磷對硫自養(yǎng)反硝化效果的影響

趙東華，岳冬梅，鄭巖皓，束夢照，葛俊，孫菲菲

中交上海航道勘察設(shè)計研究院有限公司

硝酸鹽濃度是衡量水環(huán)境質(zhì)量的重要水質(zhì)指標之一，其過量進入水體不僅易引起水體富營養(yǎng)化，破壞水生生態(tài)系統(tǒng)，還威脅飲用水安全[1-2]。研究表明，硝酸鹽污染已經(jīng)成為地表水和地下水共同面臨的重要水環(huán)境問題之一[2]，我國地表水和地下水硝酸鹽污染情況也不容樂觀[3-4]。張鑫等[3]收集了我國7大地區(qū)的71條主要河流硝酸鹽氮-N）濃度數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)7.83%的河流-N濃度超過了10 mg/L，其中牡丹江、海河和長江入海口的-N濃度超過20 mg/L，呈重度污染。據(jù)《中國生態(tài)環(huán)境狀況公報(2018年)》[4]，全國2 833處淺層地下水監(jiān)測井水質(zhì)總體較差，-N為主要超標指標之一。

目前，傳統(tǒng)異養(yǎng)生物反硝化因其經(jīng)濟、高效的特性被廣泛用于污水脫氮。傳統(tǒng)異養(yǎng)反硝化以碳源為電子供體，將-N還原為氮氣從而實現(xiàn)脫氮，但當進水碳氮比（C/N）過低時，需要額外投加碳源，投加量不足時難以滿足反硝化過程，而投加過量則會產(chǎn)生二次污染，反硝化過程受進水水質(zhì)影響較大。硫自養(yǎng)反硝化以單質(zhì)硫或硫的還原態(tài)化合物作為電子供體，將-N還原為氮氣，擺脫了對碳源的依賴，可以作為異養(yǎng)反硝化的替代方案，用于C/N較低的地表水和地下水脫氮，因此備受研究者關(guān)注[5-8]。

磷作為參與微生物生長和代謝的大量元素，其濃度極大地影響著微生物的生長代謝。大量研究表明，磷限制會顯著影響生物反硝化效率，補充磷后脫氮率會大幅度提升[9-11]。Moon等[10]采用硫單質(zhì)作為電子供體的自養(yǎng)反硝化柱處理硝酸鹽污染的地下水，磷限制時，系統(tǒng)難以去除硝酸鹽，補充磷后，出水-N濃度顯著下降。Fan等[11]利用硫自養(yǎng)和混養(yǎng)反硝化活性污泥系統(tǒng)處理模擬的低磷濃度微污染地表水，發(fā)現(xiàn)補充磷能顯著提升-N去除率。由于氮、磷在污水處理過程中的去除率以及在自然界中遷移轉(zhuǎn)化特性等方面的差異，導(dǎo)致很多輕污染河湖水、地下水及某些污水處理廠尾水中的磷濃度很低[9,12]，這可能會對反硝化效率產(chǎn)生不利影響。此外，很多污水處理和水體修復(fù)工程中，氮和磷均需要去除，但大多數(shù)水處理工藝中氮和磷的去除是不同步的，因此在工藝設(shè)計中往往需要考慮脫氮除磷的先后順序，或者將反硝化進水中的磷控制在既滿足反硝化的需求又不會導(dǎo)致磷污染的濃度水平。因此，有必要深入研究能滿足硫自養(yǎng)反硝化的最低磷濃度，但目前該方面的研究還比較缺乏。Wang等[9]研究表明，適合硫自養(yǎng)反硝化的最低可生物利用磷濃度為0.15 mg/L，但該研究中-N濃度僅為4.5 mg/L，難以為-N濃度較高的水處理提供支持。

筆者通過考察不同磷濃度對硫自養(yǎng)反硝化的效果和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以探究硫自養(yǎng)反硝化所需的最低磷濃度，以及磷濃度對硫自養(yǎng)反硝化效率的影響機理。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

采用內(nèi)徑為6 cm、高50 cm的有機玻璃柱進行試驗。柱子內(nèi)部從下至上依次裝填礫石（直徑為1～2 cm）5 cm，單質(zhì)硫與石灰石混合層40 cm（單質(zhì)硫與石灰石體積比為1∶1，片狀單質(zhì)硫直徑為0.5 cm，石灰石直徑為0.5～1 cm），礫石（直徑為0.5～1 cm）5 cm。進水為連續(xù)流，下進上出，由蠕動泵控制流量。整個試驗過程中，有機玻璃柱放置在室溫約20 ℃的房間中。

1.2 進水及運行參數(shù)

試驗周期為2021年2月3日—4月1日，共57 d，分為常規(guī)運行期、磷饑餓期和磷恢復(fù)期3個階段（表1），共設(shè)置7個處理組，每組設(shè)2個平行。各處理組全部采用自然掛膜的方式啟動，啟動時的進水為處理生活污水的生物接觸氧化池出水。系統(tǒng)成功啟動后，試驗進水均為低磷濃度的池塘水，通過補充一定量的KNO3和KH2PO4將進水調(diào)至所需的氮、磷濃度水平。常規(guī)運行期和磷饑餓期各處理組的進水及運行參數(shù)均相同；磷恢復(fù)期，各處理組的進水總磷（TP）濃度分別為0.050、0.075、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/L（溶解性反應(yīng)磷占TP的比例不低于95%），其他進水理化指標均相同。整個試驗期內(nèi)各處理組水力停留時間（HRT）均設(shè)為3.5 h。

表 1 試驗系統(tǒng)運行階段與運行參數(shù)Table 1 Operational phases and parameters of the test system

1.3 水質(zhì)指標檢測

水樣先經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，然后再進行檢測分析。-N濃度采用紫外分光光度法測定，亞硝酸鹽氮-N）濃度采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定，硝態(tài)氮-N）濃度為-N和-N濃度之和。

1.4 微生物樣品分析

在磷恢復(fù)期的第16天，分別取磷饑餓和磷恢復(fù)處理組有機玻璃柱中段單質(zhì)硫樣品，進行微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

1.4.1 DNA提取、PCR擴增和lluminaMiSeq測序

使用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取樣品總DNA后檢測DNA質(zhì)量。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量后，加入引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和 805R（5'- GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），使用PCR基因擴增儀來擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)，擴增條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5 個循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20 個循環(huán)；最后延伸72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物作為第2輪擴增的模板，引入Illumina橋式PCR兼容引物，擴增條件：95℃ 3 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，5 個循環(huán)；最后延伸72 ℃ 5 min。在2%（w/v）瓊脂糖凝膠上檢測PCR產(chǎn)物，并使用Qubit3.0熒光定量儀進行定量。設(shè)3個平行樣，將純化的擴增子等摩爾合并，MiSeq文庫構(gòu)建和測序均在生工生物工程(上海)股份有限公司進行，測序平臺為llumina MiSeqPE300。

1.4.2 序列處理與分析

獲得原始序列后，使用PRINSEQ過濾質(zhì)量低于20的堿基。通過USEARCH將優(yōu)化后的序列以97%的相似度聚類為OTU，然后將代表性序列與核糖體數(shù)據(jù)庫（RDP數(shù)據(jù)庫，http://rdp.cme.msu.edu）進行比對。使用Mothur軟件基于OTU信息計算Alpha多樣性指數(shù)，包括Shannon、Simpson、Chao和Ace指數(shù)。

2 結(jié)果與討論

圖 1 常規(guī)運行期和磷饑餓期進出水-N濃度及去除率Fig.1 Concentrations of influent and effluent-N and its removal efficiency during the normal and phosphorus starvation periods

2.1 磷饑餓對硫自養(yǎng)反硝化效果的影響

以磷酸鈣沉淀的形式部分截留下來[13]，而反硝化菌群能利用固態(tài)的磷酸鈣作為磷源[14]。

圖 2 常規(guī)運行期和磷饑餓期進出水-N濃度Fig.2 Concentrations of influent and effluent-N during the normal and phosphorus starvation periods

2.2 硫自養(yǎng)反硝化所需的最低磷濃度

在經(jīng)過20 d的磷饑餓后，將7個處理組進水磷濃度分別調(diào)至0.050、0.075、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/L，以分析硫自養(yǎng)反硝化所需的最低磷濃度。由圖3可知，進水磷濃度越高的處理組，其-N去除率越快恢復(fù)至饑餓前水平。進水磷濃度為0.400、0.500 mg/L的處理組，-N去除率在補充磷的第3天，恢復(fù)至磷饑餓前水平，穩(wěn)定達到98%以上。進水磷濃度為0.300 mg/L的處理組，-N去除率在補充磷的第6天，恢復(fù)至磷饑餓前水平。進水磷濃度為0.200 mg/L的處理組，-N去除率在補充磷的第9天，恢復(fù)至磷饑餓前水平。進水磷濃度小于0.200 mg/L的處理組，在本試驗周期內(nèi)，-N去除率始終未曾恢復(fù)至饑餓前水平。

圖 3 磷恢復(fù)期不同進水磷濃度下的-N去除率Fig.3 -N removal efficiency under different influent phosphorus concentrations during phosphorus recovery period

Wang等[9]研究認為，當-N濃度為5～16 mg/L時，硫自養(yǎng)反硝化所需的最低生物可利用磷濃度為0.150 mg/L，其計算依據(jù)主要為出水相對于進水減少的磷濃度，即硫自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)磷去除量。但也有研究發(fā)現(xiàn)，當反硝化系統(tǒng)磷去除量為0.148 mg/L，而進水磷濃度為0.160 mg/L時，并不能支撐反硝化系統(tǒng)進行完全反硝化[14]。多種因素，如HRT、進水硝酸鹽濃度和進水磷濃度等，均會影響硫自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)的磷去除量[14]，因此不同運行條件下，硫自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)磷去除量可能存在較大差異。此外，充足的磷有利于增強反硝化系統(tǒng)對進水水質(zhì)水量波動的耐受性[9]，從本研究中也可以發(fā)現(xiàn)，磷充足時（常規(guī)運行期），硫自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)能適應(yīng)進水硝酸鹽濃度的較大變化，當進水-N濃度從10 mg/L提升至21 mg/L時，-N去除率未發(fā)生明顯變化（圖1）。因此，本研究以能滿足硫自養(yǎng)反硝化實現(xiàn)最大-N去除率的最低進水磷濃度，即0.200 mg/L，作為硫自養(yǎng)反硝化所需的最低磷濃度。

2.3 磷濃度對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

在磷恢復(fù)期的第16天，分別采集磷饑餓處理組（進水磷濃度為0.050 mg/L的處理組，已經(jīng)處于磷饑餓狀態(tài)36 d）和磷恢復(fù)處理組（進水磷濃度為0.500 mg/L）中段的硫磺顆粒，進行高通量測序。

2.3.1 微生物多樣性

磷饑餓和磷恢復(fù)處理組的高通量測序分別獲得212和232個OTU，并且2個樣品的檢測覆蓋率(coverage)均在0.99以上，表明本研究中測序結(jié)果幾乎囊括了樣品中所有的細菌物種，能夠反映樣品中細菌群落的真實情況(表2)。

Alpha多樣性指數(shù)可以反映微生物群落的豐度和多樣性。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映樣品的多樣性程度，Shannon指數(shù)越高，而Simpson指數(shù)越低，表明微生物群落的多樣性越高；Chao指數(shù)和Ace指數(shù)是用不同的算法估計樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，其值越大，表明物種數(shù)越多，微生物群落的豐度越高。由表2可知，以上4個指數(shù)均表明，磷恢復(fù)處理組的物種多樣性及豐度均高于磷饑餓處理組，其他研究也表明營養(yǎng)鹽充足時的物種多樣性顯著高于饑餓條件下的物種多樣性[11,20]。

2.3.2 群落結(jié)構(gòu)

基于RDP數(shù)據(jù)庫的分類信息，分別對磷饑餓及磷恢復(fù)處理組的高通量測序數(shù)據(jù)進行了屬水平上的分類分析，結(jié)果見圖4。從圖4可看出，磷饑餓和磷恢復(fù)處理組的優(yōu)勢菌屬差異很大。磷饑餓處理組的優(yōu)勢菌屬（占比大于1%）為Psychrobacter（35.34%）、Desulfocapsa1（0.11%）、Sulfurisoma（3.93%）、Luteolibacter（3.79%）、Rhizobium（2.94%）、Simplicispira（2.12%）、Pseudomonas（2.00%）。Psychrobacter是一類嗜冷菌，但能適應(yīng)多種溫度范圍，Psychrobacter具有修復(fù)被雜環(huán)化合物、烴類、藥物等污染環(huán)境的潛力[21]。Zheng等[22]從好氧生物濾池分離了一株P(guān)sychrobacter，能在好氧條件下以硝酸鹽和亞硝酸鹽為電子受體進行反硝化。但是，目前關(guān)于該類細菌的研究還較少，其生理生化特征、在反應(yīng)中的具體代謝過程和在反硝化過程中的作用還有待進一步研究。Desulfocapsa是一類硫酸鹽還原菌，廣泛存在于自然水體和污水處理系統(tǒng)中，會與異養(yǎng)反硝化菌群競爭碳源，但也有些硫酸鹽還原菌能同時進行反硝化。硫自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)-N去除率下降時，Desulfocapsa的豐度顯著增加，而具有硫自養(yǎng)反硝化功能的Thiobacillus豐度則顯著下降[23]。磷恢復(fù)處理組的優(yōu)勢菌屬為Sulfurimonas

圖 4 不同處理組屬水平上微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Microbial community structure at genus level of different treatment groups

(21.86%)、Sulfurisoma(15.39%)、Thiobacillus(8.53%)、

Psychrobacter(2.96%)、Rhizobium(2.36%)、

Pseudomonas(2.18%)、Luteolibacter(1.80%)、

Flavobacterium(1.28%)。其中，豐度最高的

Sulfurimonas、Sulfurisoma、Thiobacillus均為硫自養(yǎng)反硝化相關(guān)的功能菌屬，三者的相對豐度之和高達

45.78%。但在磷饑餓處理組中，參與硫自養(yǎng)反硝化過程的功能菌相對豐度較低，Sulfurimonas、

Sulfurisoma、Thiobacillus僅 為0.29% 、3.93%和

0.45%，三者的相對豐度之和為4.67%。磷的添加顯著促進了硫自養(yǎng)反硝化功能菌的生長。此外，饑餓會顯著改變系統(tǒng)的優(yōu)勢菌屬，磷限制會導(dǎo)致硫自養(yǎng)反硝化功能菌在系統(tǒng)中的豐度大幅減少，當營養(yǎng)恢復(fù)后，其豐度又會大幅提升[9,11,20,24]。這可能也是磷饑餓時-N去除率大幅下降，而磷恢復(fù)后其去除率又逐步提升的重要原因。

3 結(jié)論

（3）磷恢復(fù)處理組的微生物多樣性和豐度均顯著高于磷饑餓處理組。磷濃度極大地影響著硫自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)，硫自養(yǎng)反硝化相關(guān)功能菌屬在磷饑餓處理組的相對豐度僅為4.67%，而在磷恢復(fù)處理組中的相對豐度高達45.78%。