海洋多肽的提取純化及生物活性研究進展

周田田，張 紅，袁文鵬

（齊魯工業大學（山東省科學院）山東省科學院菏澤分院，山東省生物工程技術創新中心，山東菏澤 274000）

蛋白質是生命活動的物質基礎，是構成細胞內生命物質的主要有機成分。人體攝入的蛋白質經消化道中的酶作用后，大多數以寡肽的形式被消化吸收。生物活性肽是具有生物活性的寡肽，自1902 年第一種多肽類物質促胰液素被發現以來，人類對多肽的認識逐步深入，研究發現多肽具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等作用。與傳統藥物相比，多肽類藥物具有特異性強、分子量小、副作用小等優點，因此，多肽類藥物已成為醫藥研發的新亮點。

海洋生物量占地球總生物量的87%，生物種類達20 多萬種，為開發生物活性肽提供了巨大的空間。自上世紀60 年代以來，已從海洋生物中分離出近5000 種化合物，這些化合物主要包括甾醇、萜類、生物堿、肽、多糖和蛋白質等。對天然活性多肽的研究主要集中在少數海洋生物，包括海葵、海藻、海綿和芋螺，藻類、魚類、軟體動物、甲殼類動物和水產加工副產物等。從海洋生物中分離出來的許多種活性多肽中，只有一小部分會被作為食品或藥品進行開發和銷售，其中以魚膠原蛋白肽、海參肽、牡蠣肽在市場中的應用最廣、影響力最大。本文綜述了近年來從海洋生物中提取活性多肽的方法以及各種多肽的生物活性，還對這些海洋多肽類產品的發展前景進行了展望，以期為海洋多肽在食品、藥品領域的應用提供一定的參考。

1 海洋多肽的提取方法

海洋肽的生產與蛋白質來源、提取和純化方法有關，采用合適的生產技術可以提高肽的產量和生物活性。目前已經用于生產海洋肽的技術包括化學水解、酶水解、微生物發酵和物理輔助提取。化學水解法因氨基酸受損嚴重、水解過程難控制而較少應用；酶水解法因具有生產條件溫和，水解過程可控，肽得率高以及安全的優勢，逐漸取代了傳統的化學水解法，成為制備海洋生物活性肽的主要方法。

1.1 化學水解法

化學水解法采用酸或堿溶液水解肽鍵。酸水解一般使用0.02～0.03 mol/L 的鹽酸或硫酸在高溫（121～138 ℃）、高壓（220～310 MPa）下與蛋白質反應2～8 h，然后調節pH 至6～7；而堿水解是在低溫（27～54 ℃）下使用堿金屬鹽（如氫氧化鈣、氫氧化鈉或氫氧化鉀）對蛋白質進行水解。鹽酸常用于海洋肽的酸水解。Wisuthiphaet 等使用鹽酸（4 mol/L）水解魚糜（100 ℃，90 min），結果顯示水解度為50.7%時，谷氨酸的含量最高（16.3%），其次是天冬氨酸（10.4%）和賴氨酸（8.5%）。酸水解的影響因素的主次順序為：水解溫度＞鹽酸濃度＞水解時間。一些其他類型的酸也已用于蛋白質水解，包括乙酸、硝酸、磷酸、馬來酸和草酸，其產量受水解時間和溫度控制。

堿水解會破壞絲氨酸和蘇氨酸從而導致產品功能性差，且反應過程中生成的氯丙醇有強致癌性；與堿水解相比，酸水解更為常用，然而酸水解的中和步驟會導致產品鈉含量偏高和色氨酸的破壞。因此，雖然化學水解法操作簡便、成本低，但在工業化生產蛋白肽中應用很少。

1.2 酶水解法

酶水解是在優化的溫度和pH 下，利用蛋白酶對蛋白質進行水解。由于不同的蛋白質可以被相應的酶水解，因此酶促水解容易控制且具有特異性，酶水解被廣泛應用于蛋白肽的生產過程中。蛋白酶種類的選擇是生產小分子生物活性肽的關鍵，合適的蛋白酶包括動物蛋白酶（例如胃蛋白酶和胰蛋白酶）和植物蛋白酶（例如木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶）以及微生物蛋白酶（例如枯草芽孢桿菌蛋白酶和鏈霉菌蛋白酶）。由于動植物資源有限，工業生產中對蛋白質原料而言，枯草桿菌蛋白酶是生產小分子量生物活性肽的最佳選擇。

由于各種酶的水解特性不同，多酶水解比單酶水解速率高且效果好，為改善海洋多肽的產品品質，現在一般采用復合蛋白酶水解法。邱娟等用復合蛋白酶和堿性蛋白酶分步水解牡蠣肉，所得牡蠣肽中分子量在3000 Da 以下的占99.72%。在酶促水解過程中，水解度的增加會降低產物肽的活性，這是因為隨著酶解程度的增加，活性肽被分解為氨基酸或其中的活性基團遭到破壞。因此，在酶水解制備多肽時，應嚴格控制酶解度，在蛋白質被適度水解的條件下保證產物肽的高活性。

1.3 微生物發酵法

微生物代謝過程中產生的蛋白水解酶引起蛋白質水解，進而產生生物活性肽。細菌種類、蛋白質類型和發酵時間是決定水解率的重要因素。例如，由于其高細胞外蛋白酶活性，干酪乳桿菌具有在牡蠣勻漿液中產生更多肽的能力。閆澤文分別使用酵母菌和乳酸菌發酵海參內臟酶解液，結果表明乳酸菌發酵可以大幅降低樣品中的苦味肽含量，乳酸菌比酵母菌更適合用于海參內臟酶解液的發酵。江敏等以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率為指標，用枯草芽孢桿菌發酵馬氏珠母貝，發現發酵時間對DPPH 自由基清除率影響最大。此外，各種細菌或酵母菌的組合可以加速蛋白質的水解。

發酵法生產活性肽具有成本低和產品適口性好的特點，但是發酵條件和水解程度不易控制，產物復雜，后續分離純化困難，限制了其在工業生產中的應用。

1.4 物理輔助提取法

超聲波已被用于輔助肽提取，通常與酶水解相結合。在超聲波的機械作用下，細胞發生微震蕩，細胞內物質移動從而產生摩擦，細胞變軟。適當時間的超聲處理會使植物細胞壁破裂，細胞液釋放到溶劑中，這些變化是物理變化，不會改變化學成分。李文欣等以海參性腺為原料，利用超聲波技術輔助中性蛋白酶水解制備血管緊張素轉化酶（ACE）抑制肽，水解度和ACE 抑制率分別可達到7.81%和73.81%。周燕芳等利用超聲波輔助酶解鯖魚肉制備抗氧化肽，得到的多肽具有極強的抗氧化性，對DPPH 自由基的清除率高達近90%。藍尉冰等使用超聲波協同處理堿性蛋白酶酶解近江牡蠣，酶解液中氨基態氮的含量可達到26.13 mg/g。

超聲提取可以顯著縮短提取時間，提高提取效率，不需要高溫改變肽的性質，因此生產出來的肽類具有很高的活性，在生產中得到了廣泛應用。

2 海洋多肽的純化方法

海洋多肽的活性與其分子量以及結構特征有關，小分子量組分（1～5000 Da）通常活性更高。蛋白水解液和發酵液是由不同種類、不同分子量的活性肽和非活性肽組成的復雜混合物，活性肽的濃度很低，因此，需要采用多種純化方法來制備高濃度活性肽。常見的多肽分離純化方法有色譜法和膜分離法。

2.1 色譜法

色譜法的基本原理是在外力作用下使含有蛋白質的溶液流過含有各種填料的柱，由于不同蛋白質與色譜柱填料的相互作用不同，蛋白質在色譜柱中的保留時間也不同，因此可以根據不同蛋白質的保留時間對其進行分離純化。通常，蛋白質的檢測方法是將色譜柱的吸光度保持在280 nm。常用的色譜法可分為凝膠色譜法（SEC）、離子交換色譜法（IEC）、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）等。

根據柱內流動相的不同，SEC 可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。以水為流動相的，稱作GFC；以有機溶劑為流動相的，稱作GPC。SEC 的工作原理是根據蛋白質形狀和大小不同，所以洗脫時間不同，大蛋白會通過凝膠珠之間的縫隙先被洗脫出來。IEC 是由Thompson 等首先發展起來的。IEC 的基質由帶電樹脂或纖維素組成，根據離子交換劑的電荷，可分為陰離子交換色譜法（AEC）和陽離子交換色譜法（CEC），離子交換劑中的帶電基團用于吸附溶液中帶相反電荷的物質，然后進行洗脫分離。離子交換色譜具有分辨率高、耐酸堿、操作簡單等優點，已成為分離多肽的重要方法。

SEC 操作簡便，所需設備簡單，分離介質可重復使用，分離效果較好，但分離操作較慢，而且對于分子量相差不多的物質難以達到很好的分離。IEC 根據蛋白質表面電荷的差異對其進行分離，盡管分離量大，但分離出的樣品純度較低，通常用于初步分離。RP-HPLC 分辨率高，廣泛用于化學分析，具有快速、回收率高的特點，但是成本較高且操作復雜，樣品處理量少，一般用于精細純化，以量化小分子和離子以及分離和純化大分子。蛋白質純化通常需要多種色譜方法聯用，一般先采用SEC 或IEC 將多肽粗分離后再利用RP-HPLC 進一步純化。Kim 等采用GFC 和RP-HPLC 從海鞘蛋白水解物中分離并鑒定出了三種抗氧化肽組分（亮氨酸-谷氨酸-色氨酸（LEW），M=446.2 Da；甲硫氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-色氨酸（MTTL），M=464.2 Da；酪氨酸-酪氨酸-脯氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸（YYPYQL），M=845.4 Da），其中，LEW 因含有帶負電的谷氨酸以及芳香族氨基酸色氨酸，對DPPH 自由基的清除率活性最高（75%）。Bougatef 等使用AEC 和RP-HPLC從沙丁魚的粗酶提取物中分離抗氧化肽，結果表明，水解度為6%時水解產物的DPPH 自由基清除活性最強（87%±2.1%，2 mg/mL）。

2.2 膜分離法

膜分離技術以濃度差或壓力差作為驅動力，是應用于分離生物活性肽最廣泛的方法。膜分離工藝根據膜孔徑大小分為四類：微濾、超濾、納濾和反滲透。

微濾的分離原理一般認為屬于機械篩分，膜的物理結構起決定性作用。微濾膜可分為有機膜和無機膜。有機膜包括醋酸纖維素、聚酰胺、聚碳酸酯和聚丙烯，無機膜包括陶瓷和金屬。微濾膜的孔徑為0.1～1 μm，因此，微濾膜可用于分離液體中的細菌和顆粒，以濃縮所需要的物質。Nedzarek 等利用微濾技術處理腌制過鯡魚的鹵水，以分離鹵水中的蛋白質和肽，處理過的鹵水可以重復使用，減少了蛋白質的損失。

與微濾分離過程相似，超濾也是通過膜孔的篩分作用將料液中大于膜孔的大分子溶質進行截留，使溶質與溶劑及小分子組分分離。超濾是介于微濾和納濾之間的膜過濾過程，所用膜的孔徑為1 nm～0.5 μm。超濾可用于凈化、分離和濃縮溶液中的成分，超濾分離的典型分子量范圍為10000～300000 Da。

納濾是在20 世紀80 年代后期開發的一種新型膜分離技術。納濾膜截留分子量介于反滲透和超濾技術截留分子量之間的化合物，截留率＞95%的納濾膜截留的最小分子直徑約為1 nm。納濾膜的遷移機理尚未確定，目前大多數學者認為納濾膜的分離主要是篩分效應和Donnan 效應兩種特征。納濾膜可用于分離活性肽，肽分子含有游離羧基和氨基，在等電點上是電中性的，一些納濾膜具有靜電官能團，調節溶液的pH 可以使這種納濾膜捕獲離子而不捕獲電中性分子，具有相似分子量但不同等電點的肽可使用此類膜分離。

反滲透是20 世紀60 年代初研制的利用壓差的分離技術，當膜兩側的靜壓差大于溶液的滲透壓時，溶劑分子將從溶質濃度高的溶液側透過膜流向溶質濃度低的一側。在海洋肽生產工藝中，反滲透技術主要被用于對肽溶液進行脫鹽。

采用膜技術分離生物活性肽具有快速、經濟和環保的優點。然而，膜過濾技術也存在一些問題，如半透膜和疏水肽之間的相互作用、膜的污染和堵塞、難以獲得純肽以及樣品需求量大等。為了解決這些問題，可以將膜過濾技術與色譜技術相結合，用于生產高純度功能肽。

3 海洋多肽的生物活性

3.1 血管緊張素轉換酶（ACE）抑制活性

高血壓是最常見的心血管疾病之一。血管緊張素轉換酶（ACE）是腎素-血管緊張素系統（RAS）中的關鍵酶，在調節血壓方面起著至關重要的作用。ACE 可以使緩激肽（激肽釋放酶——激肽系統中的一種降壓肽）降解，引起血壓升高；另外，還能將無活性的血管緊張素I，轉化為有效的血管收縮劑血管緊張素II，血管緊張素II 還能刺激腎上腺皮質合成和釋放醛固酮，導致血壓升高。

高血壓治療的有效方法之一是抑制ACE 的活性，ACE 抑制劑阻斷血管緊張素I 轉化為血管緊張素II，導致血管松弛和血壓下降。目前已有藥企合成了各種ACE 抑制劑用于治療高血壓，但這些藥物具有不良副作用，需要開發天然食物來源的ACE抑制劑來控制高血壓。肽對ACE 活性的抑制能力主要取決于C 端氨基酸，C 端含有芳香族氨基酸（Trp、Phe 和Tyr）或疏水氨基酸殘基，N 端為脂肪族氨基酸（Val、Ile 和Leu）的多肽具有較強的ACE 抑制活性。與合成藥物相比，從食品蛋白質中獲得的肽更安全且易被吸收，目前已從許多海洋生物的蛋白質水解物中分離出具有ACE 抑制活性的肽，主要為貝類（牡蠣、貽貝、雜色蛤）、沙丁魚、紫菜等降血壓肽。具有ACE 抑制活性的海洋多肽來源及其作用效果如表1 所示。

表1 海洋多肽的ACE 抑制活性及作用效果Table 1 ACE inhibitory activity and effect of marine peptides

肽的結構對其ACE 抑制活性有重要作用，鏈長、氨基酸組成和序列是ACE 抑制肽的主要特征。ACE 抑制肽通常是含有2～12 個氨基酸的短鏈肽，結晶學研究表明大肽不能與ACE 的活性位點結合。然而，長鏈肽在某些情況下可能具有ACE 抑制活性，因為氨基酸組成可能比肽的長度更重要。這可能與氨基酸類型有關，因為含有酸性氨基酸（Asp 和Glu）的肽具有螯合鋅原子的凈負電荷，而鋅原子是維持ACE 活性的必需成分。ACE 抑制肽的C 端和/或N 端由特定氨基酸殘基組成，C 端含有芳香族氨基酸（Tyr、Phe、Trp、Pro），N 端包含脂肪族氨基酸（Val、Ile、Lys、Arg 和Leu）。對長鏈肽而言，ACE 抑制作用與C 端氨基酸有關。

3.2 抗氧化活性

自由基介導的脂質氧化、氧化應激和抗氧化劑是當前許多研究領域廣泛關注的問題。許多疾病與自由基攻擊膜脂、蛋白質和DNA 有關，如糖尿病、癌癥、神經退行性疾病和炎癥。此外，食品中脂質的氧化和過氧化會導致食品變質。許多合成抗氧化劑，如丁基羥基苯甲醚（BHA）和丁基羥基甲苯（BHT）被用作食品添加劑，以防止變質。這些合成抗氧化劑比天然抗氧化劑（如-生育酚和抗壞血酸）具有更強的抗氧化活性，但由于其具有細胞毒性和DNA 損傷作用，這些化合物的使用已開始受到限制。因此，能夠用于食品和醫藥材料的天然來源的抗氧化劑化合物引起了人們的廣泛關注。研究表明，食物來源的蛋白質水解物除了具有營養特性外，還具有抗氧化功能，這些功能與生物活性肽有關，目前海洋類抗氧化肽的來源主要為藻類（紫菜、鹽藻、掌形藻、小球藻）、貝類（鮑魚、文蛤）以及羅非魚。具有抗氧化活性的海洋多肽來源及其作用效果如表2 所示。

表2 海洋多肽的抗氧化活性及作用效果Table 2 Antioxidant activity and effect of marine peptides

到目前為止，抗氧化肽的構效關系仍不明確。一般認為分子量大小，特別是在500～3000 Da 范圍內，是影響蛋白質水解物抗氧化活性的關鍵因素，較小的分子量以及序列中的疏水和/或芳香氨基酸可能有助于增強多肽的抗氧化活性。肽的結構（氨基酸序列）與其活性之間也有重要聯系，多肽N 端位置含有的疏水性氨基酸可以提高其抗氧化能力；含有組氨酸的多肽具有很強的抗氧化活性，這可能與咪唑環的螯合和捕獲自由基的能力有關。

3.3 抗腫瘤活性

癌癥是由正常細胞異常增殖引起的疾病，通常表現為細胞生長失控，最終損害正常細胞功能。海洋肽通過誘導癌細胞凋亡、下調PI3K/Akt 信號通路、抑制癌細胞增殖和促進血管生成而具有顯著的抗癌活性。與藥物相比，海洋多肽分子量小、易被吸收、特異性強，近幾年在癌癥治療方面備受關注。從海洋生物中提取的抗癌肽大都是富含D-氨基酸、-氨基酸、-氨基酸、羧酸和噻吩的小環肽，有些還含有烯鍵和炔鍵，這大大提高了肽的穩定性和生物利用度。海洋類抗腫瘤肽的來源主要為藻類（螺旋藻、紫菜）、貝類（雜色蛤、牡蠣）和海綿。具有抗腫瘤活性的海洋多肽來源及其作用效果如表3 所示。

表3 海洋多肽的抗腫瘤活性及作用效果Table 3 Antitumor activity and effect of marine peptides

與健康細胞相比，癌細胞通常含有更多的微絨毛，從而使細胞表面積增大，這種特性可以促進抗腫瘤肽與癌細胞結合。因此，抗腫瘤肽與細胞膜組分之間的靜電相互作用被認為是這些肽選擇性殺傷癌細胞的主要原因。除了理化性質外，肽的二級結構對于細胞表面相互作用（包括肽結構取向）也是必不可少的。肽的取向可以增強與癌細胞膜靶向相互作用的表面活性，相互作用的角度導致癌細胞膜上脂質堆積不穩定，從而導致膜滲透。

近年來在海洋生物中發現了近百種具有抗腫瘤作用的海洋多肽，其中90%的多肽是通過誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤活性的。脫氫膜海鞘素B（Dehydrodidemnin B）為脂肽類環狀縮肽，通過靶向細胞凋亡機制發揮抗腫瘤作用，在低濃度時（0.01% μg/mL）對乳腺癌、卵巢癌、腎癌及肉瘤等均有明顯活性，其免疫抑制活性與目前臨床上常用的免疫抑制劑類固醇激素相比要高出100～1000 倍。海洋多肽的來源是困擾多肽藥物發展的主要問題，許多海洋多肽只能從一種物種中獲得。例如，Dehydrodidemnin B 只能從膜海鞘（）中提取到。多肽藥物比小分子化藥結構復雜，合成成本較高，需要開發合適的化學合成技術解決多肽藥物來源困難的問題。

3.4 其他生物活性

從不同海洋生物中分離的肽結構多樣，因此具有多種功能活性。Hajfathalian 等的研究強調了不同來源的海洋多肽通過不同機制具有抗遺傳毒性/抗突變、抗貧血、抗肥胖、免疫調節和細胞調節的潛力。Fan 等評估了從螺旋藻中獲得的肽的抗肥胖作用，結果表明四種肽（NALKCCHSCPA、LNPSVCDCMMKAAR、NPVWKRK 和 CANPHELPNK）均對脂肪細胞增殖具有顯著的抑制作用（32.3%～60.1%）。陶雅浩等發現牡蠣肽可以提高小鼠的運動耐力，增強蛋白質分解供能能力，減少運動過程中對骨骼肌的損傷。在另一項研究中，Narayanasamy等證明了從海蟹腿部肌肉中分離的肽（LGLGLGAAVL，M713.5 Da）在脂多糖誘導的RAW 264.7巨噬細胞中對COX-2 的抗炎活性。

4 結語

海洋活性肽具有藥理穩定性、強效性、特異性和高度安全性的特點，對防治癌癥、艾滋病、心腦血管病、老年病等疑難病癥具有獨特效果，已成為開發新藥、特藥的主要方向之一。人體必需的氨基酸都可以從海洋生物中提取，而海洋生物中的氨基酸資源極其豐富。海洋活性肽結構獨特，許多化合物具有在陸地上從未發現過的新型骨架結構。然而，到目前為止，關于從海洋生物中分離具有高產量和生物活性的新肽的研究還很有限。開發基于納米技術的新技術，將海洋肽封裝在各種納米結構中，如納米乳液、納米脂質體和聚合物納米顆粒，以增強其體內穩定性和生物利用度尤為重要。海洋肽的研究方向應側重于尋求具有更高選擇性和分辨率的分離、純化技術，以獲取高收率、低成本的新型肽。此外，應加強海洋多肽在人類臨床試驗方面的應用，以開發多肽類藥物和功能性食品。