基于微生物生物完整性指數的北京市城市河道生態系統健康評價

董婧，盧少奇，伍娟麗，王子康，王恒嘉，徐菲

1.北京市環境保護科學研究院

2.國家城市環境污染控制工程技術研究中心

3.首都師范大學

河流生態系統涵蓋飲用水、灌溉用水、景觀用水、養殖用水等與人類生活密切相關的多種功能[1]。然而經濟的快速發展及城市人口的增長，使河流生態系統遭受到一定的破壞，導致河流生態環境退化，敏感物種減少，甚至制約當地經濟的發展[2]。開展河流生態系統健康評價體系研究，選取有效的指標和科學的方法對河流生態系統健康狀況進行準確診斷，進而開展可持續利用與管理，對于促進河流生態系統健康發展具有重大意義[3]。

目前，關于水體生態系統健康評價的研究已有很多，采用的評價方法也不盡相同。其中，應用較多的方法為生物完整性指數( index of biotic integrity，IBI)。IBI評價法是基于多種參數來完成的，通過生物群落組成結構反映生態系統的健康情況。該方法通過建立環境因子與生物參數的定量關系，篩選對環境因子敏感的生物參數，基于比較參數值與系統標準值對生態系統的健康狀況進行評價[4]。

美國學者Karr等[4]在1981年基于魚類群落對IBI體系進行了構建，并對河流健康狀況進行了評價。國內對IBI的研究相對稍晚，20世紀90年代，王備新[5]以底棲動物構建了IBI體系，對黃山地區的溪流進行了健康評價。經過眾多學者對IBI的應用和研究，目前IBI已廣泛應用于水體生態系統健康評價中[6]。

生產者、消費者與分解者的存在組成了完整的水體生態系統。在目前的大多數研究中，對生產者與消費者的關注度較高，雖然分解者也是生態系統的重要組成部分，但其在構建IBI時卻往往被忽略[7]。水體中的分解者主要由微生物構成，同時微生物也是整個生態系統中數量最多的物種[8]。微生物處于食物網的基礎營養級，對生態系統的反應速度往往高于生產者與消費者，因此在生態系統健康狀況發生改變時，微生物的指示要早于處于較高營養級的生產者與消費者[9]。另外，隨著污染程度的加深，生產者與消費者的數量往往會大幅衰減，從而影響了采集樣品的豐富度，導致無法以生產者與消費者作為合適的生物指標。而分解者則不受此影響，在受污染的水體中，以微生物為主體的分解者往往會更加活躍，群落結構也具有相當的豐富性。因此，以分解者——微生物群落作為主要對象構建IBI指數體系用于評估水體生態系統健康是值得關注的重要研究方向[10]。Kondratieff等[11]研究發現，微生物種群結構會明顯受到人類活動的影響，遠離工業源和人為源的地區以自養微生物為主，人類活動和工業源較多地區異養微生物顯著增加。Garrido等[12]對比了地下水和污水處理廠二級、三級出水微生物種群結構，結果表明，擬桿菌門、γ-變形桿菌門、硝化螺旋門相對豐度與β-變形菌門相對豐度之比存在顯著差別。因此，微生物可以作為指示生物對河流健康狀況起到指示和預警作用。Lau等[13]應用細菌群落結構指數（bacterial community index，BCI），成功評價了溪流生態健康情況。安新麗等[14-17]通過Illumina高通量測序技術，構建了微生物的生物完整性指數(microbial index of biotic integrity，M-IBI)的指標體系，并將其成功應用于地下水、濕地、城市河流的健康狀況評價中。

中國北方城市多為缺水城市，城市河道大多以城鎮再生水廠出水為補水，不同于自然水補水的河道，以再生水補水的河道往往受人為干擾較大。盡管再生水的常規水質指標與天然水體無明顯差別，但以再生水補水的河道的生態系統較天然水體補水的河道顯著不同。城市河道受人為干擾較大，其健康狀況通常會成為制約城市發展的重要因素。因此探求城市河道的生態健康狀況，并采用準確有效的方法對其進行評價，對城市河道管理具有重要意義。筆者以北京市4條河流為研究對象，設置15個代表性采樣點，分析其微生物群落結構和水環境理化因子特征，比較微生物群落結構的差異性；以微生物為指示生物，運用M-IBI評價體系對4條河流進行生態系統健康評價，以期為北京市河流生態系統健康維護與管理提供支撐，同時為其他地區河流生態系統健康評價提供參考。

1 研究區與研究方法

1.1 研究區概況與采樣點設置

選取北京市4條具有代表性的城市河道作為研究對象。其中，永定河以自然水體為河道補給水源，經門頭溝區、石景山區、豐臺區、房山區、大興區，自大興區崔指揮營村東出市境域。在永定河設置2個采樣點（YDH1、YDH2）。清河、涼水河、大龍河3條城市河道以再生水廠出水作為補給水源，自西向東流經人類活動密集的城區。清河從北京市海淀區頤和園西北角的安河閘起〔北長河（京密引水渠）與北旱河匯合處〕向東北流，經肖家河、朱房村、清河、河北村、立水橋、沈家村、沙子營后，在立水橋以東入溫榆河。在清河設置4個采樣點（QH1、QH2、QH3、QH4）。涼水河流經石景山、豐臺、朝陽、大興、通州等區，于榆林莊閘上游匯入北運河。在涼水河設置5 個采樣點（LSH1、LSH2、LSH3、LSH4、LSH5）。大龍河為北京市境內的河流，起自黃村南鐵道口閘，從西北向東南流經大興縣的4個鄉鎮，至白塔村東與小龍河匯合。在大龍河設置4個采樣點（DLH1、DLH2、DLH3、DLH4）。河流采樣點如圖 1所示。

圖 1 4條城市河道采樣點位置Fig.1 Location of 4 urban river sampling points

1.2 樣品采集與分析

1.2.1 樣本采集和水質分析

于2020年9月—2021年3月進行樣品的采集。每個點位各采樣3次（冬季有的河道結冰未采樣）。水樣和沉積物樣品的采集與分析參照《水與廢水監測分析方法》[18]進行，同時測定化學需氧量（CODCr）、總磷（TP）、石油類、氨氮（NH3-N）、溶解氧（DO）、生化需氧量（BOD5）、總氮（TN）、As、pH等指標。

1.2.2 DNA 抽提和 PCR 擴增

根據FastDNA? Spin Kit for Soil (MP Biomedicals，美國)說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度；使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對 16S rRNA 基因V3～V4 可變區進行PCR擴增，擴增程序如下：95℃ 預變性 3 min，27 個循環（95 ℃ 變性 30 s，55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 30 s），然后 72 ℃穩定延伸 10 min，最后在 4 ℃ 進行保存（PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型）。PCR 反應體系：5×TransStart FastPfu緩沖液 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL ， 下 游 引 物 （5 μmol/L ）0.8 μL ，TransStart FastPfu DNA 聚合酶 0.4 μL，模板 DNA 10 ng，補足至20 μL。每個樣本3個重復，取平均值。

1.2.3 Illumina Miseq測序

將同一樣本的PCR產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, 美國)進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus?Fluorometer (Promega, 美國) 對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫：1)接頭鏈接；2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3)利用PCR擴增進行文庫模板的富集；4)磁珠回收PCR產物得到最終的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.2.4 數據處理

使用Fastp（version 0.20.0）軟件對原始測序序列進行質控，使用Flash（version 1.2.7）軟件進行拼接：1）過濾序列（reads）尾部質量20 bp以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量低于20 bp，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的序列（reads），去除含氮堿基的序列（reads）；2）根據PE 序列之間的重疊（overlap）關系，將成對序列拼接（merge）成 1 條序列，最小重疊（overlap）長度為 10 bp；3）拼接序列的重疊區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；4）根據序列首尾兩端的標簽序列（barcode）和引物區分樣品，并調整序列方標簽序列（barcode）允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。

使用UPARSE（version 7.1）軟件根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier (version 2.2)軟件對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA數據庫，設置比對閾值為70%。

1.3 M-IBI 評價體系的構建

1.3.1 參考點與污染點的區分

基于GB 3838—2002《地表水環境質量標準》對水樣TP、石油類、NH3-N、DO、CODCr、BOD5、TN、As、pH這9項因子進行賦分，即達到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ類水質標準，分別記為5、4、3、2、1分，未達Ⅴ類水質標準，計為0分，對各指標求平均值即可得到該采樣點水質總得分。水質總得分大于90%分位數的采樣點為參考點，其他采樣點為受人類影響較大的干擾位點。其中，水質總得分小于10%分位數的采樣點為高度受干擾位點，10%～90%分位數的采樣點為中度受干擾位點[19]。

1.3.2 備選指標的確定與篩選

選取與微生物群落豐富度、結構、組成和功能相關的參數作為計算M-IBI的備選指標。其中，與群落組成相關的參數選擇主要涉及優勢種分布及與水質變化密切相關的微生物組成；與功能相關的微生物主要包括致病菌、污染物降解菌和參與營養物質代謝循環的菌屬。通過RDA分析篩選關鍵的環境因子，利用加權平均回歸的方法計算各分類單元的最適值，運算方法參照文獻[1]。通過采用典型相關分析和Spearman相關性分析，明確顯著影響河道微生物群落組成的水質指標及其與各類微生物間的相關系數和顯著性。其中，與關鍵水質指標顯著相關的微生物組成可作為備選指標。參照文獻[20-24]對備選指標進行干擾反應、判別能力分析和相關性分析，篩選出用以計算M-IBI的生物參數指標。其中，判別能力分析對備選指標進行Pearson相關性分析，若2個指標的相關性系數（R）≥0.70，表明二者所反映的信息重疊性較大，選擇其中之一用于構建MIBI評價體系。

1.3.3 M-IBI的計分及評價標準

采用比值法計算M-IBI。其中，對隨干擾增大而減小的指標，各指標的分值等于指標值除以所有采樣點的95%分位數；對隨干擾增大而增大的指標，以所有采樣點的5%分位數為最佳期望值進行計算。計算方法：（最大值－指標值）/（最大值－5%分位數）。該方法規定，經計算后的分值分布為0～1，若大于1，則記為1。以參考點IBI的95%分位數作為健康評價的最佳值，低于該值的分布范圍進行五等分，靠近95%分位數的一等分代表被測樣點處于健康狀態，隨后依次是亞健康、一般、較差和極差的劃分標準。

2 結果與分析

2.1 關鍵因子的確認

研究區各采樣點微生物信息通過高通量測序進行分析，共獲得 986 148條序列，選擇Shannon、Simpson、Ace、Chao、Coverage和PD 多樣性指數進行分析，各采樣點微生物多樣性指數分析結果如表1所示。Shannon、Simpson和PD指數反映群落多樣性，Ace和Chao指數反映群落豐富度，Coverage指數反映群落覆蓋度。由表1可知，永定河的Shannon、Ace、Chao、Coverage和PD多樣性指數與清河、涼水河和大龍河存在顯著差異。

各河道采樣點主要水質指標測定及得分計算結果如表2所示。15個采樣點的水質總得分為3.22～4.22，50%和95%分位數分別為3.56和4.00。因此，水質總得分大于4.00的采樣點（YDH1、YDH2）為低干擾點，即參考點；水質總得分為3.56～4.00和小于3.56的采樣點分別為中等（9個）和較高（3個）干擾強度點，均為污染點。

表 1 4條城市河道各采樣點水體微生物多樣性指數Table 1 Microbial diversity index of water bodies at sampling points of four urban rivers

表 2 4 條城市河道各采樣點主要水質參數及其得分Table 2 Main chemical and physical properties and scores at sampling point of four urban rivers

采用RDA分析微生物群落結構變化與水質指標間的關系，結果如圖2所示。由圖2可知，TN、TP、NH3-N、NO3-N和NO2-N與微生物群落分布具有顯著相關關系（P＜0.05）。氮和磷濃度均是影響微生物群落結構的重要因素，不同微生物對氮和磷的耐受程度存在差別。

分析存在顯著相關性的水質指標（TN、TP、NH3-N、NO3-N和NO2-N）與微生物群落之間的Spearman相關性，結果如圖3所示。由圖3可知，放線菌門（Actinobacteriota）的相對豐度與TP、NO3-N和NO2-N濃度呈負相關，Patescibateria（新物種）的相對豐度與NH3-N和NO2-N濃度呈負相關，Acidobacteriota的相對豐度與TP、NO2-N濃度呈正相關，綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度與NO3-N濃度呈正相關，Bacteroidota的相對豐度與NH3-N濃度呈正相關，藍藻門（Cyanobacteria）的相對豐度與NO3-N濃度呈正相關，Proteobacteria的相對豐度與TP濃度呈負相關，與NH3-N濃度呈正相關，厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度與NH3-N濃度呈正相關，脫硫桿菌門（Desulfobacterota）的相對豐度與NH3-N濃度呈正相關。因此，將這些與主要水質指標呈顯著相關性的微生物組成納入后續評價的備選指標中。

圖 2 各采樣點微生物門水平群落結構與環境因子相關的RDA分析Fig.2 Redundancy analysis (RDA) of microbial community structure and environmental factors

圖 3 微生物門水平組成(相對豐度排名前10)與水質指標的Spearman相關性分析結果Fig.3 Spearman correlation analysis between microbial community phylum composition (top10) and water quality index

2.2 備選指標的篩選

選用可以反映河道微生物群落多樣性、結構和功能，同時可反映水質變化的相關微生物組成作為河道M-IBI的備選指標，共確立15個備選指標（表3）。

通過對15個備選指標進行判別能力分析，篩選出Shannon指數、Bacteroidota相對豐度、Chloroflexi相對豐度、Cyanobacteria相對豐度、CODCr耐受屬相對豐度和NH3-N清潔屬相對豐度6個指標進行Pearson相關性分析，結果發現，6個指標的|R|＜0.75（表4），說明指標之間差異性顯著，并且具有統計學意義。因此，可以將這6個指標用于M-IBI評價體系的計算。

表 3 M-IBI 備選指標描述及對干擾的反應Table 3 Description of candidate metrics for M-IBI and their direction of response to disturbance

表 4 M-IBI指標的Pearson相關性分析結果Table 4 Pearson's correlation analysis results of M-IBI index

2.3 M-IBI指標體系評價及評價結果

將篩選出的指標采用比值法計算各指標分值（表5），確定比值法的M-IBI指標體系評價標準(表6)，進而得出所有采樣點M-IBI評分及健康評價結果(表7)。結果表明：根據水質得分選定的YDH1、YDH2 2個參考點均為健康狀態；清河有2個采樣點為健康，2個采樣點為亞健康；涼水河有2個采樣點為健康，2個采樣點為亞健康，1個采樣點為一般；大龍河有3個采樣點為亞健康，1個采樣點為一般。評價結果為一般的采樣點處于涼水河和大龍河中段區域，位于城市地區，受人為活動干擾較大，盡管其水質條件較其他采樣點無本質區別，但生境條件和生態系統健康水平狀況較其他采樣點略差。

表 5 6個M-IBI指標在各采樣點的分布及其生物指數計算公式Table 5 Distribution of six M-IBI indexes at all sampling points and formulas for calculating biological index

表 6 基于 M-IBI 指數的城市河道生態系統健康評價標準Table 6 Urban river ecosystem health assessment criteria based on M-IBI index

表 7 各采樣點M-IBI評價結果Table 7 M-IBI evaluation results of each sampling point

3 討論

3.1 M-IBI評價結果的可行性

本研究通過Illumina高通量測序計算獲得河道中微生物的信息，使用M-IBI對河道健康狀況進行分析，評價結果基本符合現實河道水體生境狀態，即以自然水體為補水的城市河道健康程度較高，而以再生水為補水的城市河道大多處于亞健康水平，說明M-IBI可以有效區分不同河道的生態健康情況。何晨鳳[24]分別利用微生物和浮游植物評價湖泊生態系統健康狀況，發現2種評價結果整體變化趨勢一致，但小范圍內存在一定差異，其原因為2種評價方法的采樣點不完全一致，同時由于環境因子的解釋度較低，需要獲取更多對微生物群落結構產生重要影響的環境因子信息。朱文婷等[16]利用M-IBI評價蘇州市濕地健康水平，其評價的有效性也綜合考慮了主要環境因子、土地利用方式及河道類型等的響應，并開展了相應的驗證，說明M-IBI可以反映濕地水生態系統的狀況。安新麗等[14]應用M-IBI對尾礦庫周邊地下水生態系統進行評價，評價結果可較好地區分不同采樣點的水質優劣狀況。盡管M-IBI已經被應用于河流、湖泊、地下水等健康狀況的評估，但由于研究尚不夠完善，相關的環境因子和微生物候選指標的選擇需要進一步標準化。

3.2 微生物作為指示生物的潛力

城市河道生態系統與自然水體生態系統存在顯著區別，尤其是以再生水為補水的城市河道。盡管大型城鎮再生水廠出水CODCr、NH3-N等指標與自然水體并沒有顯著差異，但河道中微生物種類卻顯著不同，以M-IBI比對城市河道和自然水體，可以綜合評估水質和生物對水體生態系統健康的影響，同時可以篩選出典型污染的耐受種和敏感種，其在水生態系統中的豐度對水體條件有著良好的指示作用。

通過對CODCr、NH3-N、TP等主要指標耐受種和敏感種的篩選分析發現，Modulibacteria被評定為NH3-N耐受種，其僅存在于健康狀態一般的采樣點，而在其余采樣點的相對豐度均為0；Fibrobacterota也被評定為NH3-N耐受種，其在參考點永定河中相對豐度為0，在涼水河和大龍河中沿程相對豐度逐漸增加，在健康狀況為亞健康和一般的采樣點相對豐度較高。這2個細菌門也被報道與黑臭水體中硝酸鹽和NH3-N存在顯著的相關性[25]，因此有可能作為水體變差的指示物種。

4 結論

（1）構建了城市河道生態系統健康評價的MIBI指標體系，包括Shannon指數、Bacteroidota相對豐度、Chloroflexi相對豐度、Cyanobacteria相對豐度、CODCr耐受屬相對豐度和NH3-N清潔屬相對豐度6個指標，通過M-IBI指標體系對永定河、清河、大龍河、涼水河生態系統健康進行評價。結果表明，永定河2個采樣點均為健康狀態；清河4個采樣點為健康至亞健康；涼水河5個采樣點為健康至一般；大龍河4個采樣點為亞健康至一般，無較差或極差的情況。

（2）永定河以自然水體作為補水，其生態系統處于健康狀態；涼水河、清河、大龍河以再生水廠出水作為補水，大多數采樣點處于亞健康狀態。

（3）以微生物作為指示生物，應用IBI方法可以較好地評價城市河道生態系統健康情況，但由于微生物鑒定結果的局限性以及研究的區域性，其結果的適用性有待進一步調查和驗證。