天麻素調控SIRT3 改善BV2 細胞衰老和炎癥的作用

管 桐，高麗莎，隋得志，米 佳，王斌勝,

（1.濱州醫學院中西醫結合學院，山東煙臺 264003；2.濱州醫學院藥學院，山東煙臺 264003）

隨著世界人口老齡化，與衰老相關的神經退行性疾病的流行已成為一個嚴重的公共衛生問題，給社會帶來了巨大的經濟負擔。因此，研究大腦和神經細胞的衰老機制，將有助于制定有效的預防干預措施。在衰老的大腦中，衰老的神經細胞也逐漸積累增加，加劇大腦的衰老，而改善腦中神經細胞的衰老則能夠延緩大腦的衰老。在腦老化過程中，衰老的小膠質細胞逐漸積累，大腦中的小膠質細胞占所有膠質細胞的5%～12%，在生理或病理條件下作為常駐的免疫細胞或巨噬細胞，是中樞神經系統的第一道防線，在感染、創傷、炎癥、缺血性疾病以及神經退行性疾病中起著關鍵作用。盡管激活的小膠質細胞能夠吞噬細胞碎片和病原體來調節微環境的穩態，并分泌不同的神經營養因子以維持神經元的存活，但小膠質細胞的過度激活則會引起促炎介質以及細胞毒性物質如腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor，TNF-）、白細胞介素-1（interleukin 1IL-1）、白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等的過度釋放，加速神經炎癥反應以及神經退行性變。

NAD+依賴性脫乙酰酶蛋白Sirtuin3（silent mating type information regulation 2 homolog 3）屬于Sirtuin 基因家族，主要存在于線粒體中。SIRT3 參與能量代謝、線粒體功能和氧化應激以及炎癥的調節，能夠對抗與衰老相關的疾病。同時，SIRT3 已經被確定為幾種炎癥相關疾病中的關鍵調節因子。研究發現，SIRT3 可能是引發小膠質細胞炎癥的關鍵上游啟動因子，在炎癥條件下，SIRT3 蛋白表達下降。在之前的研究中，描述了SIRT3 在神經炎癥中的保護作用，但是很少有實驗來研究SIRT3 對衰老的小膠質細胞的作用。在本研究中，使用D-半乳糖誘導BV2 細胞在體外建立一個衰老細胞模型，試圖探討SIRT3 在衰老的BV2 細胞中的具體作用。

天麻（）是蘭科植物天麻的塊莖，傳統醫學認為，天麻具有平肝息風、通絡止痛的功效，能夠廣泛用于治療頭疼、癲癇、頭暈、神經痛以及高血壓等疾病。天麻中有多種有效成分，但天麻素（Gastrodin）是其中最重要的一種天然酚類成分。研究發現，天麻素具有抗氧化應激、抗炎和抗衰老的作用，由于天麻素能夠穿越血腦屏障，通過清除活性氧，減少神經毒性促炎物質和脂質過氧化而在不同的神經系統疾病中發揮神經保護作用。同時，天麻作為一種藥食同源的中藥材，有極高的營養保健價值，其明確指出的保健功能主要包括改善睡眠、增強機體免疫力，能夠調節血壓和血脂等。以天麻為主要原料的保健產品也被廣泛研究和開發，被CFDA批準的保健食品達30 多種。2019 年11 月，國家衛生健康委員會、國家市場監督管理總局聯合發布對天麻等9 種中藥按照食藥物質的標準進行研究，推進了中藥材藥食同源產業的發展。然而目前關于天麻素對衰老的小膠質細胞的調控作用尚未有深入研究。由于神經炎癥是神經退行性疾病的重要病理反應，而天麻素具有多種藥理學作用，因此本項研究以D-半乳糖誘導的BV2 細胞建立衰老細胞模型，探討天麻素對衰老的BV2 細胞中炎癥反應的調節作用以及可能的機制，以期為開發治療神經退行性疾病的新藥和保健產品提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

天麻素（純度≥98%）（SG8080）、CCK-8 試劑盒（CA1210）、TC 處理細胞爬片（YA0350）北京索萊寶生物科技有限公司；SIRT3 抑制劑（50 mg）（120241-79-4）MedChemExpress 公司；BV2 小鼠小膠質細胞株（CL-0493）、BV2 細胞專用培養基（CM-0493）武漢普諾賽（Procell）生命科技有限公司；細胞衰老-半乳糖苷酶（SA--Gal）染色試劑盒（C0602）、活性氧（ROS）檢測試劑盒（S0033S）、小鼠白細胞介素1（IL-1）酶聯免疫吸附檢測試劑盒（PI301）、小鼠白細胞介素6（IL-6）酶聯免疫吸附檢測試劑盒（PI326）、小鼠腫瘤壞死因子-（TNF-）酶聯免疫吸附檢測試劑盒（PT512）、SIRT3 兔抗蛋白（AF5303）、P16 兔抗蛋白（AF1069）、P21 兔抗蛋白（AF5252）、-actin（AF0003）、Alexa Fluor 555 標記驢抗兔IgG（H+L）（A0453）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（A0208）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）、抗熒光淬滅封片劑（P0131）上海碧云天生物科技有效公司。

Multiskan FC 酶標儀、BB150-2TCS 二氧化碳培養箱、Sorvall Stratos 低溫冷凍高速離心機 美國Thermo Scientific 公司；SDS-PAGE 膠電泳轉膜裝置美國Bio-Rad 公司；Odyssey 熒光成像系統 美國LI-COR Biosciences 公司；CKX53 倒置熒光顯微鏡日本OLYMPUS 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將BV2 小膠質細胞置于含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、鏈霉素的細胞培養基液中，在37 ℃，5% CO培養箱中培養，隔天傳代1 次，當細胞生長狀態良好時用于實驗。

1.2.2 細胞分組 將BV2 細胞分成4 組：正常組，模型組，SIRT3 抑制劑+天麻素組，天麻素組。正常組：給予細胞培養基培養；模型組：使用D-半乳糖（10、20、30 和40 μg/mL）處理BV2 細胞24 h；SIRT3 抑制劑+天麻素組：先使用D-半乳糖處理BV2 細胞24 h，然后同時使用10 μmol/L 的SIRT3 抑制劑和天麻素處理BV2 細胞24 h；天麻素組：先使用D-半乳糖處理BV2 細胞24 h，然后使用天麻素（10、20、30、40和50 μmol/L）處理BV2 細胞24 h。

1.2.3 CCK-8 法測量細胞活力 將細胞接種并培養在96 孔板中，各組細胞用藥干預結束后，棄去使用過的細胞培養基，每孔加入100 μL 新鮮的細胞培養基，再加入10 μL CCK-8 溶液，在細胞培養箱內繼續培養2 h。培養結束后，使用酶標儀在450 nm 處測定各組細胞吸光度值，實驗結果用各組吸光度值與正常組吸光度的比值進行表示。

1.2.4 SA--Gal 染色法檢測細胞衰老面積 將細胞接種并培養在TC 處理細胞爬片上，各組細胞在用藥干預結束后，吸除使用過的細胞培養液。每孔加入400 μL PBS 進行洗滌3 次，每次3 min，洗滌結束后，每孔加入400 μL-Gal 染色固定液在室溫固定15 min。染色固定結束后，每孔加入400 μL PBS 洗滌3 次，每次3 min。洗滌結束后，每孔加入400 μL染色工作液（每1 mL 染色工作液中按照：-Gal 染色液A:B:C:X-Gal=10:10:930:50 的比例配制）。使用保鮮膜封住24 孔板以防止蒸發，放在37 ℃烘箱中孵育過夜。孵育結束后，在普通光學顯微鏡下觀察，并拍照保存，實驗結果用衰老細胞面積與總細胞面積進行表示。

1.2.5 ELISA 法檢測IL-1、IL-6 和TNF-的含量將細胞接種并培養在6 孔板中并進行用藥干預。各組用藥干預結束后，首先根據試劑盒說明書配制標準品并繪制標準曲線。收集各組細胞進行離心（500 g，5 min），取上清。分別將100 μL 樣品和不同濃度的標準品加入到相應的反應孔中，用封板膜封住反應孔并室溫孵育120 min。孵育結束后進行洗板，拍干后每孔加入400 μL 辣根過氧化物酶標記Streptavidin，用封板膜封住反應孔后，室溫下避光孵育20 min。孵育結束后，進行洗板5 次。拍干反應板后，每孔加入100 μL 顯色劑TMB 試劑。室溫下避光孵育20 min，每孔加入50 μL 終止液，混勻后立即測量A值。

1.2.6 生化法檢測活性氧（ROS）水平 將細胞接種并培養在96 孔板中，各組細胞用藥干預結束后，棄掉細胞培養液，每孔加入100 μL 2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）（按照1:1000 比例稀釋），37 ℃細胞培養箱內孵育20 min。孵育結束后，用無血清細胞培養液洗滌3 次，每次5 min，洗滌結束后使用熒光酶標儀在激發波長488 nm，發射波長525 nm處檢測熒光強度值。

1.2.7 免疫熒光檢測細胞中SIRT3 蛋白表達水平將細胞接種并培養在TC 處理細胞爬片上并進行用藥干預。各組干預結束后，吸盡使用過的細胞培養液，加入400 μL 固定液室溫下固定30 min。固定結束后，去除固定液，每孔加入400 μL PBS 放入搖床進行搖動洗滌，每次5 min，洗滌3 次。洗滌結束后用封閉液封閉60 min，封閉結束后加入稀釋的一抗anti-SIRT3（1:500）。在4 ℃條件下孵育過夜，一抗孵育結束后，每孔加入400 μL PBS 洗滌5 次，每次5 min。洗滌結束后，每孔加入熒光標記的Alexa Fluor 555 標記驢抗兔IgG（H+L）（1:1000）室溫下避光孵育60 min，孵育結束后使用抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）進行封片，在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.8 Western Blot 法檢測SIRT3、P16、P21 蛋白表達 將細胞接種并培養在24 孔板中并進行用藥干預。各組干預結束后，每孔加入400 μL PBS 洗滌。洗滌結束后每孔加入100 μL 裂解液，使用移液槍吹打，使裂解液與細胞充分接觸。充分裂解后，離心（12000 g，5 min），取上清。使用BCA 法測量蛋白濃度。使用12%分離膠和5%濃縮膠進行電泳和轉膜，轉膜結束后加入適量的封閉液，室溫下封閉60 min，使用一抗稀釋液稀釋一抗anti-SIRT3（1:1000），anti-P16（1:1000），anti-P21（1:1000）和-actin（1:1000），在4 ℃條件下孵育過夜，用Western 洗滌液洗滌3 次，每次10 min，加入二抗anti-rabbit（1:10000）、antimouse（1:10000），室溫孵育60 min，洗滌3 次，每次10 min。洗滌結束后將配置好的顯影液滴加在PVDF 膜上進行曝光成像。

1.3 數據處理

使用 GraphPad Prism 8.0 軟件（GraphPad Software,Inc.,An Diego,CA）對實驗結果進行統計分析，數據采用均數±標準差表示。兩組之間的比較采用獨立樣本t 檢驗（Independent-Sample t Test），多組間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），檢驗水準取雙側＝0.05，＜0.05 為差異具有統計學意義，＜0.01 為差異具有顯著統計學意義。

2 結果與分析

2.1 D-半乳糖對BV2 細胞活力和衰老的影響

研究發現D-半乳糖在半乳糖氧化酶的催化作用下，會產生過氧化氫和醛糖，該產物又會刺激細胞，產生大量的自由基離子，從而進一步損傷細胞的生理功能，因此本實驗使用D-半乳糖誘導BV2 細胞衰老建立細胞模型。如圖1 顯示，不同劑量的D-半乳糖（10、20、30 和40 μg/mL）均能夠降低BV2 細胞活力，并且呈劑量依賴性下降（＜0.05）。使用30 μg/mL的D-半乳糖誘導的BV2 細胞存活率在50%～60%，比20 μg/mL 的D-半乳糖誘導更為顯著地降低細胞活力（＜0.05），高于使用40 μg/mL 的D-半乳糖誘導的BV2 細胞存活率（＜0.05）。為避免D-半乳糖處理的BV2 細胞活力過度降低而產生不可逆性的損傷，本實驗選擇濃度30 μg/mL 的D-半乳糖用于后續實驗。本實驗進一步檢測30 μg/mL 的D-半乳糖對BV2 細胞衰老的影響，由于-半乳糖苷酶染色陽性是細胞衰老的重要標志物，因此本實驗使用SA-Gal 染色法BV2 細胞衰老面積。如圖2 顯示：正常組細胞SA--Gal 衰老染色面積小，30 μg/mL 的D-半乳糖誘導的BV2 細胞SA--Gal 染色面積極顯著增大（＜0.01）。這表明使用30 μg/mL 的D-半乳糖處理BV2 細胞能夠降低BV2 細胞活力，并且引起BV2 細胞衰老。因此，在后續實驗中使用30 μg/mL的D-半乳糖進行造模。

圖1 不同濃度的D-半乳糖對BV2 細胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of D-galactose on the viability of BV2 cells

圖2 30 μg/mL 的D-半乳糖對BV2 細胞SA-β-Gal 染色面積的影響Fig.2 Effect of 30 μg/mL D-galactose on SA-β-Gal staining area of BV2 cells

2.2 天麻素對D-半乳糖處理BV2 細胞活力和衰老的影響

先前研究已證實天麻素具有抗衰老作用。本實驗中，使用不同濃度（10、20、30、40 和50 μmol/L）的天麻素干預衰老的BV2 細胞，然后檢測各組細胞活力以測定天麻素的最佳干預濃度。如圖3 實驗結果顯示：濃度為20、30、40 和50 μmol/L 的天麻素均能提高D-半乳糖處理的BV2 細胞活力，且呈劑量依賴性（＜0.05）。30 μmol/L 的天麻素比20 μmol/L 的天麻素更有效的提高細胞活力（＜0.05）。而30 μmol/L天麻素較之40 μmol/L 天麻素與50 μmol/L 天麻素的作用無統計學差異（＞0.05）。因此，本實驗選擇濃度為30 μmol/L 的天麻素用做后續實驗。進一步檢測各組細胞的SA--Gal 染色，如圖4 結果顯示：與模型組相比，天麻素組中BV2 細胞SA--Gal 染色面積極顯著減少（＜0.01）。與天麻素組相比，SIRT3抑制劑+天麻素組中BV2 細胞的SA--Gal 染色面積增加（＜0.05）。這提示天麻素能改善D-半乳糖誘導的BV2 細胞衰老，而抑制SIRT3 表達則會減弱天麻素對D-半乳糖處理的BV2 細胞的抗衰老作用。

圖3 不同濃度的天麻素對D-半乳糖誘導的BV2 細胞活力的影響Fig.3 Effects of gastrodin at different concentrations on the viability of BV2 cells induced by D-galactose

圖4 天麻素對D-半乳糖誘導的BV2 細胞中β-半乳糖苷酶染色面積的影響Fig.4 Effects of gastrodin on β-galactosidase staining area in D-galactose-induced BV2 cells

2.3 天麻素對D-半乳糖處理BV2 細胞炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響

如圖5 顯示，與正常組相比，模型組BV2 細胞培養液中炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平極顯著增高（＜0.01）。與模型組相比，天麻素組BV2 細胞培養液中炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平極顯著降低（＜0.01）。與天麻素組細胞相比，SIRT3 抑制劑加天麻素組中BV2 細胞培養液中炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平增加（＜0.05）。這提示天麻素能改善D-半乳糖誘導的BV2 炎癥反應，而抑制SIRT3 表達則會減弱天麻素對D-半乳糖處理的BV2細胞抗炎作用。

圖5 天麻素對D-半乳糖誘導的BV2 細胞中神經炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量的影響Fig.5 Effects of gastrodin on the neuroinflammatory factor IL-1β、IL-6 and TNF-α content in BV2 cells induced by D-galactose

2.4 天麻素對D-半乳糖處理BV2 細胞ROS 水平的影響

由于線粒體產生的ROS 與炎癥反應密切相關，本實驗檢測了各組BV2 細胞的ROS 水平。如圖6結果顯示：與正常組相比，模型組細胞ROS 水平極顯著增高（＜0.01）。與模型組相比，天麻素組中細胞ROS 水平極降低（＜0.01）。此外，與天麻素組相比，SIRT3 抑制劑+天麻素組中細胞ROS 水平顯著升高（＜0.05）。這提示天麻素能降低D-半乳糖處理的BV2 中ROS 水平，而抑制SIRT3 表達則會減弱天麻素降低BV2 細胞中ROS 的保護作用。

圖6 天麻素對D-半乳糖誘導的BV2 細胞中ROS 水平的影響Fig.6 Effects of gastrodin on ROS level in BV2 cells induced by D-galactose

2.5 天麻素對D-半乳糖處理BV2 細胞中SIRT3、P16 和P21 蛋白表達的影響

如圖7 和圖8 結果顯示：與正常組相比，模型組BV2 細胞中SIRT3 熒光強度和蛋白表達水平極顯著下降（＜0.01）。與模型組相比，天麻素組中細胞SIRT3 熒光強度和蛋白表達水平極顯著增高（＜0.01）。此外，與天麻素組相比，SIRT3 抑制劑+天麻素組BV2 細胞中SIRT3 熒光強度和蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）。這提示天麻素能夠增高D-半乳糖處理的BV2 細胞中SIRT3 蛋白表達。

圖7 天麻素對D-半乳糖誘導的BV2 細胞中SIRT3 蛋白熒光強度的影響Fig.7 Effects of gastrodin on the fluorescence intensity of SIRT3 protein in BV2 cells induced by D-galactose

細胞周期異常是細胞衰老的一個關鍵病理特征，衰老細胞表現出永久性細胞周期阻滯，并主要由P16INK4A 蛋白和P53-P21-RB 蛋白調節。因此本實驗檢測了各組細胞中P16 和P21 蛋白表達水平。如圖8 結果顯示：與正常組相比，模型組細胞P16 和P21 蛋白表達極顯著增加（＜0.01）。與模型組相比，天麻素組細胞P16 和P21 蛋白表達極顯著降低（＜0.01）。此外，與天麻素組相比，SIRT3 抑制劑+天麻素組中細胞P16 和P21 蛋白表達顯著增加（＜0.05）。這提示天麻素能夠降低D-半乳糖處理的BV2 細胞中P16 和P21 蛋白水平，但是抑制SIRT3 表達后，天麻素降低BV2 細胞中衰老相關蛋白P16 和P21蛋白的作用被部分減弱，因此SIRT3 可能是天麻素發揮抗衰老作用的重要靶點。

圖8 天麻素對D-半乳糖誘導的BV2 細胞中SIRT3、P16 和P21 蛋白表達的影響Fig.8 Effects of gastrodin on the expression of SIRT3,P16 and P21 proteins in BV2 cells induced by D-galactose

3 討論與結論

隨著預期壽命的逐漸延長，人體各器官的生理機能狀態漸進性下降，直至功能喪失。衰老通常不被視為一種疾病，但它卻是心血管疾病、代謝性疾病，尤其是神經退行性疾病等慢性疾病的重要危險因素。在衰老的組織器官中，衰老細胞大量積累，并以不可逆的方式失去增殖能力，導致組織的再生潛能喪失、導致炎癥和器官功能障礙。在正常的條件下，衰老細胞通常在一個稱為免疫監視的過程中被免疫細胞清除，然而隨著年齡的增長，衰老的免疫細胞也出現漸進性的功能失調，引起其他衰老的細胞清除減少，最終導致整個器官和系統功能水平障礙。小膠質細胞作為中樞神經系統的常駐巨噬細胞，以持續和動態的方式監察健康的腦組織環境，并能夠清除其他受損的神經細胞，在衰老大腦的神經炎癥和神經退行性病變中起著關鍵作用。研究發現，衰老的大腦呈現出低級炎癥狀態。在大腦衰老的過程中，小膠質細胞也發生衰老并逐漸積累，產生大量的促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子TNF-、白細胞介素IL-1和白細胞介素IL-6，引起神經炎癥反應。在本實驗中，使用D-半乳糖處理BV2 細胞以建立衰老細胞模型，證實衰老的小膠質細胞出現了-半乳糖苷酶染色增加和細胞周期阻滯的典型衰老病理特征，并且衰老的小膠質細胞活力下降，釋放的炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-水平增加，引起了神經炎癥反應，實驗結果與以往的研究結果一致。在對衰老的小膠質細胞進行干預的實驗中，本實驗使用前期研究已經證實具有抗炎和抗衰老作用的天麻素。本團隊研究發現，改善衰老的小膠質細胞能夠增加細胞活力，減少神經炎癥反應。因此，調節衰老小膠質細胞的功能以減少炎癥因子的釋放，已經成為調節神經炎癥、改善大腦衰老的一種重要策略。

NAD+依賴的脫乙酰蛋白SIRT3 是主要的線粒體脫乙酰酶，能夠調節線粒體功能和氧化應激，并保護細胞免受氧化應激損傷。最近的研究進一步發現SIRT3 與炎癥的進展有關，研究結果顯示LPS 和TNF-能夠顯著抑制人單核細胞/巨噬細胞中SIRT3的表達，引起小鼠心肺組織周細胞的丟失和炎性細胞浸潤的增加。在小鼠腦中敲低SIRT3 表達則會增強IL-1的表達和小膠質細胞的激活，加劇神經炎癥反應，引起神經退行性變。同時，SIRT3 在衰老條件下表達受到抑制，恢復SIRT3 表達能夠通過恢復線粒體功能增加小膠質細胞的活力，改善神經炎癥反應。與之一致的是，本研究發現衰老的BV2 細胞中SIRT3 蛋白表達下降，進一步使用SIRT3 抑制劑抑制SIRT3 蛋白表達后，小膠質細胞的衰老細胞數量增加、細胞周期阻滯的程度加重，加劇了小膠質細胞的衰老進程，同時也引起了更多線粒體ROS 水平產生和炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平增加，這也驗證了SIRT3 與神經炎癥反應之間具有調控作用。

天麻素作為天麻的主要活性成分之一，大量的研究證明天麻素具有抗氧化應激、抗炎和抗衰老的作用，能夠降低脂多糖誘導的小膠質細胞一氧化氮合酶（iNOS）、環氧合酶-2 和促炎性細胞因子表達，并且能夠通過調控TLR4/NFB 信號通路減少BV2細胞的過度激活。本實驗進一步研究天麻素對衰老的BV2 細胞的保護作用，發現天麻素能夠劑量依賴性改善衰老的BV2 細胞活力，并且能夠減少衰老的BV2 細胞數量和改善細胞周期阻滯，進而發揮抗衰老作用。此外，天麻素還能通過降低衰老的BV2細胞中ROS 水平和炎癥因子IL-1，IL-6 和TNF-水平發揮抗炎作用。本研究發現在同時給予SIRT3抑制劑和天麻素處理后，天麻素對衰老的小膠質細胞的抗炎和抗衰老作用減弱，表明天麻素可能通過增高SIRT3 表達來發揮保護作用。

總之，本實驗首次研究天麻素對衰老的小膠質細胞的抗炎和抗衰老作用，發現天麻素能增加衰老的小膠質細胞活力，減少-半乳糖苷酶染色面積和衰老相關蛋白P16 和P21 表達水平。此外，天麻素還能降低衰老的小膠質細胞中ROS 水平和神經炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平，提高SIRT3 蛋白表達水平。由此推測天麻素對衰老的小膠質細胞的抗衰老和抗炎作用可能與上調SIRT3 蛋白表達有關，為研究天麻素的神經保護作用提供了新的方向，但有關天麻素抗衰老和抗炎的具體作用機制仍然需要進一步闡明。