME-GC-MS 儀器，8 個曬青茶樣品中共檢測到55 種揮發性香氣物質，包括醇類（9 種）、醛類（9 種）、酮類（6 種）、酯類（7 種）、雜環類（4 種）、氮氧化合物類（1 種）、烯烴類（13 種）、烷烴類（5 種）、芳香烴類（1 種）。8 個茶樣中的揮發性香氣物質種類和相對含量見表3。

由表3 可知，8 個曬青毛茶樣品的揮發性物質種類基本一致，以醇類、醛類、酯類、酮類、雜環類、烷烴類、烯烴類為主；其中，反-2-辛烯醛、苯乙醛、藏花醛、-松油醇、芳樟醇及其氧化物、香葉醇、（+）-檸檬烯、v-依蘭油烯、-依蘭油烯、2,2,6-三甲基環己酮、-紫羅蘭酮、植酮、香葉基丙酮、領苯二甲酸二丁酯、亞麻酸甲酯、二氫獼猴桃內酯、二十烷等是8 個曬青茶樣品中共有的揮發性物質。不同茶樣中的揮發性物質在含量上有較大差異，尤其是醇類物質。ZL茶樣中的醇類物質含量最高，主要是芳樟醇（31.61%）、脫氫芳樟醇（3.58%）、-松油醇（10.04）、香葉醇（8.69%）和植物醇（9.96）含量較高；BJ 茶樣中的醇類揮發性物質含量最低，僅為37.14%，芳樟醇含量僅為21.76%，但BJ 茶樣中的v-依蘭油烯（1.01%）、-紫羅蘭酮（0.23%）、吲哚（0.83%）和二十九烷（1.44%）這幾種物質含量明顯高于其它7 份茶樣。除醇類物質外，ZL 茶樣中的羅勒烯（1.11%）、-紫羅蘭酮（1.89%）、植酮（1.13%）和香葉基丙酮（0.52%）含量也高于其它7 份茶樣；BD 茶樣中的-依蘭油烯（1.38%）、反式芳樟醇氧化物（4.04%）、亞麻酸甲酯（0.72%）、二十四烷（0.13%）這幾種含量均高于其它7 組茶樣。BD 茶樣特有的香氣成分為二十四烷（0.13%）；XD 特有的香氣成分為聯苯烯（0.11%）；ZJ 茶樣特有的香氣成分為糠醇（0.90%）；GL 茶樣特有的香氣成分為2-莰烯（0.38%）。正是這些不同種類和含量的香氣物質，以及特有的香氣成分為各地區曬青茶的獨特品質奠定了基礎。

表3 8 個曬青茶樣品的揮發性物質種類及相對含量（%）Table 3 Types and relative contents of volatile compounds in 8 sun-dried green tea samples (%)

為比較勐海縣不同產地的8 份曬青茶樣品各類香氣物質種類總數和相對含量的差異，根據表3，將各類香氣物質的種類及相對含量統計如表4。

由表4 可以看出，8 個茶樣的揮發性物質種類總數差異不大，總相對含量差異較大。其中，ZL 茶樣（87.45%）、GL 茶樣（87.27%）和ZJ 茶樣（82.15%）的揮發性物質相對總含量均高于80%，而BJ 茶樣（64.36%）、BL 茶樣（67.66%）和BD 茶樣（63.50%）均低于70%。從物質種類來說，醇類、烯烴類、酯類、烷烴類、氮氧化合物類相對含量差異較大。其中，醇類占所有揮發性物質的比例最高且差異最大，最高為ZL 茶樣（64.02%），最低為BJ 茶樣（37.14%），即醇類是造成BJ 茶樣和ZL 茶樣揮發性物質總相對含量差異較大的重要原因。除醇類物質外，烯烴類和烷烴類物質在8 個茶樣中的相對含量差異也比較大。其中，來自于西定鄉的三個茶樣烯烴類物質相對含量分別為：BD（6.09%）、ZL（7.11%）、XD（6.66%），其均值（6.62%）高于產自格朗和鄉（5.08%）和布朗山鄉（4.20%）的茶樣，即西定鄉曬青茶樣的烯烴類揮發性物質相對含量較格朗和鄉和布朗山鄉的曬青茶樣高。醇類、烯烴類、酮類是ZL 茶樣的優勢香氣物質，烷烴類、酯類、雜環類、氮氧化合物類分別是BJ 茶樣、BL 茶樣、NN茶樣、ZJ 茶樣的優勢香氣物質。正是這些不同種類及不同含量的揮發性物質構成了各個產地曬青茶的獨特香氣特征。

表4 8 份曬青茶樣品各類香氣物質種類總數和相對含量Table 4 Total number and relative content of aroma components in 8 sun-dried green tea samples

3 討論與結論

由電子鼻LDA 分析表明，電子鼻可以根據曬青茶揮發性物質對不同產地的茶樣進行簡單的聚類分析，并將差異明顯的茶樣篩選出來，也可以看出構成揮發性香氣物質的化合物類別，但無法知道各類化合物的具體組成物質及其含量。GC-MS 檢測剛好可以彌補電子鼻的不足。由電子鼻LOD 分析結果可知，硫化物類、烴類對曬青茶香氣貢獻率最高，其次為長鏈烷烴類、氮氧化合物類、醇類、醛類、酮類等。其中，醇類、醛類、酮類物質在GC-MS 結果中也是主要的香氣物質，但硫化物在GC-MS 結果中并非優勢香氣物質，可能有兩個原因：一是電子鼻與GC-MS 數據庫系統對物質分類的方法不一致；二是電子鼻對硫化物的靈敏度很高（1 mL/m），且有兩個傳感器（W1W、W2W）可以識別有機硫化物；但趙苗苗等認為可能是因為香氣采集時，對錐形瓶進行密封的塑料薄膜中含有硫化物。據陳嬌嬌研究報道：HS-SPME 萃取方法存在香氣競爭，不能完全富集C以下的小分子成分，或富集到的部分香氣物質與計算機譜庫數據匹配度較差，因此檢出的揮發性物質含量與茶樣實際含量存在一定的差異。

由GC-MS 結果可知，勐海縣8 個曬青茶樣的9 大類揮發性物質中，烯烴類物質種類最豐富，醇類物質相對含量最高且差異最大。據寧靜等等的研究結果可知，醇類是茶葉呈花果香的主要物質，芳樟醇具有花木香，香葉醇具有玫瑰花香，-松油醇具有丁香味，這3 種醇類也是8 個曬青茶中共有的成分。本次檢測中，植物醇在曬青茶樣中含量差異很大，僅有ZL、XD、ZJ、GL 四個茶樣中含有植物醇，分別為9.96%、11.32%、22.16%、16.71%，其余茶樣中均未檢測出來。據馬超龍研究顯示，植物醇僅存在于曬青茶的在制品（鮮葉、殺青葉、揉捻葉）及日曬3 h 的樣品中，成品茶樣中無植物醇；結合坤吉瑞等的研究表明，可能是因為本次實驗中在對曬青茶進行日光干燥時，僅保證了光照時間一致，而光照強度不完全一致。綜上，植物醇是構成8 種茶樣揮發性物質含量差異的主要原因之一，但并非是曬青茶的標志性揮發性物質。

從產地來看，格朗和鄉的茶樣（NN、GL）優勢香氣物質為醛類，西定鄉的茶樣（BD、ZL、XD）優勢香氣物質為烯烴類，布朗山鄉茶樣（BJ、BL、ZJ）的優勢香氣物質為酮類和烷烴類。三個產區的曬青茶揮發性物質相對含量均值分別為：格朗和鄉82.475%、西定鄉73.97%、布朗山鄉71.39%，可以看出格朗和鄉的曬青茶揮發性物質相對含量較西定鄉和布朗山鄉高，說明在茶樹品種和加工工藝相對一致的條件下，產地對曬青茶揮發性物質有重要影響，這主要是因為各個產地茶樹的生長環境不一致，包括光照強度、光照時間、溫濕度等。

綜上所述，電子鼻可以看出曬青茶樣揮發性香氣物質整體差異以及主要的香氣物質類別，硫化物及烴類是電子鼻富集到的曬青茶主要揮發性物質；電子鼻也能對曬青茶進行簡單的聚類分析，將8 組茶樣大致分為4 組，NN、XD、BL、GL、ZJ 茶樣為一組，而BD、BJ、ZL 分別為一組。GC-MS 可以檢測出茶樣的揮發性物質種類及相對含量。8 個曬青茶樣品中共檢測出55 種揮發性物質，主要是醇類（9 種）、醛類（9 種）、酮類（6 種）、烯烴類（13 種）、雜環類（4 種）、酯類（7 種）、烷烴類（5 種）、氮氧化合物類（1 種）、芳香烴類（1 種）。其中，醇類對曬青茶揮發性物質相對含量的影響最大。8 個曬青茶樣中共有的揮發性物質有19 種，含量較高的10 種揮發性物質分別是3 種醇（芳樟醇、-松油醇、香葉醇）、2 種醛（苯乙醛、藏花醛）、2 種酮（-紫羅蘭酮、植酮）、2 種雜環類（順式芳樟醇氧化物、反式芳樟醇氧化物）、1 種酯（二氫獼猴桃內酯）。格朗和鄉的曬青茶揮發性物質總相對含量高于南糯山鄉和西定鄉，主要表現在醛類物質上。布朗山鄉的曬青茶優勢香氣物質為酮類和烷烴類，西定鄉的優勢香氣物質為烯烴類，即不同產地的曬青茶具有不同的優勢揮發性物質，正是這些不同種類及不同含量的揮發性物質共同形成了勐海縣曬青茶一山一味的特點。