促生菌劑處理對網紋甜瓜風味的影響

李莉峰，時 月，李 婷，溫雪珊,4，趙立群，王瑞琪,5，錢 井，趙曉燕,4，張 超,

（1.遼寧省農業科學院食品與加工研究所，遼寧沈陽 110161；2.北京市農林科學院農產品加工與食品營養研究所，北京 100097；3.北京市農業技術推廣站，北京 100029；4.果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，北京 100097；5.農業農村部蔬菜產后處理重點實驗室，北京 100097）

網紋甜瓜（L.var.Naud.）是葫蘆科甜瓜屬的一個變種，具有香、甜、糯等特點，深受消費者喜愛。網紋甜瓜氣味清新香甜，并隨著成熟度提高逐漸增強，是影響消費者選購的重要因素。目前，在甜瓜中共檢測出500 多種揮發性組分，其呈香組分主要源于酯類、醇類和醛類等，也有少量酮類、萜烯、呋喃或硫化物，其中乙酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯等賦予果實甜香和水果香氣，順-6-壬烯醛、反-2-己烯醛、順-3-壬烯醇、順-3-己烯醇、反,順-2,6-壬二烯醇、1-辛烯-3-醇等賦予果實新鮮、清香、香甜或青草香氣。

甜瓜果實香氣受品種、產地、栽培方式、肥料和成熟度等影響。促生菌劑作為一類促進植物生長的微生物，在植物根部定殖后促進植物營養吸收，促進植物生長發育；降低化肥和農藥帶來的負面影響。常用的促生菌主要是細菌和真菌，根據菌種形態可以分為桿菌、霉菌和放線菌。研究發現施用促生菌劑提高了庫爾勒香梨香氣組分含量，其果實揮發性組分9-癸烯醇、2,6,10-三甲基-9-十一烯醛和壬癸烷的含量顯著性提高；促生菌劑提高水稻香氣強度。在甜瓜方面，研究發現促生菌劑可提高甜瓜可溶性糖含量28.99%～58.46%，提高維生素C 含量10.86%～28.34%。但是，促生菌劑對網紋甜瓜風味影響的研究還未見報道。

本項目組前期研究發現，施用促生菌劑提高網紋甜瓜大小和甜味均一性，提高果實可溶性固形物含量15.2%。因此，本文選擇枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和鏈霉菌分別作為桿菌、霉菌和放線菌的代表，評價上述3 種促生菌劑對網紋甜瓜風味的影響。研究在甜瓜定植過程中，分別施用枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和鏈霉菌4 次，采收后使用SPME-GC-MS 和電子鼻檢測網紋甜瓜的揮發性組分種類和含量，比較促生菌劑對網紋甜瓜呈香組分影響，以期為高品質網紋甜瓜生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“阿魯斯”網紋甜瓜 上?；莺头N業有限公司；枯草芽孢桿菌（BIOWORKS）美國拜沃股份有限公司（有效活菌數：100 億個/g）；哈茨木霉（T22）荷蘭科伯特有限公司（有效活菌數：6 億個/g）；鏈霉菌 河南好美特生物科技有限公司（有效活菌數：10 億個/g）；乙醇、氯化鉀、酒石酸、氫氧化鉀、氯化銀、氯化鈉分析純，北京化工有限公司；1-辛醇 分析純，美國Sigma 公司。

ATAGO 手持式折光儀 廣州愛宕科學儀器有限公司；HR1882 型飛利浦打漿機 飛利浦公司；ZDJ-5B-D 型自動滴定儀 上海雷磁公司；AL204 電子天平 瑞士Mettler Toledo 公司；SA402B 型味覺分析系統 日本INSENT 果蔬；PEN 3 型電子鼻德國Airsense 分析儀器有限公司；6890-5973 氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent Technologies 公司；57329-U PDMS/DVB/CAR 三相萃取纖維頭 美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 試驗品種為“阿魯斯”的網紋甜瓜，試驗地點在北京市通州國際種業科技園，試驗時間為2021 年，試驗共設置4 個處理組，分別為對照組、枯草芽孢桿菌組、哈茨木霉組和鏈霉菌組。促生菌劑的使用方法：將4 個處理組安排在4 個相鄰的大棚，每棚作為一個處理，設3 次重復，每個大棚面積約150 m。網紋甜瓜于2021 年2 月5 日定植，定植行距和株距分別為1 m 和0.4 m。定植當天和第7 d分別施用清水、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和鏈霉菌1 次，每次劑量為0.1 g/m，具體是將菌劑溶解于水中，通過灌水施加于植株根部；2021 年4 月2 日采用熊蜂授粉，在授粉后第7 和25 d，分別施用清水、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和鏈霉菌1 次，每次劑量為0.1 g/m，方法同上。各組其它田間農事管理保持一致，果實在授粉第58 d 采收，采收后立刻運輸至實驗室，評價產品的風味品質特征。

1.2.2 SPME-GC-MS 測定方法 使用SPME-GCMS 方法測定樣品中揮發性組分，測定方法參考吳忠紅等測定方法，并進行改進。揮發性組分萃取：縱向切取甜瓜果肉1 片，厚度約為0.5 cm，使用打漿機將果肉勻漿，準確取6 g 勻漿果汁，將果汁與2 g NaCl和10 μL 濃度為30 μg/mL 1-辛醇溶液混合均勻，置于20 mL 頂空萃取瓶，樣品置于振搖器內，在50 ℃，100 r/min 下振搖30 min，然后SPME 纖維頭萃取30 min，然后萃取頭進入氣相色譜儀進樣口，在250 ℃下熱解析3 min。

GC 條件：DB-5MS 石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣（氦氣）流速1.0 mL/min，壓力12.8 psi，采用不分流進樣模式；升溫程序：起始溫度35 ℃，保持5 min，4 ℃/min 升溫至150 ℃，保持3 min，8 ℃/min 升溫至190 ℃，保持1 min，再以30 ℃/min 升溫至250 ℃，保持5 min。

MS 條件：采用全掃描（SCAN）模式采集信號；掃描速度1562 u/s；電子電離源；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子轟擊能量70 eV；掃描質量范圍m/z 35～550。

GC-MS 檢測的揮發性化合物由NIST17 質譜數據庫對比鑒定。根據已知濃度的內標物1-辛醇的峰面積計算網紋瓜樣品中各揮發性物質的含量（公式1）。

式中C為內標化合物的質量濃度，單位為μg/mL；V為內標在樣品中的添加量，10 μL；m為樣品質量，6 g；A和A分別為目標化合物的峰面積和內標化合物的峰面積；m為目標化合物的含量，單位為μg/kg鮮重表示。

1.2.3 香氣活力值（OAV）計算方法 揮發性組分香氣活力值（Odor activity value）計算見公式2。

式中C是揮發性組分i 的濃度（μg/kg）；OT是揮發性組分i 的香味閾值（μg/kg）。

1.2.4 電子鼻測定方法 研究使用電子鼻分析法比較樣品之間風味的區別，測定方法參考吳忠紅等測定方法。測定分別稱取5 g 樣品置于頂空進樣瓶中，室溫25 ℃下，平衡5 min 后直接將進樣針頭插入樣品瓶，采用頂空吸氣法進行電子鼻分析實驗。測定條件：傳感器清洗時間100 s、傳感器歸零時間5 s、樣品準備時間5 s、進樣流量300 mL/min，檢測時間200 s。完成1 次檢測后系統進行清零和標準化，然后再進行第2 次頂空采樣。統計分析10 個不同選擇性傳感器的G/G值。采用主成分分析表征樣品之間的差別。

1.3 數據處理

試驗結果數據為三次試驗的平均值，采用平均值±標準偏差的方式表示，采用Origin 9.0 進行數據統計和繪圖；樣品風味主成分分析采用SIMCA 14.1軟件分析和繪圖；揮發性組分的香氣貢獻度（VIP）值使用SIMCA 14.1 軟件計算，在數組中輸入揮發性組分含量，運行變量重要性分析方法，獲得揮發性組分的VIP 值；揮發性組分的主成分分析和投影變量重要性分析法使用SIMCA 14.1 軟件進行。

2 結果與分析

2.1 促生菌劑預處理對網紋甜瓜揮發性組分含量的影響

研究采用SPME-GC-MS 方法分析樣品中揮發性組分組成和含量，樣品總離子流圖見圖1，各揮發性組分分離良好。對照組、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和鏈霉菌處理組分別鑒定出63、49、54 和39 種揮發性組分，總計80 種揮發性組分（表1），其中，醇類25 種，包括壬醇、順-6-壬烯醇、3,6-亞壬基-1-醇等；醛類19 種，包括辛醛、反-6-壬烯醛、壬醛等；酯類12 種，包括乙酸己酯、丁酸乙酯、棕櫚酸乙酯等；酮類6 種，包括-紫羅酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮等；其它類18 種，包括2-正戊基呋喃、3,3-二甲基-1,6-庚二烯等。對照組、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和鏈霉菌處理組中酯類、醇類和醛類化合物含量之和分別占總揮發物含量的86.39%、97.47%、95.93%和89.55%。Gonda 等和Shi 等研究發現酯類、醇類和醛類是甜瓜中主要揮發性組分，其含量占總揮發性組分含量90%左右，與本文研究結果相近。

圖1 網紋甜瓜揮發性組分總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of netted melons

對照組、枯草芽孢桿菌組、哈茨木霉組和鏈霉菌組總揮發性組分含量分別為240.06、302.62、294.46和304.48 μg/kg，枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和鏈霉菌組總揮發性組分含量分別比對照組提高26.06%、22.66%和26.83%。在揮發性組分組成方面，鏈霉菌組揮發性組分種類與對照組相似，醇類占比較高，為58.01%、醛類占28.50%、酯類占3.04%、酮類占1.13%，其它類占9.30%。而枯草芽孢桿菌和哈茨木霉組揮發性組分變化較大，其中枯草芽孢桿菌組醇類占45.69%、醛類占48.99%、酯類占2.78%、酮類占0.61%，其它類占1.92%；哈茨木霉處理組醛類占比較高，為53.78%、醇類占38.98%、酯類占3.13%、酮類占1.56%，其它類占2.55%。胡國智等在施用不同劑量的肥料后，發現甜瓜揮發性組分種類和含量均有所變化，與本文結論一致。引起該現象的原因在于促生菌劑改變養分的供應形式，改變揮發性組分的前體物質積累，從而影響香氣形成。

研究顯示，3,6-亞壬基-1-醇（強烈的脂香、清香、黃瓜香）、順-6-壬烯醇（具有瓜香、清香香氣）、壬醇（玫瑰和橙子香）、反-6-壬烯醛（甜瓜味）和反,順-2,6-壬二烯醛（強烈的紫羅蘭和黃瓜似香氣）、苯乙醇（清甜的玫瑰花香）、乙酸己酯（青香及水果清甜的氣味）是甜瓜主要的呈香組分。本研究中，壬醇、3,6-亞壬基-1-醇、辛醛、反-6-壬烯醛、壬醛共存于各個樣品中，且含量較高，其中鏈霉菌處理壬醇和3,6-亞壬基-1-醇含量遠高于其它處理組，哈茨木霉菌處理的壬醛、辛醛和反-6-壬烯醛含量較高。因此，促生菌劑處理改變網紋甜瓜的揮發性組分組成及其含量。

2.2 促生菌劑處理對網紋甜瓜呈香組分的影響

促生菌劑處理影響網紋甜瓜呈香組分的數量。揮發性組分對果實香氣貢獻不僅和該組分濃度有關，還取決于其香氣閾值。香氣活力值（OAV）是揮發性組分濃度與其香氣閾值之比，當該數值大于等于1，表明該揮發性組分呈現其特征性香氣，可以稱為該果實呈香組分，反之，則該揮發性組分不呈現香氣。根據SPME-GC-MS 方法測定結果（表1）計算樣品揮發性組分的OAV 值，可以發現哈茨木霉組、鏈霉菌組、對照組和枯草芽孢桿菌組分別有13、10、10和9 種OAV 值大于1 的呈香組分，總計為16 種呈香組分。這些呈香組分為反-6-壬烯醛、順-6-壬烯醇、辛醛、反-2-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛、-紫羅酮、3,6-亞壬基-1-醇、壬醛、己醛、壬醇、1-辛烯-3-醇、乙縮醛二乙醇、庚醛、2-甲基丁醛、順-3-己烯醛和丁酸乙酯，其香氣閾值分別為0.00014、0.001、

表1 促生菌劑處理對網紋甜瓜揮發性組分的影響Table 1 Effect of growth promoting agent treatments on volatile components of netted melons

續表 1

0.0008、0.00019、0.0008、0.000007、0.003、0.0011、0.0024、0.0455、0.0015、0.0049、0.00058、0.0015、0.00025 和0.00076 mg/kg。其 中，反-6-壬 烯醛、3,6-亞壬基-1-醇、反,順-2,6-壬二烯醛、反-2-壬烯醛、順-6-壬烯醇和順-3-己烯醛呈現“清香和瓜香”；辛醛、己醛、壬醛、庚醛、壬醇、-紫羅酮和丁酸乙酯呈現“花香和果香”；而1-辛烯-3-醇呈現蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香；2-甲基丁醛呈麥芽杏仁香；乙縮醛二乙醇呈現芳香氣味。

哈茨木霉組中呈香組分的數量最多（圖2）。反-6-壬烯醛在各處理組中OAV 值最高，達到220.97～515.45，對網紋甜瓜香氣貢獻最大，其中哈茨木霉組、枯草芽孢桿菌組、鏈霉菌組反-6-壬烯醛OAV 值分別比對照組提高133.33%、97.64%和65.57%，哈茨木霉組瓜香高于其它各組。此外，對照組中有2 種組分（乙縮醛二乙醇和-紫羅酮）OAV 值最高，枯草芽孢桿菌組中有4 種組分（順-6-壬烯醇、己醛、反,順-2,6-壬二烯醛和反-2-壬烯醛）OAV 值最高，鏈霉菌組中有2 種組分（3,6-亞壬基-1-醇和壬醇）OAV 值最高，而哈茨木霉組中有8 種組分（順-3-己烯醛、庚醛、辛醛、反-6-壬烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、2-甲基丁醛和丁酸乙酯）OAV 值最高。同時，16 種呈香組分在哈茨木霉組中均有檢出，且OAV 大于1 的組分最多。以OAV 值大于10 為標準，對照組中有5 種呈香組分（順-6-壬烯醇、辛醛、反-6-壬烯醛、反-2-壬烯醛和-紫羅酮）；枯草芽孢桿菌組中有5 種呈香組分（順-6-壬烯醇、辛醛、反-6-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛和反-2-壬烯醛），哈茨木霉組中有7 種呈香組分（順-6-壬烯醇、辛醛、反-6-壬烯醛、壬醛、反,順-2,6-壬二烯醛、反-2-壬烯醛和-紫羅酮），鏈霉菌組中有3 種呈香組分（辛醛、反-6-壬烯醛和反-2-壬烯醛）。因此，哈茨木霉組果實呈香組分種類多，香氣更豐富。

圖2 促生菌劑處理對網紋甜瓜呈香組分香氣活力值影響Fig.2 Effect of growth promoting agent treatments on odoractivity value of aroma components in netted melons

哈茨木霉組中呈香組分的香氣活力值最高。促生菌劑處理提高了網紋甜瓜的香氣濃度及其活力值，哈茨木霉組、枯草芽孢桿菌組和鏈霉菌組呈香組分OAV 值之和分別比對照組提高82.53%、55.92%和4.91%。因此，哈茨木霉處理不僅提高網紋甜瓜主要呈香組分數量，還提高其總香氣活力。

2.3 促生菌劑處理對網紋甜瓜風味差異的影響

采用投影變量重要性分析法和主成分分析法分析4 個處理組間果實風味差異，并比較上述兩種分析方法結果差異。投影變量重要性分析法以SPMEGC-MS 測定結果中樣品揮發性組分含量為依據，計算樣品中每種揮發性組分對樣品香氣貢獻度（VIP）值，當VIP 值＞1 時，該揮發性組分即定義為關鍵呈香組分。結果顯示4 個處理組中有15 種揮發性組分VIP＞1（圖3），分別為壬醇、順-6-壬烯醇、反-6-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛、3,3-二甲基-1,6-庚二烯、1-辛烯-3-醇、辛醛、反-2-丁烯醛、3,6-亞壬基-1-醇、壬醛、反-2-己烯醛、二甲基硅烷二醇、2-甲基丁醛、乙縮醛二乙醇和2-乙基己醇。具體來說，對照組中的關鍵呈香組分14 種為：壬醇、順-6-壬烯醇、反-6-壬烯醛、3,3-二甲基-1,6-庚二烯、1-辛烯-3-醇、辛醛、反-2-丁烯醛、3,6-亞壬基-1-醇、壬醛、反-2-己烯醛、二甲基硅烷二醇、2-甲基丁醛、乙縮醛二乙醇和2-乙基己醇；枯草芽孢桿菌組中的關鍵呈香組分13 種為：壬醇、順-6-壬烯醇、反-6-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛、1-辛烯-3-醇、辛醛、反-2-丁烯醛、3,6-亞壬基-1-醇、壬醛、反-2-己烯醛、二甲基硅烷二醇、2-甲基丁醛和2-乙基己醇；哈茨木霉組中的關鍵呈香組分14 種為：壬醇、順-6-壬烯醇、反-6-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛、1-辛烯-3-醇、辛醛、反-2-丁烯醛、3,6-亞壬基-1-醇、壬醛、反-2-己烯醛、二甲基硅烷二醇、2-甲基丁醛、乙縮醛二乙醇和2-乙基己醇；鏈霉菌組中的關鍵呈香組分12 種為：反-6-壬烯醛、3,3-二甲基-1,6-庚二烯、1-辛烯-3-醇、辛醛、反-2-丁烯醛、3,6-亞壬基-1-醇、壬醛、反-2-己烯醛、二甲基硅烷二醇、2-甲基丁醛、乙縮醛二乙醇和2-乙基己醇。因此，促生菌劑影響網紋甜瓜關鍵呈香組分數量。

圖3 網紋甜瓜揮發性組分VIP 值分布圖Fig.3 Distribution of VIP value of volatile components in netted melons

進一步使用電子鼻分析的結果區分樣品間差異。采用主成分分析法對電子鼻10 個傳感器響應值進行降維分析，以區分4 個處理組果實風味差異。結果顯示主成分分析有效區分4 個處理組樣品風味（圖4），主成分1 方差為99.4%，主成分2 方差為0.45%，二者方差和為99.85%，表明主成分1 和主成分2 涵蓋了樣品風味絕大部分信息。主成分1 方差為99.4%，包含了樣品風味大部分信息。在主成分1 中，促生菌劑處理組與對照組具有顯著性差異，其中鏈霉菌組與對照組之間的距離最大，哈茨木霉組的距離次之，枯草芽孢桿菌組的距離最??；主成分2 的方差為0.45%，對樣品間區分貢獻較小，不再進行分析。進一步分析主成分1 和主成分2 的載荷（圖5），可以發現W1W、W1S、W2W、W2S 和W5S是影響主成分1 主要因素，而W6S、W3S、W5C、W1C 和W3C 對主成分1 影響較小。W1W、W1S、W2W、W2S 和W5S 分別是對無機硫化物類、甲基類、芳香類、醇醛酮類、氮氧類化合物較敏感。因此，樣品中無機硫化物類、甲基類、芳香類、醇醛酮類、氮氧類化合物是影響果實風味的主要揮發性組分。類似研究中，研究者在種植過程中施用不同濃度氯吡脲，甜瓜果實的香氣差異主要表現在W5S、W1S、W1W、W2S 和W2W 電極上，與本研究結果一致。

圖4 促生菌劑處理后網紋甜瓜風味差異Fig.4 Flavor difference of growth promoting agent treated netted melon

圖5 電子鼻10 個電極主成分分析載荷圖Fig.5 Principal component analysis loading diagram of 10 poles of the electric nose

研究進一步將VIP＞1 關鍵呈香組分和OAV＞1呈香組分按照電極特性進行分類和對比，挖掘各組香氣主要差異（圖5）。在W1W、W1S、W2W、W2S 和W5S 電極中，W1W、W1S 和W2S 對主成分1 貢獻較大，而W2W 和W5S 對主成分1 的貢獻較小。在W1W、W1S 和W2S 中，W1W 對無機硫化物具有很高的靈敏度，但是在GC-MS 的檢測中未檢測到該類化合物，不再討論該電極。因而W1S 和W2S 成為引起組間香氣差異主要原因，其中W1S 對主成分1 貢獻大于W2S。因此，對W1S 敏感的組分對組間香氣差異貢獻大。根據電極特性分類顯示，VIP＞1的15 種關鍵呈香組分中，3 種（3,3-二甲基-1,6-庚二烯、2-甲基丁醛、二甲基硅烷二醇）對W1S 敏感；12 種（壬醇、順-6-壬烯醇、反-6-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛、1-辛烯-3-醇、辛醛、反-2-丁烯醛、3,6-亞壬基-1-醇、壬醛、反-2-己烯醛、乙縮醛二乙醇和2-乙基己醇）對W2S 敏感。OAV＞1 的16 種呈香組分中，2 種（-紫羅酮和2-甲基丁醛）對W1S 敏感；14 種（反-6-壬烯醛、順-6-壬烯醇、辛醛、反-2-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛、3,6-亞壬基-1-醇、壬醛、己醛、壬醇、1-辛烯-3-醇、乙縮醛二乙醇、庚醛、順-3-己烯醛、丁酸乙酯）對W2S 敏感。由此可見，3,3-二甲基-1,6-庚二烯、2-甲基丁醛、二甲基硅烷二醇和-紫羅酮是對W1S 電極具有主要貢獻的呈香組分。因此，3,3-二甲基-1,6-庚二烯、2-甲基丁醛、二甲基硅烷二醇和-紫羅酮的含量差異是引起4 個處理組香氣差異的主要因素。

3 結論

促生菌劑處理影響網紋甜瓜香氣組分和濃度。其中，哈茨木霉組共檢出54 種揮發性組分，其濃度比對照組提高了22.66%。哈茨木霉組檢出呈香組分13 種，包括反-6-壬烯醛、順-6-壬烯醇、辛醛、反-2-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛、-紫羅酮、3,6-亞壬基-1-醇、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醛、2-甲基丁醛、順-3-己烯醛和丁酸乙酯，該數量比對照組呈香組分數量提高33.33%。哈茨木霉組呈香組分總香氣活力值比對照組高82.53%，其中香氣活力值最高的反-6-壬烯醛分別比對照組、鏈霉菌組和枯草芽孢桿菌組分別高133.33%、40.92%和18.16%。因此，哈茨木霉組果實香氣豐富性和強度更高。投影變量重要性和主成分分析法證實3,3-二甲基-1,6-庚二烯、2-甲基丁醛、二甲基硅烷二醇和-紫羅酮的含量差異是引起4 個處理組香氣差異的主要因素。因此，在種植過程中施用哈茨木霉菌劑可提高網紋甜瓜風味豐富度和強度。