低頻電場冰溫保鮮對蝦的水分遷移規律及品質變化的影響

余 銘，梁鉆好，陳海強，梁鳳雪，敖菲菲，鄧錦杰

（1.陽江職業技術學院食品與環境工程系，廣東陽江 529566；2.廣東省食品低溫加工工程技術研究中心，廣東陽江 529566）

南美白對蝦（），又稱凡納濱對蝦，對蝦科、濱對蝦屬動物，原產于中、南美洲太平洋沿岸的溫暖水域，與斑節對蝦、中國對蝦并列為世界三大養殖蝦類，也是我國重要的養殖蝦類。2019 年全國養殖產量超180 萬噸，其中廣東占比35%，位居全國第一。由于對蝦水分含量極高，蛋白質豐富，內源性蛋白酶活性強，離水后存活時間較短，通常以冷藏或冷凍的形式保鮮。但冷藏（0～4 ℃）溫度相對較高，水產品貨架期短；冷凍（通常為-18 ℃）食品解凍后汁液流失嚴重，品質下降。

冰溫保鮮是一種中間溫度帶保鮮方法，指將食品置于0 ℃～凍結點溫度區域保持不凍結狀態，它既可以避免因凍結導致的一系列質構劣變現象，又能像冷藏那樣保持高度新鮮狀態，同時貨架期更長，適用于果蔬、肉類及多種水產品的保鮮。如，冰溫保鮮（-1.5 ℃冰水）相比冷藏保鮮（1.5 ℃冰水）可有效降低北極甜蝦貯藏期間的菌落總數，抑制總揮發性鹽基氮（TVB-N）和三甲胺的生成，明顯延長微生物的生長滯后期；0 ℃冰溫貯藏三疣梭子蟹，其TVB-N、總活菌數和K 值的變化速率均慢于冷藏，保質期延長1～2 d。然而冰溫保鮮技術存在一定的推廣難度。因為其溫度本就介于凍結和非凍結的臨界點，但當設備溫度波動范圍達不到要求時，可能會導致食品表面甚至內部產生冰晶，表面冰晶在溫度波動情況下極易融化，那么冰晶對細胞的機械破壞就會加速食品的汁液流失和質構下降。因此，冰溫保鮮技術對設備的溫控要求非常嚴格，一方面提高了技術成本；另一方面溫控精度較高的情況下壓縮機頻繁啟動也會增加耗電等經濟成本。

本研究引入低頻電場（Low Frequency Electric Field,LFEF）的概念（低頻的頻率范圍為≤300 kHz）。低頻電場與食品中的水分子發生共振，會干擾水分子之間氫鍵的形成及穩定，從而抑制食品內部水分結冰。基于此原理，低頻電場應用于食品冰溫保鮮，在設備溫度波動較大的情況下避免食品中水分的凍結，從而有望降低冰溫保鮮對溫控的要求。此外，電場對食品品質必然有一定的影響，如通過抑制微生物與酶的活性而延緩微凍帶魚、冷藏牛肉貯藏過程中的品質變化。本研究以南美白對蝦為研究對象，在冰溫保鮮過程中施加低頻電場，分析對蝦品質的變化，同時結合低場核磁共振技術（LF-NMR）追蹤保鮮過程中對蝦的水分狀態、分布和遷移變化規律，探究低頻電場輔助冰溫保鮮對蝦延長貨架期的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦（海水養殖）陽江市場；鹽酸、硼酸、氧化鎂、氯化鈉（分析純）天津市福晨化學試劑廠；平板計數瓊脂 廣東環凱微生物科技有限公司。

低頻電場發生器 實驗室自主設計；MesoMR23-040V-I 核磁共振成像分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；EVO MA 15 掃描式電子顯微鏡 德國ZEISS；ATN-300 全自動凱氏定氮儀 上海洪紀儀器設備有限公司；LAB 254e 電子精密天平 艾德姆衡器（武漢）有限公司；ZD-85 恒溫震蕩器 常州澳華儀器有限公司；LHS-250CL 恒溫恒濕箱 上海齊欣科學儀器有限公司；SPX-250BIII 生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對蝦保鮮 根據蝦的凍結點-2.5～-2.0 ℃，設定保鮮溫度為（-1±1）℃，即0 ℃至凍結點的溫域。選取大小一致（質量12～16 g）的鮮活對蝦4 ℃預冷1 h，隨機分成2 組，分別進行常規冰溫保鮮（對照）和低頻電場輔助冰溫保鮮，定期取樣檢測。具體分組情況如下：

冰溫：-1 ℃普通恒溫恒濕箱（溫控精度為0.1 ℃，溫度波動±1 ℃，濕度50%）；

LFEF+冰溫：-1 ℃低頻電場恒溫恒濕箱（溫控精度為0.1 ℃，溫度波動±1 ℃，工作頻率50 Hz，工作電壓3000 V）。

1.2.2 低頻電場恒溫恒濕箱的制作 低頻電場恒溫恒濕箱如圖1 所示，恒溫恒濕箱艙體內部上下端平衡放置兩塊發射器，恒溫恒濕箱外部的低頻電場發生裝置通過傳導線與箱內發射器鏈接，通電后即可運作。其中，低頻電場發生裝置依據本團隊的授權專利進行組裝，裝置內由輸入控制模塊、電場信號發生模塊、輸出控制模塊、電場發生模塊和安全保護模塊組成。

圖1 低頻電場恒溫恒濕箱Fig.1 Constant temperature and humidity box with low frequency electric field

1.2.3 理化指標測定 對蝦去頭、殼、蝦線，蝦肉攪碎后用于測定總揮發性鹽基氮和菌落總數。

總揮發性鹽基氮，參照GB 5009.228-2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》中的半微量滴定法進行測定；菌落總數，參照GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行測定。

1.2.4 電鏡掃描分析 參照Chen 等的方法，將對蝦樣品去頭、殼，取第2 腹節2～3 mm 的樣品用2.5%戊二醛固定12 h，然后用0.1 mol/L PBS 緩沖液（pH 7.2）浸泡10 min。依次使用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇對固定樣品脫水10 min，最后用CO作為流體對樣品進行臨界點干燥。檢測前將樣品貼于有導電膠的檢測臺上，噴金30 s，使樣品表面噴金約10 nm 厚后進行檢測。

1.2.5 低場核磁共振的測定及其成像分析 對蝦分別取蝦頭和第1～3 腹節（靠近蝦頭部位算起，帶殼）作為測試對象，濾紙吸干表面水分，稱重，用保鮮膜包好，進行核磁共振測試，測試方法和成像分析參照Chen 等的方法進行。

測試方法：放入玻璃試管（口徑40 mm），然后將樣品管置于核磁探頭中，使用CPMG 序列測試橫向弛豫時間T。其中，參數設置如下：磁體溫度32 ℃；重復采樣等待時間TW=3500.00 ms；重復采樣次數NS=4；回波時間TE0.15 ms；回波個數NECH=10000；采樣帶寬SW=200 kHz。模擬增益RG1=20.0 db；數字增益DRG=3；前置放大器增益PRG=2。

MPI 成像分析，參數設置：層數=1；層厚=6.0 mm；視野FOV=100 mm×100 mm；重復采樣次數Average=2；重復采樣等待時間TR=1100.00 ms；回波時間TE=18.125 ms。

1.3 數據處理

每個實驗重復3 次，數據用平均值±標準差表示。試驗數據采用Execl 2010 進行處理，并用Origin 8.0 進行單因素方差分析和Fisher LSD 多重比較。

2 結果與分析

2.1 LFEF+冰溫保鮮對蝦肉菌落總數的影響

冰溫保鮮期間蝦肉菌落總數如圖2 所示，貯藏前期，菌落總數隨時間增加無顯著性變化，而且兩種保鮮方式之間也無顯著差異（＞0.05）。貯藏6 d 后，菌落總數開始增加，其中常規冰溫保鮮的蝦肉菌落總數增加得更快；第9 d 時，二者之間已有顯著差異（＜0.05）；貯藏第12 d，LFEF+冰溫組的菌落總數比常規冰溫組低1 個數量級。

圖2 冰溫保鮮過程中蝦肉菌落總數的變化Fig.2 Changes of TVC on prawn during CFPS

Fojt 等的研究發現，頻率為50 Hz 的低頻電磁場即可對大腸埃希菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有殺滅作用。本研究的對蝦貯藏后期，LFEF+冰溫組的菌落總數顯著低于對照組（＜0.05），也證明了低頻電場對微生物的繁殖有抑制作用。在一定的電場條件刺激下，腐敗菌細胞膜內外電勢發生改變，導致微生物活力顯著降低。

2.2 LFEF+冰溫保鮮對蝦肉TVB-N 的影響

如圖3 所示，兩種保鮮方式的對蝦TVB-N 含量變化趨勢一致，均為TVB-N 含量在保鮮前期緩慢上升，后期急劇增加，轉折點在第9～11 d。0～9 d，常規冰溫保鮮的蝦肉TVB-N 含量相對平穩在9～20 mg/100 g 范圍內，略大于LFEF+冰溫保鮮的蝦肉；第9 d時其含量增加速率明顯增大，第11 d 時TVB-N 含量（29.77±2.84）mg/100 g，已接近國標GB 2733-2015對海水魚蝦總揮發性鹽基氮含量的限值（≤30 mg/100 g）；此后TVB-N 含量繼續猛增。而LFEF+冰溫保鮮的蝦肉中TVB-N 含量在第11 d 才開始迅速增加，第16 d含量超標至（35.39±1.50）mg/100 g。可見，低頻電場對冰溫保鮮蝦肉中TVB-N 的產生有顯著影響（＜0.05），可明顯延緩腐敗。

圖3 冰溫保鮮過程中蝦肉TVB-N 含量的變化Fig.3 Changes of TVB-N content on prawn during CFPS

總揮發性鹽基氮的產生是由于微生物和內源性蛋白酶對蝦肉蛋白分解產生的含氮物質，低頻電場對蝦肉中TVB-N 的延緩產生的作用機制與低頻電場降低內源性蛋白酶的活性有關，也可能是由于電場對微生物繁殖的抑制作用。本研究從2.1 中也得出了低頻電場有利于降低菌落總數的結論。段偉文等也發現施加電場有利于延緩對蝦冰溫保鮮期間TVB-N 含量的增加。相關研究在牛肉、帶魚中也有類似效果。

2.3 LFEF+冰溫保鮮對蝦肉微觀結構的影響

對蝦保鮮11 d 后進行電鏡掃描分析，并與新鮮對蝦樣品作對照，結果如圖4 所示。鮮樣蝦肉肌纖維束緊密結合，排列致密，放大到4000X 倍數下部分區域仍可見均勻、有序、蜂窩狀的三維網絡結構。貯藏11 d 的常規冰溫保鮮蝦肉肌纖維間隙增大，4000X的放大倍數下更是明顯可見的松散結構。這種大而無序的空隙不利于細胞質水的保留以及彈性、硬度、咀嚼性等質構的形成。而且松散結構與貯藏過程中肌原纖維蛋白的降解和變性也有密切關系，肌原纖維蛋白和肌基質蛋白含量在0 ℃附近溫度儲藏過程中會明顯下降，導致肌纖維束減少。LFEF+冰溫保鮮的蝦肉肌纖維致密程度略差于鮮樣的，肌纖維排列出現混亂現象，孔隙增加，但空隙較小而密集，松散程度明顯小于常規冰溫保鮮。電場輔助低溫保鮮在其它水產品中也有應用。王杏娣等研究認為低壓靜電場的添加可以減緩微凍貯藏時竹節蝦理化性質的變化程度，降低對肌肉組織結構的破壞程度；張家瑋等利用電場輔助微凍保鮮帶魚，也證實了電場可明顯削弱微凍貯藏過程對帶魚肌肉組織結構的破壞程度。

圖4 蝦肉縱切面電鏡掃描圖Fig.4 SEM chart of the longitudinal section of prawn

2.4 LFEF+冰溫保鮮對蝦水分分布情況與遷移規律

2.4.1 LFEF+冰溫保鮮蝦肉部位水分分布與遷移采用低場核磁共振技術采集蝦肉水分子氫質子信號，通過橫向弛豫時間T反向表征氫質子的自由度及其所受束縛力，兩種保鮮方式得到的蝦肉橫向弛豫時間T反演圖如圖5（A、B、C）所示。蝦肉 T反演圖有 4 個峰，分別標記為 T、T、T、T。其中，T（0.02～0.66 ms）為強結合水，T（0.5～5.0 ms）為弱結合水，T（10～115 ms）為不易流動水T170～950 ms）為自由水。貯藏期間，兩種保鮮方式的蝦肉第3、7、11 d 的T反演圖與鮮樣（第0 d）的接近，二者之間也無顯著差異，但貯藏第15 d 時，常規冰溫組的T峰面積顯著降低（圖5A）。對比兩種保鮮方式的蝦肉第15 d 的T反演圖（圖5C）發現，結合水含量（T和T峰面積）無明顯變化，但其T峰面積確實有明顯差異，這部分水為不易流動水，對食品品質有重要影響。常規冰溫保鮮組的不易流動水含量在貯藏第15 d 時相比鮮樣下降1.8%，比LFEF+冰溫組顯著下降約2.5%（圖5D）。

圖5D 顯示，蝦肉中約92%的水是以不易流動水的形式存在的，即肌原纖維細胞間質和肌原纖維細胞內的水。不易流動水的損失表明冰溫保鮮過程中微生物作用、蝦肉自溶、生化反應在悄然進行，最終導致肌纖維結構破壞、持水率下降、汁液流失；此外，冰溫保鮮溫度本就介于凍結和非凍結的臨界點，但當設備溫度波動范圍達不到要求時，可能會導致冰晶的產生。當冰晶融化后會導致部分不易流動水的遷移和變化。基于以上兩點，低頻電場輔助冰溫保鮮改善蝦肉品質的機制為：一方面通過抑制微生物生長（2.1）、延緩生化反應（2.2）以及降低內源性蛋白酶的作用，使蝦肉細胞在一段時間內免于自溶，保持肌肉細胞的完整性和持水能力；另一方面通過誘導蝦肉肌纖維內水分子發生共振，抑制結冰，避免大冰晶凍融現象對細胞和肌肉纖維的破壞，從而減少保鮮過程中蝦肉不易流動水的遷移和變化。

圖5 冰溫保鮮對蝦蝦肉部位的橫向弛豫時間T2 反演圖（A、B、C）和不易流動水含量變化（D）Fig.5 Refutation graph of transverse relaxation time T2 (A,B,C) and change of immobilized water content (D) on prawn meat during CFPS

2.4.2 LFEF+冰溫保鮮蝦頭部位水分分布與遷移圖6 為貯藏期間蝦頭部位的橫向弛豫時間T反演圖，貯藏第3、7、11、15 d，T反演圖中的T峰（不易流動水）不斷變小、右移動，T峰（自由水）不斷變大變明顯，即不易流動水向自由水轉移，蝦頭部位在貯藏期間的腐敗程度越來越嚴重。

圖6 冰溫保鮮對蝦蝦頭部位的橫向弛豫時間T2 反演圖Fig.6 Refutation graph of transverse relaxation time T2 on prawn head during CFPS

相比鮮樣，貯藏第3 d，蝦頭部位的不易流動水就已經有明顯的遷移，但是兩種保鮮方式的對蝦蝦頭T反演圖重疊性良好，無顯著差異。貯藏第7 d（圖6B），兩種保鮮方式的對蝦蝦頭T反演圖開始出現明顯差異，相比LFEF+冰溫保鮮組，常規冰溫保鮮對蝦蝦頭部位的T峰面積減少得更多，T峰變得更明顯；貯藏第11 d（圖6C），蝦頭部位的T和T峰已經混為一體（以下稱混合峰），常規冰溫保鮮對蝦的混合峰頂點在230～270 ms 之間，自由水偏多，而LFEF+冰溫保鮮組的混合峰頂點在70 ms 附近，以不易流動水偏多；貯藏第15 d（圖6D），常規冰溫保鮮對蝦的自由水含量繼續明顯增加，LFEF+冰溫保鮮組的自由水含量也略有增加，但增幅明顯比常規冰溫組小。可見，蝦頭部位從保鮮第3 d 開始就出現明顯變化，第7 d 時低頻電場可有效提高蝦頭的冰溫保鮮效果。

對比蝦肉和蝦頭的T反演圖能明顯看出，蝦肉在貯藏第11 d 甚至第15 d（LFEF+冰溫組）的T反演圖還是與鮮樣有良好重疊性，但蝦頭部位從貯藏第3 d 開始就出現明顯變化。這是因為蝦頭部位的酶活性較其它部位要強得多，因此蝦頭最先出現腐敗變質現象。而低頻電場通過抑制酶活，在冰溫保鮮期間有利于延緩蝦頭腐敗。

2.5 LFEF+冰溫保鮮對蝦的蝦頭MRI 成像分析

冰溫保鮮期間蝦頭部位的MRI 成像偽彩圖如圖7 所示，顏色的深淺代表氫質子密度引起的弛豫時信號強弱差別。圖中顯示，大部分水集中在蝦頭中心的蝦膏（蝦肝）部位，由于氫質子密度大，表現為很深的暗紅色，蝦肝附近往外擴散為黃色、綠色、天藍色，水分含量逐漸降低。貯藏期間，紅色部位逐漸擴散，水分流動性增大，逐漸由中心部位分散到蝦頭各個部位，即水分發生遷移和變化，自由水含量增加；直至貯藏第15 d，常規冰溫保鮮的對蝦幾乎整個蝦頭都變紅了，表明蝦頭蝦肝部位自溶嚴重。相比之下，LFEF+冰溫保鮮組的蝦頭水分遷移程度略低（紅色部位擴散程度相對較小），直觀證明了低頻電場有利于延緩冰溫保鮮對蝦蝦頭的腐敗自溶。

圖7 冰溫保鮮對蝦貯藏期間蝦頭部位的MRI 成像偽彩圖Fig.7 MRI pseudocolor images of prawn head during CFPS

新鮮對蝦蝦膏細胞膜完整，包裹著細胞內水和細胞間質水（不易流動水）。冰溫貯藏期間蝦頭水分的明顯遷移一方面源于蝦死后蝦頭異常活躍的內源性蛋白酶作用導致的細胞自溶現象；另一方面源于溫度的輕微波動導致的反復凍融，冰晶成長對細胞膜造成的機械破壞導致細胞膜破裂，不易流動水流失。低頻電場在降低酶活和抑制結冰這兩方面的作用，對延長冰溫保鮮對蝦貨架期有利。

3 結論

以常規冰溫保鮮技術為對照，采用低頻電場輔助冰溫保鮮對蝦，監測貯藏期間對蝦的菌落總數和TVB-N 含量變化，分析微觀結構變化，通過LF-NMR技術探究貯藏期間蝦肉和蝦頭的水分遷移和變化規律，得出如下結論：a.低頻電場可明顯延緩冰溫保鮮對蝦貯藏后期的微生物繁殖速率和TVB-N 含量的增加速率，延長貨架期，一定程度上維持蝦肉肌纖維的網狀結構；b.低場核磁共振分析，貯藏期間的蝦肉T反演圖與鮮樣的高度重疊，常規冰溫保鮮組的不易流動水含量在第15 d 顯著下降（＜0.05），而低頻電場冰溫保鮮組無明顯變化。蝦頭部位的不易流動水在貯藏第3 d 已有明顯的遷移，但兩種保鮮方式之間無顯著差異（＞0.05）；隨著貯藏時間的延長，蝦頭的不易流動水含量持續下降，自由水含量增加，但低頻電場冰溫保鮮組的水分遷移速率低于對照組。蝦頭部位的MRI 成像結果與T反演圖變化規律一致；c.腐敗最先發生在蝦頭部位，其次從蝦肉的理化指標體現，蝦肉的水分遷移變化稍有延遲。綜合理化指標變化和水分遷移規律，表明施加低頻電場后，有利于延長對蝦冰溫保鮮的貨架期3～5 d。