乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

左夢(mèng)楠，劉 偉 ，全 琦，張菊華,

（1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長(zhǎng)沙 410000；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長(zhǎng)沙 410000；3.果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410000；4.湖南省果蔬加工與質(zhì)量安全國(guó)際科技創(chuàng)新合作基地，湖南長(zhǎng)沙 410000）

乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。乳酸菌可分為乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、雙歧桿菌屬和片球菌屬5 個(gè)屬。乳酸菌發(fā)酵不僅能提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味，還能提高食品的保藏性和附加值。乳酸菌發(fā)酵劑廣泛用于食品深加工，生產(chǎn)酸奶、肉類、面包、泡菜等。絕大部分乳酸菌都是人體內(nèi)必不可少的、可為宿主帶來健康益處、具有重要生理功能的益生菌群，如調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、加強(qiáng)新陳代謝，增強(qiáng)免疫作用并表現(xiàn)出抗癌和抗病毒等作用。近年來，由于人們?cè)絹碓街匾暼樗峋墓δ芴匦约捌鋵?duì)人體健康的有益作用，乳酸菌在醫(yī)藥、食品、生物技術(shù)等領(lǐng)域均得到了廣泛的應(yīng)用。

高活性直投式乳酸菌發(fā)酵劑具有發(fā)酵活力強(qiáng)、體積小、便攜、使用方便等特點(diǎn)，可直接用于發(fā)酵制品的生產(chǎn)，省去擴(kuò)大培養(yǎng)的復(fù)雜操作過程，從而簡(jiǎn)化產(chǎn)品生產(chǎn)工藝，有利于保持產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，防止菌種退化和污染。乳酸菌高密度培養(yǎng)是高活性發(fā)酵劑制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其顯著性特點(diǎn)是能夠以較低的發(fā)酵體積和較短的發(fā)酵周期，獲得較高的目標(biāo)菌體密度，在發(fā)酵設(shè)備和體積不變的情況下，高密度發(fā)酵可以提高批次發(fā)酵結(jié)束時(shí)的產(chǎn)品得出量。本文從影響乳酸菌高密度培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法等重要因素進(jìn)行了歸納總結(jié)，以期為乳酸菌的高密度培養(yǎng)和直投式發(fā)酵劑的制備提供理論依據(jù)。

1 乳酸菌高密度培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)消耗模式

乳酸菌對(duì)生長(zhǎng)條件要求挑剔，同種物質(zhì)對(duì)不同乳酸菌的增殖效果不一樣。影響乳酸菌高密度培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需求可分為碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等。對(duì)乳酸菌營(yíng)養(yǎng)成分的消耗模式進(jìn)行分析，可為乳酸菌的高密度培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1.1 碳源

碳源作為微生物生長(zhǎng)過程中的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為乳酸菌的生長(zhǎng)提供能量，提高物質(zhì)向細(xì)胞的運(yùn)輸速度，加快細(xì)胞合成和新陳代謝，促進(jìn)乳酸菌的快速增殖。乳酸菌生長(zhǎng)所需要的碳源一般是糖類及其復(fù)合物，葡萄糖是最常見的碳源類物質(zhì)，乳酸菌主要通過糖酵解途徑、Leloir 途徑、磷酸戊糖途徑及磷酸乙酮醇酶途徑等對(duì)糖類進(jìn)行分解代謝，不同糖類對(duì)乳酸菌的代謝途徑影響不一，不論以何種糖類物質(zhì)為碳源，一般都通過轉(zhuǎn)化為葡萄糖或葡萄糖6-P 進(jìn)行反應(yīng)，碳水化合物代謝和糖酵解變化過程如圖1 所示。

圖1 碳水化合物代謝和糖酵解變化示意圖[16]Fig.1 Schematic diagram of changes in carbohydrate metabolism and glycolysis[16]

不同乳酸菌的糖類促生長(zhǎng)作用也不一樣。在增殖過程中，提高脫脂乳培養(yǎng)基中的乳糖濃度可以顯著提高的細(xì)胞密度。單糖和雙糖對(duì)BBE 09-18 的促生長(zhǎng)效果優(yōu)于淀粉等多糖，所研究的碳源中使用麥芽糖培養(yǎng)的效果最好，活菌數(shù)可達(dá)1.88×10CFU/mL，其次是-乳糖，活菌數(shù)可達(dá)1.83×10CFU/mL。乳酸桿菌屬對(duì)單糖和雙糖的代謝親和能力具有相似性，可將單糖和雙糖同發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乳酸。混合糖培養(yǎng)物可作為乳酸菌增殖的優(yōu)良底物，研究在2 g/L 的半乳糖和10 g/L 的阿拉伯糖混合物中生長(zhǎng)具有最大的活性。益生元也具有作為碳源底物的潛力，在食品工業(yè)上低聚果糖可促進(jìn)乳酸菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)。與商業(yè)Raftilose（R）P95 相比，乳酸菌在果寡糖（FOS）混合物中的細(xì)胞密度更高,有些菌株在產(chǎn)生的FOS 混合物中生長(zhǎng)的速度甚至比在所有其他碳源中都要快。乳果糖衍生寡糖也可作為乳桿菌屬、鏈球菌屬和雙歧桿菌屬促生長(zhǎng)的碳源類物質(zhì)，其促增殖效果還與糖苷鍵結(jié)構(gòu)、乳酸菌酶活性有關(guān)。任何食品工業(yè)的成功通常都集中在碳底物的成本上，碳源的優(yōu)化是降低經(jīng)濟(jì)成本的關(guān)鍵。

1.2 氮源

乳酸菌不能合成一些生長(zhǎng)必須的氨基酸等物質(zhì)，從而嚴(yán)格限制了乳酸菌的高密度生長(zhǎng)。尤其營(yíng)養(yǎng)缺陷型的乳酸菌菌株，只有在具有可用氮源的適宜環(huán)境中才能高效生長(zhǎng)和增殖。實(shí)驗(yàn)室高密度培養(yǎng)過程中一般添加游離氨基酸，或者已降解的蛋白質(zhì)或肽類作為生長(zhǎng)過程的氮源，進(jìn)行能量代謝、ATP 轉(zhuǎn)運(yùn)等，乳酸菌利用氨基酸和蛋白質(zhì)的機(jī)理如圖2。如在培養(yǎng)基中添加大豆蛋白和乳清蛋白水解物可促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，多肽和寡肽也可作為植物乳桿菌的有效氮源。大量研究表明促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)效果最顯著的氮源類物質(zhì)為酵母膏，相比其它的氮源，它所達(dá)到的細(xì)胞密度最高，雖然單獨(dú)添加的氮源類水解物增殖效果不如酵母膏表現(xiàn)突出，然而與酵母膏聯(lián)合使用可使細(xì)胞數(shù)量提升1.0～1.5 個(gè)數(shù)量級(jí)。所以進(jìn)行乳酸菌高密度培養(yǎng)培養(yǎng)成分優(yōu)化，一般會(huì)采用復(fù)合氮源的方法進(jìn)行優(yōu)化研究。

圖2 乳酸菌利用氨基酸和蛋白質(zhì)的機(jī)理圖[18]Fig.2 Diagram of the mechanism of lactic acid bacteria using amino acids and protein[18]

氮源類物質(zhì)是乳酸菌生長(zhǎng)過程中的關(guān)鍵成分，實(shí)驗(yàn)室常用的氮源類物質(zhì)生長(zhǎng)效果良好，但工業(yè)化應(yīng)用的成本往往十分昂貴。尋找經(jīng)濟(jì)高效的氮源類替代物是工業(yè)化應(yīng)用面臨的難題。目前常采用其它較為經(jīng)濟(jì)的氮源與培養(yǎng)過程中的昂貴氮源混合優(yōu)化，通過減少酵母膏等昂貴類氮源的使用來降低成本。Hom 等發(fā)現(xiàn)鱈魚內(nèi)臟水解物（蛋白胨）是一種很有前途的氮源類經(jīng)濟(jì)生長(zhǎng)介質(zhì)，其與酵母提取物以1:1 的比例混合替代可提高植物乳桿菌10%的生物量，降低工業(yè)生產(chǎn)成本。玉米漿含有高含量的氨基酸和多肽以及大量的復(fù)合維生素，是一種極好的低成本氮源，可顯著增強(qiáng)乳酸桿菌的生長(zhǎng)。

1.3 無機(jī)鹽

乳酸菌高密度培養(yǎng)過程補(bǔ)充無機(jī)鹽主要是作為緩沖物質(zhì)，調(diào)節(jié)菌體生長(zhǎng)過程中的pH 變化，維持乳酸菌生長(zhǎng)的適宜pH 環(huán)境，延長(zhǎng)發(fā)酵劑的活性。乳酸菌培養(yǎng)基中常用的緩沖鹽體系有磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉/檸檬酸、磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀/氫氧化鈉、磷酸氫二鉀/乙酸鈉/檸檬酸鈉等。緩沖鹽中的無機(jī)離子還能以陽離子、陰離子的形式被乳酸菌吸收進(jìn)行生物合成、酶活性激活和運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)、也在一定程度上為乳酸菌的生長(zhǎng)補(bǔ)充了微量元素。比如Cl、NO、SO、PO、Na、K、NH、Ca、Mg等是生物體大量所需的，而其它如Mn、Zn只需少量或微量。

無機(jī)鹽中某些離子的類型和濃度對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)和活性影響也不相同。細(xì)胞能量酶的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合可能需要依賴某些多價(jià)陽離子如Mg、Ca和Mn等，Mg、Mn可顯著促進(jìn)格氏乳桿菌的最大比生長(zhǎng)率，而Zn、Cu對(duì)其生長(zhǎng)具有抑制作用。當(dāng)鹽濃度超過0.04 mmol/L 時(shí)，IMAU95219的菌體密度隨緩沖鹽體系的濃度增加而降低。Dupree 等通過研究發(fā)現(xiàn)合適的鹽濃度不僅不會(huì)抑制乳酸菌等有益微生物的生長(zhǎng)，反而還會(huì)刺激它們的生長(zhǎng)。植物乳桿菌經(jīng)乳酸和乳酸鈉鹽溶液亞致死水平誘導(dǎo)處理后，與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝、核苷酸代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)，其活菌存活率顯著提高。無機(jī)鹽還可作為菌體細(xì)胞成分的構(gòu)成、酶的激活劑或抑制劑。研究還表明免疫生物菌株在緩沖鹽中顯示出很高的內(nèi)在耐熱性，增強(qiáng)了菌株在應(yīng)激條件下的保護(hù)能力。

緩沖鹽對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)具有重要作用，不同微生物生長(zhǎng)所需無機(jī)鹽的種類也是不一樣的。乳酸片球菌受磷酸氫二鉀的作用生長(zhǎng)效果顯著增強(qiáng)，IMAU95219 的最適生長(zhǎng)緩沖鹽體系為磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉，格氏乳桿菌的最適緩沖鹽體系組成為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉。

1.4 生長(zhǎng)因子

生長(zhǎng)因子是一類能夠調(diào)節(jié)微生物生長(zhǎng)，但乳酸菌自身難以合成的一類結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同的物質(zhì)。常用作生長(zhǎng)因子的物質(zhì)有三種，分別是氨基酸、核苷酸和維生素類物質(zhì)（見圖3）。其中對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)效果影響較顯著的當(dāng)屬氨基酸類和維生素類物質(zhì)。乳酸菌中的氨基酸分解代謝在氧化還原力或代謝能量的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)pH 的控制以及抗應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用。研究表明精氨酸可以促進(jìn)嗜熱鏈球菌T1C2的生長(zhǎng)，在KLDS 1.0738的高細(xì)胞密度生長(zhǎng)過程中，氨基酸消費(fèi)量最高的是谷氨酸（1.62 mmol/L）和甘氨酸（1.53 mmol/L），其次是天冬氨酸（1.15 mmol/L）和丙氨酸（0.85 mmol/L），它們參與保護(hù)KLDS 1.0738免受低pH 環(huán)境的損害。Yao 等在以脫脂乳為乳酸菌培養(yǎng)基質(zhì)的高密度培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)V、V和生物素在希臘乳桿菌生長(zhǎng)過程中具有不可或缺的作用，這可能是因?yàn)榫S生素與脂肪酸的合成、糖代謝主要酶的表達(dá)有關(guān)。許多乳酸菌是嘌呤和嘧啶類營(yíng)養(yǎng)缺陷菌，這些乳酸菌可能對(duì)脫氧核苷有額外的需求，乳球菌隨嘌呤含量的增加，可增強(qiáng)對(duì)多種脅迫的抗性，提高生長(zhǎng)能力。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)果蔬汁可作為益生菌增殖的良好載體物質(zhì)，在微生物發(fā)酵過程中，將其作為外源增殖因子加入到乳酸菌培養(yǎng)基中確實(shí)會(huì)提高乳酸菌的生長(zhǎng)能力和活性。這可能是因?yàn)楣咧某煞州^復(fù)雜，含有纖維、礦物質(zhì)和維生素等，比單一的化學(xué)合成成分營(yíng)養(yǎng)元素的種類更加多元，符合乳酸菌的生長(zhǎng)要求，例如番茄汁、胡蘿卜汁等作為外源因子可明顯促進(jìn)菌株的增殖。

圖3 乳酸菌培養(yǎng)的促生長(zhǎng)因子Fig.3 Growth-promoting factors of lactic acid bacteria culture

1.5 其它營(yíng)養(yǎng)成分

吐溫類物質(zhì)常被用作乳酸菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基的添加劑，其所含的油酸部分可以影響細(xì)胞膜的組成和特性，從而可以促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，保護(hù)細(xì)胞免受酸性、營(yíng)養(yǎng)消耗等不利環(huán)境的影響。研究發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸是大多數(shù)乳酸菌生長(zhǎng)的必需因子，可代替吐溫類物質(zhì)促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，其主要是在細(xì)胞質(zhì)膜上發(fā)揮作用，通過顯著降低脂肪酸生物合成所需的能量來刺激生長(zhǎng)，研究表明脂肪酸可以增加低溫下干酪乳桿菌在干酪提取物中的細(xì)胞密度。

2 乳酸菌高密度培養(yǎng)基選擇

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

對(duì)高密度培養(yǎng)來說，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇至關(guān)重要，它必須適合乳酸菌的生長(zhǎng)，并且能夠得到大量高活力的菌體。乳酸菌對(duì)生長(zhǎng)條件的要求很挑剔，不同種類的乳酸菌生長(zhǎng)需求不同，所需要的營(yíng)養(yǎng)成分及比例也不盡相同，而且乳酸菌在不同生長(zhǎng)時(shí)期的物質(zhì)消耗也不相同，這就決定了乳酸菌在培養(yǎng)過程中的復(fù)雜性。如表1 所示，列舉了關(guān)于不同種類的乳酸菌培養(yǎng)基，一般以化學(xué)合成成分的培養(yǎng)基為主，依據(jù)MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)其所含碳源、氮源、無機(jī)鹽等進(jìn)行種類和比例優(yōu)化，同時(shí)獲得較高的細(xì)胞密度，大多在10～10CFU/mL。例如以蔗糖、海藻糖、乳糖等糖類物質(zhì)代替培養(yǎng)基中的葡萄糖，以成本較低的大豆蛋白粉代替昂貴的氮源類物質(zhì)，減少培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本。

表1 常見乳酸菌的高密度培養(yǎng)基Table 1 High-density medium for common lactic acid bacteria

2.2 改良副產(chǎn)物培養(yǎng)基

商業(yè)微生物培養(yǎng)基因?yàn)槠涫褂玫某煞滞馨嘿F，因此在乳酸菌高密度培養(yǎng)生產(chǎn)中的應(yīng)用成本是十分巨大的。由于乳酸菌通常用于各種行業(yè)，特別是作為益生菌，尋求更便宜的替代介質(zhì)是很有必要的。大量研究表明果蔬加工副產(chǎn)物可在乳酸菌培養(yǎng)過程中起到補(bǔ)充碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用，能夠顯著支持乳酸菌的生長(zhǎng)。隨著乳酸菌市場(chǎng)的應(yīng)用日益增大，選擇經(jīng)濟(jì)高效的新型發(fā)酵培養(yǎng)基成為未來不斷追求的目標(biāo)。利用食品廢棄物或工、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品等作為乳酸菌高密度生產(chǎn)的培養(yǎng)介質(zhì)，是一種很有前途、對(duì)環(huán)境友好的乳酸菌高密度培養(yǎng)方法。

2.2.1 農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物 利用低成本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)將大規(guī)模降低生產(chǎn)成本。常見的農(nóng)用副產(chǎn)物有乳清、乳清滲透物、淀粉類廢棄物、玉米漿木質(zhì)纖維素材料等。Katarzyna 等以小麥、玉米、大麥和黑麥粉為主要成分，設(shè)計(jì)了一種半固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果表明所選菌株的細(xì)胞產(chǎn)量比在MRS 培養(yǎng)基中高。張艷麗研究了五種農(nóng)副產(chǎn)品棉粕、豆粕、麩皮、次粉、葵花盤粉作為營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)情況的影響，結(jié)果表明棉粕和豆粕可顯著促進(jìn)植物乳桿菌生長(zhǎng)，使用淀粉類農(nóng)作物廢棄物也是一種良好的降低益生菌生長(zhǎng)所必需的碳源營(yíng)養(yǎng)成本的解決方案，例如玉米面可作為益生菌LOCK 0860 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的基本介質(zhì)，而且在后續(xù)噴霧干燥過程中與菊粉混合作用可使細(xì)胞活力提升4 倍以上，具有很大的經(jīng)濟(jì)效益。Thakur 等在模擬GIT 條件下，用竹筍和馬鈴薯皮提取物作為發(fā)酵底物，探究乳酸菌的體外益生作用，結(jié)果表明不僅降低了碳底物的成本，而且通過將環(huán)境廢棄物轉(zhuǎn)化為合適的生物質(zhì)，減少了預(yù)期發(fā)酵目標(biāo)的成本。

2.2.2 工業(yè)副產(chǎn)物 食品工業(yè)副產(chǎn)物如大豆渣、糖蜜、工業(yè)廢水、果汁廢棄物等含有基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可作為乳酸菌增殖的培養(yǎng)介質(zhì)，這些廢棄物的處理涉及重大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境管理成本，減少環(huán)境中污染物的必要性和最大限度地提高原材料回報(bào)的必要性鼓勵(lì)了人們尋求利用食品工業(yè)廢料作為培養(yǎng)基基礎(chǔ)的新方法。Coghetto 等首次報(bào)道了利用大豆液體酸性蛋白渣進(jìn)行植物乳桿菌生長(zhǎng)的研究，這種殘?jiān)刑呛偷头肿恿康牡鞍踪|(zhì)，常作為工業(yè)廢水排放，將它作為一種替代基質(zhì)生產(chǎn)益生菌，而不需要?jiǎng)游飦碓吹某煞郑色@得高生物量的批量生物反應(yīng)器。酒廠乙醇生產(chǎn)廢水與糖蜜兩者副產(chǎn)物結(jié)合可作為一種低成本的培養(yǎng)基，且其產(chǎn)量和生物量密度與傳統(tǒng)工業(yè)培養(yǎng)基相當(dāng)，這也是首次嘗試尋找用于生產(chǎn)植物乳桿菌生物質(zhì)的低成本培養(yǎng)基的方法。在對(duì)生物質(zhì)工業(yè)副產(chǎn)物的研究過程中，發(fā)現(xiàn)糖蜜是一種很好的培養(yǎng)材料，Papizadeh 等利用工業(yè)副產(chǎn)物甘蔗糖蜜研制了一種高產(chǎn)RPR 42 的培養(yǎng)基。果汁等產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的果渣也富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，其處理問題一直是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，利用蘋果渣制備生物菌劑可進(jìn)行乳酸發(fā)酵綜合利用。利用棗汁廢料優(yōu)化設(shè)計(jì)的新型培養(yǎng)基可對(duì)乳酸乳球菌的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用。海藻生產(chǎn)生物柴油后的廢棄物也可作為發(fā)酵底物進(jìn)行乳桿菌增殖。

2.2.3 其它副產(chǎn)物 除農(nóng)業(yè)、工業(yè)副產(chǎn)物外，研究發(fā)現(xiàn)水生雜草水萵苣的汁液可以直接用于制備生長(zhǎng)培養(yǎng)基，通過分析表明，它含有豐富的發(fā)酵糖、蛋白質(zhì)和氨基酸，以水萵苣汁為原料制成的培養(yǎng)基，細(xì)胞密度比普通培養(yǎng)基高出10%～60%，且對(duì)水解物的產(chǎn)糖沒有任何副作用。加工處理副產(chǎn)物的優(yōu)化除了用作乳酸菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基外，還可以作為固定化基質(zhì)的形式存在，提高酶催化活性，避免引起競(jìng)爭(zhēng)抑制問題。總而言之，對(duì)副產(chǎn)物的利用發(fā)展有助于最大程度實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)能的利用，隨著時(shí)代的發(fā)展，環(huán)境保護(hù)成為越來越重要的話題，利用副產(chǎn)物設(shè)計(jì)新型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基將越來越受歡迎。

3 乳酸菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

除培養(yǎng)基的組成外，乳酸菌生長(zhǎng)還受到一系列不同條件的影響，如溫度和pH、通氣和攪拌等。對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)條件進(jìn)行探索優(yōu)化，不僅可以最大程度地提高生物量產(chǎn)量，還可以節(jié)約成本，有利于工業(yè)化應(yīng)用。

3.1 pH 與溫度

研究發(fā)現(xiàn)除碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)顯著影響乳酸菌生長(zhǎng)外，pH 和溫度是最重要的生長(zhǎng)參數(shù)，對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)溫度和pH 進(jìn)行優(yōu)化對(duì)乳酸菌商業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。乳酸菌生長(zhǎng)的最適pH 范圍為5.5～6.0，能在其他乳酸菌不能生長(zhǎng)的酸性環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖。但乳酸菌在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生乳酸等，導(dǎo)致更低的pH 環(huán)境，對(duì)生長(zhǎng)不利。實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化pH 的方法一般通過將初始pH 調(diào)整到菌體最適生長(zhǎng)酸堿度環(huán)境，但工業(yè)化應(yīng)用更加復(fù)雜，可能會(huì)涉及到生長(zhǎng)過程的酸堿度變化，往往采用恒pH 培養(yǎng)、分批培養(yǎng)等方法保證生長(zhǎng)最適pH 范圍。pH 和溫度的影響是緊密相連的，不同pH 條件下對(duì)應(yīng)的最適溫度也不一樣，例如在探究乳酸菌調(diào)控餐廚垃圾剩余污泥發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響機(jī)制中，發(fā)現(xiàn)pH 越低所需的最適溫度越高，pH 為11 時(shí)的最適溫度是20 ℃，pH 為9 和7 時(shí)的最適溫度分別是35 和50 ℃。

培養(yǎng)溫度主要通過影響乳酸菌關(guān)鍵酶的活性發(fā)揮作用，在較高的生長(zhǎng)溫度下，可觀察到能量代謝途徑受到抑制，例如脂肪酸、核苷酸和氨基酸的生物合成，與氮和碳源吸收相關(guān)的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶（PTS）系統(tǒng)和ATP 結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）系統(tǒng)上調(diào)。理想的發(fā)酵溫度可以加快發(fā)酵進(jìn)程，非最佳溫度下滯后期相當(dāng)長(zhǎng)，并且對(duì)乳酸菌的酶活性造成不利影響，導(dǎo)致更長(zhǎng)的生產(chǎn)時(shí)間。除此之外，溫度對(duì)乳酸菌生物量如乳酸的生產(chǎn)具有重要影響，DSM 20531T細(xì)胞生長(zhǎng)在含淀粉的培養(yǎng)基中對(duì)溫度具有很強(qiáng)的依賴性。所以在乳酸菌高密度培養(yǎng)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，溫度的優(yōu)化是很重要的考慮條件，它能夠增強(qiáng)生物活性和產(chǎn)生更高的生物量。

3.2 通氣與攪拌

對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的外部因素如攪拌、通氣條件的研究也有助于生產(chǎn)高效能的益生菌制劑。乳酸菌是兼性厭氧型微生物，所以必須考慮氣相環(huán)境對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，與酸堿度、溫度的影響效果不同，它可能會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和代謝模式，只有降低環(huán)境中或菌株自身產(chǎn)生的活性氧的威脅，才能提高乳酸菌的存活力。乳酸菌在氮?dú)獾榷栊詺怏w條件下的生理活性、比生長(zhǎng)速率、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗速率和細(xì)胞存活率最高，發(fā)酵處于最優(yōu)狀態(tài)，最大活菌數(shù)可高達(dá)到1.8×10CFU/mL。研究表明通氣方式也對(duì)益生菌的最大活菌數(shù)產(chǎn)生影響，乳桿菌R8 在間歇通氮?dú)獾臈l件下，菌體的終濃度最高，OD 值達(dá)到12 以上，在持續(xù)通氮?dú)饣蛴玫獨(dú)獗旱臈l件下，菌體終濃度比不通氣時(shí)還低。

在乳酸菌液體高密度培養(yǎng)過程中，攪拌的作用是使中和劑與發(fā)酵培養(yǎng)液混合均勻，及時(shí)中和高密度培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的酸，減少酸性物質(zhì)的積累對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用，同時(shí)增大培養(yǎng)物氣液相的接觸面積。攪拌速率不宜過大，以免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大的剪切力，損傷細(xì)胞，影響細(xì)胞活性。攪拌和通氣有利于培養(yǎng)基的均勻性、底物的可用性、以及改變細(xì)胞代謝產(chǎn)物和生成氧轉(zhuǎn)移的增加，是乳酸菌生物量生產(chǎn)的重要條件，Gutierrez-Sarmiento 等對(duì)BAL-03-ITTG 的攪拌條件和曝氣條件等重要生長(zhǎng)因素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在300 r/min 攪拌、0.13 vvm曝氣條件下，乳酸菌的生長(zhǎng)及生物量生產(chǎn)比未處理?xiàng)l件下高，首次為植物乳桿菌BAL-03-ITTG 在攪拌罐生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)提供了有價(jià)值的信息。

4 乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)改進(jìn)

對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行分析，根據(jù)抑制因素的不同主要分為底物抑制模型和代謝產(chǎn)物抑制模型。底物濃度不足或過高都會(huì)限制細(xì)胞生長(zhǎng)。同時(shí)在乳酸菌高密度培養(yǎng)過程中，會(huì)形成大量的乳酸等代謝產(chǎn)物，造成生長(zhǎng)環(huán)境pH 降低，阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)。減少這些抑制因素對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響，可實(shí)現(xiàn)乳酸菌的高密度培養(yǎng)。如表2 所示，分批培養(yǎng)技術(shù)是最常見的培養(yǎng)技術(shù)，通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的pH 環(huán)境，維持菌株增殖的穩(wěn)態(tài)環(huán)境來促進(jìn)乳酸菌高密度生長(zhǎng)，通過補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的分批補(bǔ)料培養(yǎng)技術(shù)可同時(shí)減少底物和產(chǎn)物抑制的影響。膜培養(yǎng)技術(shù)是在膜條件基礎(chǔ)上，供給新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)，定期除去發(fā)酵培養(yǎng)的低分子產(chǎn)物，更大程度地減少培養(yǎng)環(huán)境的壓力，延長(zhǎng)乳酸菌的生長(zhǎng)時(shí)間。除此之外，固定化培養(yǎng)技術(shù)將乳酸菌細(xì)胞固定在特定的培養(yǎng)基質(zhì)上，使其盡可能地遠(yuǎn)離培養(yǎng)環(huán)境帶來的不利影響，為乳酸菌的生長(zhǎng)提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，增強(qiáng)乳酸菌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。

表2 乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)Table 2 Research methods for high-density cultivation of lactic acid bacteria

5 其它優(yōu)化培養(yǎng)策略

單菌株的代謝途徑和能力可能不夠完善，共同培養(yǎng)、取長(zhǎng)補(bǔ)短可以更好地發(fā)揮菌株的益生特性。在連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器（CSTR）和透析膜反應(yīng)器中，混合培養(yǎng)和，研究表明對(duì)的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用，同時(shí)也可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為的底物乳酸，生產(chǎn)丙酸鹽和醋酸鹽，實(shí)現(xiàn)丙酸較高的生產(chǎn)率。

改善菌株特性也是乳酸菌高密度培養(yǎng)的技術(shù)之一。對(duì)菌株進(jìn)行馴化可以得到高糖耐受型、耐熱型、耐鹽型、耐酸型、耐冷型的乳酸菌菌株。通過基因工程進(jìn)行重組也可得到耐受型或高產(chǎn)型的菌株。通過分析菌株的基因序列，對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行優(yōu)化也可以改變?nèi)樗峋奶谴x通路，增強(qiáng)對(duì)不同糖類的利用能力。物理手段超聲處理也可以改變細(xì)胞的膜通透性，增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。林楊等采用常壓室溫等離子（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)，獲得1 株蛋白酶活性穩(wěn)定且高產(chǎn)酸的菌株Y8-6，為進(jìn)一步開發(fā)相關(guān)優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源及其在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

6 總結(jié)與展望

乳酸菌高密度培養(yǎng)的顯著優(yōu)勢(shì)在于能夠以較低的發(fā)酵體積和較短的發(fā)酵周期獲得較高的目標(biāo)菌體密度。乳酸菌高密度培養(yǎng)是當(dāng)前食品發(fā)酵工業(yè)研究的熱點(diǎn)之一，也是實(shí)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵劑規(guī)模化生產(chǎn)與應(yīng)用的重要目標(biāo)和方向。乳酸菌高密度培養(yǎng)優(yōu)化一般包括以下兩個(gè)方面：一是通過培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化為乳酸菌的生長(zhǎng)提供最合理的營(yíng)養(yǎng)要素，在最佳生長(zhǎng)條件下獲得細(xì)胞最大化；二是通過控制培養(yǎng)方式，使菌株始終處于生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)環(huán)境，延長(zhǎng)乳酸菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，獲得高密度的細(xì)胞。

但仍有一些方向需要給予更多的關(guān)注和研究。首先，對(duì)高密度培養(yǎng)來說，基礎(chǔ)培養(yǎng)基至關(guān)重要。它必須能獲得大量高活力的菌體、培養(yǎng)后菌體需能夠被分離出來且成本低廉。然而，由于菌體對(duì)生長(zhǎng)要求具有特異性，部分菌體與培養(yǎng)基的分離也一直影響其是否能更好地被利用。另外，培養(yǎng)基的成本也是工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵，雖然已有研究表明副產(chǎn)物有望作為乳酸菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)介質(zhì)，然而還沒有研究表明僅利用生物副產(chǎn)物就可實(shí)現(xiàn)乳酸菌的高密度培養(yǎng)，所以仍需對(duì)乳酸菌高密度培養(yǎng)的生長(zhǎng)介質(zhì)和生長(zhǎng)條件進(jìn)行探究。

其次，高密度培養(yǎng)的菌株種類和功能比較單一，不能滿足實(shí)際生產(chǎn)和生活需求。已有的辦法是從已知的生長(zhǎng)環(huán)境中分離篩選所需要的目標(biāo)菌株或利用新技術(shù)和新方法增強(qiáng)乳酸菌生物活性和生長(zhǎng)能力，以便更加貼合實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)的要求，節(jié)省培養(yǎng)成本。但是乳酸菌市場(chǎng)應(yīng)用日益廣大，仍需開發(fā)探索不同種類和功能的乳酸菌。

最后，不同菌株的代謝途徑或酶活性可能有所不同，需要對(duì)其產(chǎn)能方式進(jìn)行探究，以便在高密度培養(yǎng)過程中，更好地優(yōu)化影響生長(zhǎng)過程的重要營(yíng)養(yǎng)因素，延長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)期，獲得高密度的細(xì)胞。同時(shí)還能通過改變產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，減緩生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞的壓力，提高細(xì)胞繁殖活力。