大果木姜子揮發油的提取工藝優化、成分分析及抗氧化活性

劉 杰，郭江濤，劉 耀，程 純，黃 凱，簡梨娜，徐 劍,，張永萍,

（1.貴州中醫藥大學藥學院，貴州貴陽 550025；2.國家苗藥工程技術研究中心，貴州貴陽 550025；3.貴州中藥炮制與制劑工程技術研究中心，貴州貴陽 550025）

大果木姜子（Merr.）為樟科樟屬植物米槁（C）的干燥成熟果實，又名毛丹母、青吐木等，主要分布在我國貴州、廣西、云南等西北地區。大果木姜子為藥食兩用植物，貴州民間多直接將其腌制做泡菜食用。大果木姜子油不僅可以用于調味、去腥，起到健脾開胃的效果，還具有抗心絞痛、抗腫瘤、抗炎鎮痛、抑菌等藥理作用，近年來陸續有相關制劑如：理氣活血滴丸、心胃丹膠囊、米槁心樂滴丸、米槁精油滴丸上市。研究表明揮發油類成分是大果木姜子的活性成分，且有報道揮發油類成分具有極好的抗氧化作用，可作為潛在的天然抗氧化劑使用，但目前并無大果木姜子揮發油抗氧化作用的相關報道。

揮發油常用的提取方法包括水蒸氣蒸餾法、超臨界CO萃取法及超聲輔助提取法，其中，水蒸氣蒸餾法因不使用有機溶劑、不會對提取得到的揮發油造成污染、成本低等優點，仍是使用最為廣泛的經典方法，但參考文獻中采用水蒸氣蒸餾法提取大果木姜子揮發油得率均較低，造成了大果木姜子植物資源的浪費。基于此，本實驗以大果木姜子為原料，采用水蒸氣蒸餾法提取其揮發油，利用響應面法優化提取工藝，同時采用氣相色譜-質譜法（GCMS）對最優工藝提取得到的揮發油進行成分及相對含量分析，并探討大果木姜子揮發油清除DPPH·的活性，以期為大果木姜子揮發油的充分利用及在抗氧化方面的研究及開發利用奠定基礎，為大果木姜子的合理開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大果木姜子（Merr.）貴州省黔西南州冊亨縣雙江鎮林木村，經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定，該品為樟科樟屬植物米槁（C）的干燥成熟果實；維生素C（純度≥99.0%）成都第一制藥有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，純度≥97.0%）梯希布（上海）化成工業發展有限公司；無水乙醇（乙醇質量分數≥99.7%）天津市富宇精細化工有限公司。

6890-5975C 型氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；JM·A1002 型電子天平 余姚紀銘稱重校驗設備有限公司；RRH-A1000 型高速多功能粉碎機 上海綠沃工貿有限公司，RE-2000A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；ZNHW 型數顯電熱套 上海力辰邦西儀器科技有限公司；GG-17 揮發油測定器 蜀牛玻璃儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大果木姜子揮發油的提取 按2020 版《中國藥典》（四部）通則2204“揮發油測定法甲法”提取大果木姜子揮發油。取供試品20 g，粉碎至顆粒度為35 目，以水為提取溶劑在一定料液比下浸泡一段時間，在一定的電熱套功率下提取一定時間后，靜置1 h，于揮發油測定器下端緩慢放掉水層，于水油交界處開始收集揮發油，以13000 r/min 離心10 min 使油水分離后，采用移液槍吸取上層油相，即得大果木姜子揮發油。

1.2.2 大果木姜子揮發油提取工藝的單因素實驗

1.2.2.1 浸泡時間對得率的影響 精密稱取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比為1:7（g/mL），浸泡時間分別為0、1、2、3、4、5 h，在電熱套功率為100 kW下提取8 h，靜置1 h 后分離揮發油，考察浸泡時間對揮發油得率的影響。

1.2.2.2 提取功率對得率的影響 精密稱取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比為1:7（g/mL），浸泡3 h，分別在電熱套功率為60、100、140、180、220 kW 下提取8 h，靜置1 h 后分離揮發油，考察不同提取功率對揮發油得率的影響。

1.2.2.3 料液比對得率的影響 精密稱取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比分別為1:3、1:4、1:5、1:6、1:7（g/mL），浸泡3 h，在電熱套功率為100 kW 下提取8 h，靜置1 h 后分離揮發油，考察不同料液比對揮發油得率的影響。

1.2.2.4 提取時間對得率的影響 精密稱取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比為1:7（g/mL），浸泡3 h，在電熱套功率為100 kW 下提取，提取時間分別為2、4、6、8、10、12 h，靜置1 h 后分離揮發油，考察不同提取時間對揮發油得率的影響。

1.2.3 響應面優化試驗 大果木姜子中油類成分含量高，物料顆粒過細將無法過篩，故固定物料顆粒度為35 目。選取浸泡時間（A）、料液比（B）和提取時間（C）作為Box-Behnken試驗設計的3 個因素，以大果木姜子揮發油得率為響應值，結合響應面法的設計原理，設計三因素三水平的響應面試驗，因素水平表見表1。

表1 大果木姜子揮發油響應面因素水平表Table 1 Response surface factor level table of the volatile oil of Litsea lancilimba Merr.

1.2.4 大果木姜子揮發油得率的計算 設定揮發油質量為m，藥材樣品質量為m。大果木姜子揮發油得率按下式計算：

式中：W 表示大果木姜子揮發油得率，%；m表示大果木姜子揮發油重量，g；m表示大果木姜子重量，g。

1.2.5 GC-MS 分析條件 色譜條件：色譜柱為HP-5 MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫70 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升溫至190 ℃，以10 ℃/min 升溫至310 ℃，運行時間：54 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓18.34 psi，載氣流量1.0 mL/min；分流進樣，分流比：50:1；溶劑延遲時間：6 min。

質譜條件：離子源為EI 源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1953 V；接口溫度280 ℃；質量范圍29～500 amu。

1.2.6 DPPH 自由基清除試驗 將大果木姜子揮發油用無水乙醇配制成濃度為0.5、1、1.5、2、4、6、8、10 mg/mL 八個濃度，各取2 mL，加入0.080 mg/mL的DPPH·貯備液2 mL，搖勻，避光靜置30 min 后，以無水乙醇為參比液，測定反應體系在波長517 nm處的吸光度（A），同時測定2 mL DPPH·溶液與等體積無水乙醇混合液的吸光度（A）及2 mL 試樣液與等體積無水乙醇混合液的吸光度（A），維生素C 作為陽性對照（濃度分別為0.5、1、1.5、2、4、6、8、10 μg/mL）。

DPPH 自由基清除率按下式來計算：

1.3 數據處理

采用Excel 2010、SPSS 23.0、Prism 8.0.1 進行數據統計分析，0.05 表示差異顯著，0.01 表示差異極顯著，所有數據均表示為平均值±標準差。Design-Expert V8.0.6 軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 浸泡時間對得率的影響 結果見圖1：不同浸泡時間下揮發油得率存在顯著性差異（＜0.05）。浸泡時間在0～3 h 之間時，揮發油得率隨著時間的延長而增加，2 h 和3 h 之間存在顯著性差異；當浸泡時間≥3 h 時，揮發油的得率達到最高，為10.44%，各組之間無顯著性差異，得率不再隨時間的延長而增加?？赡苁怯捎诖藭r浸提液已經達到飽和狀態，再繼續浸提會使雜質成分溶出，與揮發油競爭溶出空間導致得率下降。考慮到實驗時間及成本，故在做響應面試驗時，選取浸泡時間為0、2.5 和5.0 h 三個水平。

圖1 浸泡時間對大果木姜子揮發油得率的影響Fig.1 Effect of soak time on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.1.2 提取功率對得率的影響 結果見圖2：電熱套不同提取功率下揮發油得率無顯著性差異（＞0.05）。當電熱套提取功率＞100 kW 時，揮發油得率呈現逐漸降低的趨勢，可能是隨著提取功率的增大，局部提取溫度升高，導致部分揮發油成分被破壞，得率下降。但總體變化較小，表明提取功率對揮發油得率的影響不大。因此后續實驗固定提取功率為100 kW。

圖2 提取功率對大果木姜子揮發油得率的影響Fig.2 Effect of extraction power on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.1.3 料液比對得率的影響 結果見圖3：不同料液比下揮發油得率存在顯著性差異（＜0.05）。隨著料液比的增加，揮發油的得率出現先增加后減小的趨勢。當料液比為1:5、1:6 g/mL 時，揮發油的得率達到最高，繼續增加料液比，揮發油的得率呈現下降趨勢，可能是因為在一定的料液比范圍內，揮發油的浸出傳質系數升高，但當料液比過大時，反而減慢了揮發油的擴散速度。結合實際情況，在做響應面試驗時，選取料液比1:2、1:4 和1:6 g/mL 作為三個水平。

圖3 料液比對大果木姜子揮發油得率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.1.4 提取時間對得率的影響 結果見圖4：不同提取時間下揮發油得率存在顯著性差異（＜0.05）。隨著提取時間的增加，得率逐漸增加。當提取時間為8 h時，增幅變緩；當提取時間≥10 h 時，得率不再增加，可能是因為此時揮發油溶液趨于飽和，繼續提取反而導致揮發油中的成分損失。考慮到提取時間為8 h后的得率增幅較小，結合實際提取成本，選取浸泡時間6、8 和10 h 作為三個水平。

圖4 提取時間對大果木姜子揮發油得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面優化結果及分析 以浸泡時間、料液比和提取時間為自變量，大果木姜子的揮發油得率為因變量，采用Design-Expert 軟件對各因素回歸分析，以確定大果木姜子揮發油的最優提取工藝，結果見表2。

表2 大果木姜子揮發油響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface experiment design and results of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.2.2 響應面方差結果分析 模型＜0.01，表明回歸模型極顯著。失擬項＞0.05，表明失擬項不顯著。從值可以看出，在所選的各因素水平范圍內，料液比對揮發油得率的影響最大，提取時間影響次之，浸泡時間的影響最小。在此模型中，一次項B、二次項A、B和C、交互項AC 對結果影響極顯著（＜0.01），一次項A、C 對結果影響顯著（＜0.05），其他各項均對試驗影響不顯著，提示各試驗因子與響應值不是簡單的線性關系。對各因素進行擬合，得到二次回歸方程：Y=10.27+0.30A+0.39B+0.32C+0.16AB-0.49AC+0.23BC-0.51A-0.85B-0.60C。模型中回歸方程的決定系數=0.9536，校正測定系數adj=0.8939，說明模型精確度高，試驗設計可靠，可準確地對試驗結果進行預測和分析，變異系數CV=2.87%，表明試驗結果與真實值存在2.87%的偏差，模型可靠性較高。噪音信號比為10.824（＞4），說明本模型能真實地反映實驗結果。結果見表3。

表3 大果木姜子揮發油響應面方差分析Table 3 Response surface variance analysis of volatile oil of Litsea lancilimba Merr.

2.2.3 因素間的交互作用 三維響應面圖曲線越陡，顯示得率受該因素影響越大；反之，曲線越緩，表明得率受該因素影響越小。等高線圖橢圓表示該兩兩因素對實驗結果影響較重，若較圓的話則影響較小。由圖5 可見浸泡時間和提取時間的等高線圖呈橢圓形，三維響應面圖曲線較陡，表明二者的交互作用對得率的影響明顯。提取時間與料液比交互作用對揮發油得率的影響次之，料液比和浸泡時間交互作用對揮發油得率的影響最小。

圖5 各兩因素交互影響揮發油得率的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface diagram and contour diagram of the interaction of two factors affecting volatile oil yield

2.3 大果木姜子揮發油提取工藝的驗證

通過Design-Expert 8.0.6 對回歸方程求解，結合實際生產需要確定大果木姜子揮發油的最佳提取條件為浸泡時間5 h，料液比1:5 g/mL，提取時間8 h，此條件下得率的理論值為10.15%。按照上述響應面軟件分析的大果木姜子揮發油的最佳提取工藝平行提取5 次，其得率分別為10.64%、10.80%，10.54%、11.08%、10.29%，平均得率為10.67%，與預測值10.15%差距較小，RSD 為0.29%，表明該實驗提取工藝穩定可靠。

2.4 GC-MS 分析大果木姜子揮發油成分

對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist 17 和Wiley 275 標準質譜圖，確定各化學成分，用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對質量分數。大果木姜子揮發油中共分離得到81 個化合物，最終鑒定出74 個化合物，主要包括烴類（27 種）、醇類（19 種）、酮類（10 種）、酯類（4 種）、醛類（3 種）、萜類（3 種）、酸類（2 種）、酚類（2 種）、其它（4 種），占總揮發油的93.175%。總離子流圖見圖6，分析結果見表4。

圖6 大果木姜子揮發油GC-MS 總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

表4 大果木姜子揮發油化學成分及含量Table 4 Chemical constituents and contents of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

續表 4

由大果木姜子揮發油各成分相對含量可知以烴類（23.729%）、萜類（22.129%）、醇類（16.77%）、酸類（16.627%）成分為主。其中1,8-桉葉素的含量達到了21.854%，其它相對含量高于3%的分別為正癸酸（12.893%）、-蒎烯（4.873%）、對傘花烴（4.579%）、-蒎烯（4.452%）、月桂酸（3.734%）、-萜品烯醇（3.188%）。文獻報道1,8-桉葉素、月桂酸、-蒎烯均具有抑菌作用，其中月桂酸及其酯類是食品和化妝品中最有效的抗菌劑。-萜品烯醇則具有平喘抗炎的效果。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取得到的大果木姜子揮發油中1,8-桉葉素、月桂酸、-蒎烯含量明顯高于其它文獻所報道（其它文獻報道1,8-桉葉素最高含量為9.87%，月桂酸最高含量為3.184%，-蒎烯最高含量為1.012%），上述分析表明該產地大果木姜子揮發油可能具有較好的抑菌平喘效果。

2.5 大果木姜子揮發油成分的DPPH 自由基清除能力

不同濃度的大果木姜子揮發油對DPPH 自由基的清除率見圖7。結果表明大果木姜子揮發油抗氧化活性隨質量濃度的增加而逐漸升高，在質量濃度達到6.0 mg/mL 后對DPPH 自由基清除率的增幅變緩，當質量濃度為10.0 mg/mL 時，樣品清除率為95.80%，此時的抗氧化能力接近于質量濃度為6 μg/mL 的V。采用Prism 8.0.1 計算得其IC值為0.2434 mg/mL，結果表明大果木姜子揮發油對DPPH 自由基具有較好的清除能力，說明其具有一定的體外抗氧化活性。有文獻報道，1,8-桉葉素、-蒎烯等均具有較高的抗氧化活性，推測這些成分可能與大果木姜子揮發油的抗氧化活性有一定的關系。

圖7 大果木姜子揮發油及維生素C 對DPPH·的清除作用（n=3）Fig.7 DPPH·scavenging test results of Vc and Litsea lancilimba Merr.volatile oil (n=3)

3 結論

本實驗采用響應面法確定了大果木姜子揮發油最優提取工藝為浸泡時間5 h，料液比1:5 g/mL，提取時間8 h，得率可達10.67%，與理論值比較無顯著性差異，表明該提取工藝穩定可行，提高了大果木姜子揮發油的得率。對該產地的大果木姜子揮發油化學組成及相對含量進行了分析，共鑒定了74 種成分，占總揮發油量的93.175%，主要為烴類（23.729%）、萜類（22.129%）、醇類（16.77%）、酸類（16.627%），為后續大果木姜子揮發油生物活性研究提供了依據?？寡趸饔醚芯勘砻鞔蠊窘訐]發油對DPPH 自由基的具有較好的清除作用，具有一定的抗氧化活性。后續將繼續對大果木姜子揮發油進行更為全面的抗氧化作用研究，同時進行量效相關性分析，以期得到具有較強抗氧化作用的天然活性成分。