外源γ-氨基丁酸對鮮切南瓜品質和γ-氨基丁酸代謝的影響

梁靜宜，郭 凡，趙 科，王鴻飛，許 鳳

（寧波大學食品與藥學學院，浙江寧波 315800）

-氨基丁酸作為一種自由態的四碳非蛋白氨基酸，廣泛分布在自然界的原核生物和真核生物中，是哺乳動物中樞系統抑制性神經遞質，參與腦循環，具有降低神經元細胞活性、防止動脈硬化、改善肝功能和降低血壓等作用。在植物體內合成GABA 有兩條代謝途徑，主要由谷氨酸在GAD 的催化下生成GABA，由GABA-T 催化GABA 進入三羧酸循環中，這條代謝途徑被稱為GABA 支路。GABA 在多胺降解途徑中通過二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）兩種關鍵酶催化多胺（腐胺（Putrescine，Put）、精胺（Spermine，Spm）、亞精胺（Spermidine，Spd））后，再由4-氨基丁醛脫氫酶（Aminoaldehyde decarboxylase，AMADH）將其氧化生成GABA 留在植物體內。

研究發現，GABA 參與植物C/N 營養平衡、植物微生物相互作用、抵御蟲害、響應生物和非生物脅迫以及作為細胞內信號分子調控傳導等活動。當生物體在處于鈉鹽、低氧、機械損傷等脅迫條件下時，會產生應激反應，富集大量GABA 來提高自身的抗逆性，從而更好地適應環境。機械損傷下獼猴桃和胡蘿卜體內會迅速合成大量的GABA，響應非生物脅迫。近年大量關于GABA 外源應用的研究指出，GABA 用于水果或蔬菜的采后處理，可以有效緩解生物或非生物脅迫的影響。

南瓜富含多種氨基酸和維生素，具有預防糖尿病、溶解結石以及催化分解致癌物質等作用，且價格低廉，已然成為食品界的新寵。近年來，由于快餐和方便食品行業的迅速發展，鮮切產品吸引了大量消費者的關注。鮮切南瓜因其營養高，味道好和便利性更是受到消費者的廣泛青睞。然而，南瓜受到由加工處理（如去皮、修剪和切割）導致的組織分解引起的損傷，難免會發生表皮微生物侵染、營養損失、質地軟化和顏色變化等情況，降低鮮切產品的潛在經濟價值。因此，需要研究一種方法來抑制鮮切南瓜品質變化，同時保證產品健康安全。以往對GABA 的研究主要集中在代謝層面上，然而，GABA 對鮮切南瓜品質的影響與否尚不清楚。本文通過外源GABA 和GABA 合成抑制劑（3-巰基丙酸，3-MP）處理研究其對鮮切南瓜中GABA 代謝和品質的影響。主要測定不同處理下鮮切南瓜中谷氨酸、GABA 和多胺含量，GAD、GABA-T、PAO、DAO、AMADH 活性以及相關基因表達水平和品質指標，以解決鮮切南瓜貯藏期間品質變化的相關問題，為鮮切南瓜GABA 富集工藝轉化提供重要的理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗選用新鮮南瓜（貝貝南瓜）為供試材料，購買于京東商場，挑選大小均勻，表面無病蟲害和機械損傷；GABA 標準品（98%）、甲醇（色譜純）Sigma-Aldrich 公司；3-巰基丙酸（3-Mercaptopropionic acid，3-MP）、谷氨酸脫氫酶（1 U/mL）分析級，麥克林；氯化鑭、-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（-NAD+）分析級，阿拉丁；Tris-HCl 溶液 分析級，上海生工；腐胺、精胺、亞精胺標準品 分析純（T≥98%），上海源葉生物科技有限公司；植物總RNA 提取試劑盒 成都福際生物技術有限公司；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent HiScript? Ⅱ QRT SuperMix for qPCR（+Gdna Wiper）試劑盒、ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix 試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為國藥分析純。

AFX-2001-U 超純水機 上海純浦實業有限公司；SYNAPT G2 超高效液相色譜儀 美國Water 公司；UV-3200 型紫外分光光度計 上海普美達；Mastercycler nexus PCR 儀 Eppendorf 中國有限公司；A40426 實時熒光PCR 儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CR-400 型色差儀 柯尼卡美能達辦公系統（中國）有限公司；PAL-1 型數顯糖度計 日本愛宕ATAGO 公司；JXDC-200 型氮吹儀 拓赫機電科技（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 南瓜在0.02%（v/v）的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min 進行消毒，將其削皮去瓤后，切成長約5 cm，寬0.2 cm，高0.5 cm 左右的絲狀，并分別浸泡在80 mmol/L GABA 和80 mmol/L 3-MP 溶液中作為處理組（經過預實驗得到最佳處理濃度），以浸泡在蒸餾水中的南瓜絲作為對照組。浸泡10 min 后取出用濾紙擦去表面多余的液體并放置在塑料透明鮮切盒內，并置于4 ℃，相對濕度90%培養箱中貯藏，分別于0、3、6、9 h 取樣，用液氮快速冷凍，并置于-80 ℃冰箱中備用。在本實驗中，每個處理至少使用12 個南瓜。

1.2.2 品質指標測定 菌落總數測定參考食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定（GB 4789.2-2016），白度使用色差儀測定，隨機選取若干點測定樣品的顏色參數，得到白色系中的L值，白度值（White index,WI）的計算公式為：WI=100-[（100-）++]；可溶性固形物含量的測定采用郭丹等的方法，取10 g 的樣品與20 mL 的蒸餾水使用勻漿機混勻，取200 μL 的溶液放置在糖度計上測定，記錄數值；-胡蘿卜素含量的測定參考食品安全國家標準食品中胡蘿卜素的測定（GB/T 5009.83-2003）。

1.2.3 谷氨酸與GABA 含量的測定 谷氨酸含量的測定是在Al-Quraan 等的方法上稍作修改，將冷凍樣品用冰浴在3 mL 氯化鑭（0.05 mol/L）中進行提取。在0.5 mL 提取物中加入0.2 mL 的0.1 mmol/L Tris-HCl，0.1 mL 的7.5 mmol/L-NAD和1 U/mL谷氨酸脫氫酶后充分震蕩混合，然后將混合液30 ℃水浴孵育60 min，讀取波長為340 nm 時的吸光度。結果用mmol·kg來表示。計算公式如下：

GABA 含量的測定參照Hu 等的方法，在氯化鑭溶液中加入0.5 g 樣品進行萃取，在室溫下震蕩15 min后12000×g 離心5 min。取2 mL 上清液加入1 mol/L氫氧化鉀溶液，振蕩5 min 后12000×g 離心5 min。取0.4 mL 上清液依次加入800 μL 1 mmol/L 硼酸鹽緩沖液（pH9.0）、1 mL 體積分數為6%的苯酚和0.5 mL 5%的次氯酸鈉，混合均勻后沸水浴10 min，拿出后立即冰浴5 min。加入1 mL 體積分數為60%的乙醇，混勻后采用紫外分光光度法，在645 nm 處測定吸光度。結果用mmol·10 gFW 來表示。計算公式如下：

1.2.4 谷氨酸脫羧酶與GABA 轉氨酶活性的測定GAD 活性的測定參考Bartyzel 等的方法并稍加修改，稱取1.0 g 南瓜樣品，在冰浴條件下通過含有-巰基乙醇、PLP、EDTA 和甘油的磷酸鉀緩沖液研磨獲得勻漿。最大轉速離心10 min 后，取0.5 mL 粗酶液加入含有10 g/L 谷氨酸緩沖液，40 ℃下水浴2 h后通過沸水浴5 min 終止反應。用等量蒸餾水對照，在645 nm 下比色，測吸光度。每分鐘生成1 μmol的GABA 為GAD 活性為一個酶活力單位。

GABA-T 活性的測定參照Deewatthanawong等的方法并加以修改，取0.5 g 南瓜果肉，加入Tris-HCl 提取緩沖液研磨，離心獲得上清液即為酶液。取0.5 mL 酶液與緩沖液混合均勻后，放置30 ℃水浴中孵育1 h，加入磺基水楊酸后，再在25 ℃下孵育20 min 終止反應。在340 nm 處讀取吸光值，每30 s 記錄1 次，記錄5 min。以1 min 內OD降低0.01 為一個酶活力單位（U），活性表示為U·g。

1.2.5 多胺的測定 參照宋春波等所述的方法，將南瓜樣品在冰浴中加入3 mL 5%預冷的高氯酸進行均質研磨，12000×g 離心收集上清液。取2 mL 的上清液與2 mL 的NaOH（2 mol/L）和10 μL 的苯甲酰氯混合在37 ℃下孵育1 h，然后加入飽和NaCl溶液和乙醚，充分振蕩混合均勻。通過2000×g 低速離心后，將1 mL 有機溶劑相轉移至新管中，并用氮吹儀吹干。待乙醚蒸發后，加入500 μL 甲醇，充分震蕩得到待測定的多胺樣品。通過配備反相Sun Fire C色譜柱（150 mm×3.9 mm，4 μm）的高效液相色譜（HPLC）分析苯甲酰化后的多胺，色譜條件：柱溫30 ℃；流動相為甲醇和水（比例為64:36，v/v）；檢測波長為230 nm；流速0.7 mL/min，進樣量10 μL。

將Put、Spd 和Spm 3 種多胺分別配成1 mmol/L的標準貯備液，然后將這3 種標準貯備液分別苯甲酰化。將衍生化的母液稀釋形成不同濃度的多胺標準液（1、5、12.5、25、50 mmol/L）進樣，根據標品進樣量制作標準曲線，然后以峰面積計算多胺的含量。以鮮樣中的mg/kg 來表示。

1.2.6 胺氧化酶活性測定 參照Gao 等的方法測定DAO 和PAO 活性。取1 g 南瓜樣品與磷酸鉀緩沖液（pH6.5）冰浴研磨后，將樣品在4 ℃下12000×g離心，收集上清液。取0.5 mL 上清液加入磷酸鈉緩沖液（含有0.2 mL 顯色液，250 U/mL 辣根過氧化物酶溶液）。通過分別添加20 mmol/L 腐胺溶液以及精胺和亞精胺混合溶液，啟動反應來進行DAO 和PAO 測定，在555 nm 處測定吸光值。每30 s 記錄1 次，記錄5 min。以1 min 內OD降低0.01 為一個酶活力單位（U），活性表示為U·g。

AMADH 活性測定參照?ebela 等的方法稍作修改，取1 g 南瓜樣品，加入100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（2 mmol/L 二硫蘇糖醇，乙二胺四乙酸，10%蔗糖），12000×g 高速離心30 min，收集1 mL 酶液加入1 mL Tris-HCl 反應液和4-氨基丁醛溶液用以啟動反應，37 ℃條件下孵育10 min 后，在340 nm 處測定吸光值。每1 min 記錄1 次，記錄10 min。以1 min內OD降低0.01 為一個酶活力單位（U），活性表示為U·g。

熒光定量使用Vazyme ChamQ TM Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒，采用2法來計算相對表達量。內參基因采用（XM_023077371.1），5'-AAACCTTACCAGCCCTTGAC-3'（正 向）和5'-CGCTCGTTATAGGACTTGACC-3'（反向）（XM_023082806.1）為5'-CCGTCGAAGGCCGATATCAA-3'（正向）和5'-AGCTCATCTGCTCTCACTTCAC-3'（反向），實驗重復3 次。

1.3 數據處理

每次實驗進行三次生物學重復，使用SPSS18.0（SPSS，Chicago，IL，USA）統計軟件對試驗數據進行方差分析，采用Duncan’s Range Test（＜0.05）分析數據之間的差異性，數值以平均值±標準誤差表示。使用不同的字母表示同一貯藏時間處理方式之間存在顯著性差異，并用Origin 10.0 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源GABA 和3-MP 對鮮切南瓜品質的影響

在鮮切果蔬加工工藝中，切割過程容易導致呼吸強度增加，鮮切表面更容易受到微生物感染，保質期縮短，因此菌落總數是用來評價果蔬安全性和貨架期的重要指標。由圖1A 可知，在貯藏過程中，對照組和處理組中菌落總數無顯著差異（＞0.05）。在貯藏9 h 后，南瓜中的菌落總數均未超過10CFU·g，說明南瓜符合可食用和商業標準。白度作為衡量鮮切南瓜貯藏期間新鮮程度的重要指標之一。如圖1B 所示，鮮切和外源處理組WI 值均無明顯變化。另外，研究發現南瓜果實中含有豐富的-胡蘿卜素，使南瓜富含營養物質并呈現豐富鮮艷的顏色。胡蘿卜素的含量差異也會導致果肉發生顏色變化。由圖1D 可知，三組南瓜樣品中的-胡蘿卜素含量不存在顯著性差異（＞0.05）。根據WI 和-胡蘿卜素的數據趨勢可知，外源GABA 不會影響果肉的色澤，從而影響消費者的購買欲。可溶性固形物是影響果實風味和營養的主要成分。對照組和GABA 處理組的可溶性固形物含量在貯藏期間沒有顯著變化（＞0.05），而抑制劑組的含量顯著低于對照組（＜0.05）。該結果表明GABA 處理能較好地維持南瓜果實中可溶性固形物含量。綜上所述，外源GABA 條件下，鮮切南瓜在貯藏期內的品質并未受到影響，且符合國際標準。

圖1 外源GABA 和3-MP 處理對鮮切南瓜中菌落總數、白度、可溶性固形物和β-胡蘿卜素含量的影響Fig.1 Effect of exogenous GABA and 3-MP treatments on the total number of colonies,whiteness,soluble solids and βcarotene content in fresh-cut pumpkins

2.2 外源GABA、3-MP 對谷氨酸和GABA 含量的影響

谷氨酸作為合成GABA 的前體物質，植物體內GABA 的富集受到谷氨酸濃度的影響。由圖2A可知，對照組和外源3-MP 組的谷氨酸含量在貯藏期間不斷下降，而外源GABA 組中的谷氨酸含量則呈現先下降后上升的趨勢。與對照組相比，GABA 處理組谷氨酸含量顯著低于對照組和抑制劑處理組（＜0.05），3-MP 處理后的南瓜絲在整個貯藏期間都保持著較高的谷氨酸含量。這表明，外源GABA 可以促進更多的谷氨酸向GABA 合成和轉化。為了進一步研究外源GABA 對內源性GABA 的影響，本文測定了鮮切南瓜中GABA 的含量，由圖2B 所示，隨著貯藏時間的延長，GABA 處理鮮切南瓜中GABA含量呈現先上升后下降的趨勢，而對照組中GABA含量整體無明顯變化，經GABA 處理組在6 h 時的GABA 含量達到最大值，約7 mmol·10 gFW，且顯著高于對照組中GABA 含量57%（＜0.05）。而外源3-MP 處理組的GABA 含量顯著低于對照組（＜0.05），這說明3-MP 具有抑制內源GABA 合成的作用。與本文結果相似的是，外源GABA 降低了采后西葫蘆果實和蘋果中谷氨酸的含量，提高了GABA含量。

圖2 外源GABA 和3-MP 處理對鮮切南瓜中谷氨酸和GABA 含量的影響Fig.2 Effect of exogenous GABA and 3-MP treatments on glutamate and GABA contents in fresh-cut pumpkins

2.3 外源GABA、3-MP 對GAD 和GABA-T 活性的影響

GABA 支路中，GAD 是GABA 支路中GABA合成的限速酶。如圖3A 所示，對照組中的GAD呈現緩慢上升的趨勢，外源GABA 組在貯藏期間呈現先上升后下降的趨勢，與對照組相比，維持較高的GAD 活性。這表明GABA 處理可以提高南瓜中GAD 的活性，促進體內谷氨酸轉化成GABA。而抑制劑處理后，南瓜中GAD 活性顯著（＜0.05）低于對照組和GABA 處理組（圖3A）。另外，GABA 的積累不是GAD 的單一作用，GABA-T 能催化GABA和琥珀酸半醛的可逆轉化，因此GABA-T 活性的變化對GABA 的富集也同樣至關重要。如圖3B 所示，GABA 處理組和對照組中GABA-T 活性在貯藏期間呈緩慢上升的趨勢，與對照組相比，GABA 處理組GABA-T 活性無顯著變化（＞0.05），而3-MP 處理顯著抑制了GABA-T 活性（＜0.05），維持在較低水平。這種影響趨勢與GABA 處理對內源GABA含量變化趨勢基本一致。在研究楊樹、人參和煙草遭受脅迫時，都觀察到了類似的結果。因此，綜合兩個酶指標來看，GABA 處理能促進GAD 和GABA-T 酶活性，激活GABA 支路，從而一定程度上促進鮮切南瓜富集大量GABA 以應對脅迫。因此，本文認為外源GABA 處理誘導的內源性GABA 積累是由GABA-T 和GAD 活性增加所引起的。

圖3 外源GABA 和3-MP 處理對鮮切南瓜GAD 和GABA-T 活性的影響Fig.3 Effect of exogenous GABA and 3-MP treatments on GAD and GABA-T activities in fresh-cut pumpkins

2.4 外源GABA、3-MP 對多胺含量的影響

植物響應環境脅迫與多胺的分解代謝有關，在脅迫條件下，Put、Spd 和Spm 會氧化生成GABA。如圖4 所示，外源GABA 處理組中腐胺含量在前3 h急速下降，在后續6 h 無明顯變化，GABA 處理組中腐胺含量顯著低于對照組（＜0.05），對照組和3-MP 處理組中腐胺含量均呈先上升后下降的趨勢，6 h前兩組無明顯差異（＞0.05），在6 和9 h 出現顯著性差異（＜0.05）（圖4A）。如圖4B 所示，在整個貯藏過程中，對照組和兩個處理組精胺含量呈先上升后下降趨勢，除前3 h 無顯著差異外（＞0.05），在后6 h中對照組中精胺含量顯著高于外源GABA 組（＜0.05）。抑制劑處理提高了精胺含量，在貯藏期間保持了高于對照組的水平。GABA 處理組中的亞精胺含量在整個貯藏過程中逐漸降低，對照組呈現先下降再上升，然后下降的變化趨勢，而抑制劑處理組中的含量呈現先下降后上升的趨勢，且與對照組相比，外源GABA 組中亞精胺含量顯著降低（＜0.05）。與本文結果相似的是，外源GABA 可以通過激活多胺降解途徑，改變多胺生物合成能力，調節了游離Spd 和Spm 與游離Put 的比例，一定程度的促進甜瓜幼苗內GABA 含量增加。因此，本文認為外源應用GABA 可能是通過刺激多胺代謝，降低內源多胺水平，促進GABA 在南瓜體內富集，從而維持鮮切南瓜采后品質。

圖4 外源GABA 和3-MP 處理對鮮切南瓜中多胺含量的影響Fig.4 Effect of exogenous GABA and 3-MP treatments on the content of polyamines in fresh-cut pumpkins

2.5 外源GABA、3-MP 對DAO、PAO 和AMADH活性的影響

當植物受到脅迫時，腐胺、精胺和亞精胺可直接或間接被DAO、PAO 和AMADH 等氧化酶氧化生成GABA。胺氧化酶協同作用參與植物中多胺降解，可以維持植物中GABA 的內源性水平。如圖5A 所示，在貯藏期間，對照組中DAO 活性呈緩慢下降趨勢，而兩處理組DAO 活性先下降后升高。GABA 處理組的DAO 活性除第9 h 外，其余與對照組無顯著差異（＞0.05）。而3-MP 處理組的DAO 活性始終顯著低于對照組（＜0.05）。對照組和外源GABA 組中的PAO 活性無顯著差異（＞0.05）。和其他組相比，抑制劑組呈現較低的酶活性（圖5B）。對照組和GABA 處理組的AMADH 活性在貯藏期間呈現先上升后下降的趨勢。與對照組相比，GABA處理顯著提高了AMADH 活性（＜0.05），且AMADH活性始終高于對照組，而3-MP 處理顯著抑制了AMADH 活性（＜0.05）。

圖5 外源GABA 和3-MP 處理對鮮切南瓜中DAO、PAO 和AMADH 活性的影響Fig.5 Effects of exogenous GABA and 3-MP treatments on the activities of DAO,PAO and AMADH in fresh-cut pumpkins

雖然GABA 處理對DAO 和PAO 的酶活性影響不大，但根據多胺含量和AMADH 的變化趨勢，推測外源GABA 處理雖然可以激活多胺降解途徑，增加GABA 含量，但主要還是通過GABA 支路富集內源GABA。與本文結果相似的是，在大豆發芽期間，雖然DAO 和AMADH 的活性無顯著變化，通過促進多胺降解途徑，仍提高了其GABA 含量。近期有研究指出，通過增強多胺降解途徑催化酶活性，促進多胺的代謝能夠迅速積累GABA 并參與防御反應系統，但多胺降解途徑合成GABA 的能力遠低于GABA 支路。綜合以上結論，本文認為GABA的富集有多胺代謝途徑的參與，只是對GABA 積累的貢獻率較低。

2.6 外源GABA、3-MP 對CmGAD 基因表達的影響

如圖6 所示，對照組和處理組南瓜中表達量均呈現先上升后下降的趨勢，在6 h 到達峰值。在貯藏期間，GABA 處理組相對表達量顯著高于對照組（＜0.05），而3-MP 處理組其表達量顯著低于對照組（＜0.05）。基因表達量與GAD 在貯藏期間活性變化趨勢相似。同樣也與上調西蘭花芽菜中、以及楊樹中基因的表達量可以促進內源GABA 含量的結果一致。因此，本文認為外源GABA 可以通過調控表達量，促進內源GABA 的作用。

圖6 外源GABA 和3-MP 處理對鮮切南瓜中CmGAD 基因表達的影響Fig.6 Effect of exogenous GABA and 3-MP treatments on CmGAD gene expression in fresh-cut pumpkins

3 結論

結果表明，外源GABA 條件下，促進GABA 支路中谷氨酸含量顯著上升，提高了GAD、GABAT 的活性和的基因表達量，促使足夠多的谷氨酸向GABA 轉化，增強GABA 支路的合成效率。多胺降解途徑中，多胺（Put、Spd、Spm）的轉化率顯著提高（＜0.05），雖然DAO 和PAO 的活性與對照組沒有顯示出較為明顯的差異，但AMADH 的活性在貯藏期間始終高于對照組，加速了多胺轉化富集成GABA，說明多胺途徑同樣得到了激活。而3-MP 抑制劑處理則出現了完全相反的效果，GABA 的含量遠不如對照組。綜上所述，GABA 支路和多胺代謝在外源GABA 誘導鮮切南瓜內源GABA 具有協同作用。此外，GABA 處理是一種安全、健康、環保的果蔬處理方式，可以維持鮮切南瓜中可溶性固形物和顏色的變化，抑制菌落總數上升，防止鮮切南瓜受到微生物的侵染，減少-胡蘿卜素的流失，有助于保持南瓜的品質。本實驗并未從多胺分子層面進行深入研究，這也可能是導致某些酶活性能并未表現出顯著提高的原因之一，若能進一步研究，將為GABA處理采后果蔬投入市場應用提供更加可靠的理論依據。