改性藍藻生物炭促進生物電化學系統陰極氫自養反硝化過程研究

熊江磊，羅嘉豪，嚴群

1.中國電子系統工程第二建設有限公司

2.江南大學環境與土木工程學院

含硝酸鹽廢水的過量排放和不當處置可能導致出生缺陷、致畸性和發生突變等不良影響，故這類廢水的有效處理已受到廣泛關注[1]。與物理化學法或生物處理法等常規處理手段相比，利用生物電化學系統（BES）處理廢水對能耗及污泥處理的需求更低[2]。此外，與以硫、鐵及其化合物為底物的自養反硝化相比，以氫為電子供體時的氫自養反硝化過程終產物僅為氮氣和水，且無有害副產物，對環境更加友好[3]。據報道，變形菌門（Proteobacteria）中的陶厄氏菌屬（Thauera）和氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga）等[4-5]屬于氫氧化型反硝化劑，且其大部分都屬于細菌。因此耦合氫自養反硝化的BES處理硝酸鹽的工藝更具研究價值和應用前景。

為了進一步提升BES陰極反硝化的效率，已出現利用電子穿梭載體促進陰極微生物間的電子傳遞過程的方法[6]。其中，生物炭材料因為其豐富的電活性官能團及良好的生物相容性，已經廣泛應用于農業、環境和能源領域[7]。由于生物炭具有醌-對苯二酚結構以及與縮合芳香族結合的共軛π電子體系2種氧化還原活性結構，因此可以促進生物降解系統中微生物和污染物間的胞外電子傳遞（EET）[8]。此外，通過酸、堿等不同預處理方式，可以提高生物炭表面含氧官能團的種類和豐度以及材料的比表面積，有利于提升生物炭的性能[9-10]。但目前利用生物炭促進BES生物陰極的反硝化過程中的電子傳遞的研究尚不多見。

筆者利用太湖藍藻制備生物炭，并用酸和堿等不同預處理方式對其進行改性。通過掃描電子顯微鏡（SEM）、X射線能譜分析（EDS）和傅里葉紅外光譜（FTIR）等對生物炭的性質進行表征，將生物炭加入到BES反硝化陰極，通過測定硝氮和亞硝氮的濃度研究硝氮還原過程，并借助高通量測序技術對各組BES陰極微生物的群落結構進行測定，探究氫自養反硝化過程中的電子傳遞機制，以期為藍藻生物炭促進生物電化學系統反硝化脫氮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藍藻生物炭的制備和改性

從太湖（無錫市）收集新鮮藍藻并曬干，用去離子水清洗干凈后于105 ℃烘箱（博訊 GZX9146）中烘干3 h。將藍藻粉置于真空管式爐（BEQ BEF-1200C-PV）中熱解。熱解的溫度梯度為5 ℃/min，熱解最終溫度為400 ℃，熱解時間為2 h。收集熱解后的固體，記為ABC-400。

取ABC-400 5 g與同等質量的分析純KOH固體混合，以溫度梯度為10 ℃/min升溫至800 ℃，并停留1.5 h，所得固體記為ABC-800K。取ABC-400 10 g于圓底燒瓶中，加入200 mL硝酸（分析純）溶液，于100 ℃水浴80 min。干燥后按上述方法同樣進行熱解，所得產品記為ABC-800N。另取ABC-400 10 g，以溫度梯度為 10 ℃/min升溫至800 ℃，并停留1.5 h，所得產品記為ABC-800。

1.2 生物炭材料的表征

生物炭材料的表面形貌由場發射掃描電子顯微鏡（SEM，日立 S-4800，日本）觀察，精度為 2 μm。利用全自動比表面積儀（Micromeritics ASAP 2460，美國）對生物炭材料的孔徑分布、比表面積進行分析。材料表面的官能團由傅里葉紅外光譜儀（Thermo Nicolet IS10，美國）檢測，分析軟件為OMNIC（Nicolet，美國）。

1.3 BES反硝化試驗

搭建雙室BES反應器，陰、陽極室通過陽離子交換膜（躍進CMI-7000S，中國）隔開，各室實際容積為480 mL。利用鈦絲將碳纖維材料固定成束，制作兩極室的碳刷。非生物陰極中不含微生物。生物陰極中，陽極微生物的馴化通過數據記錄儀（Keithley 2700，美國）記錄，當陽極電位在-0.55 V保持24 h以上時視為馴化完成。陰極微生物馴化完成的標志則是當陰極電位在-0.63 V并保持24 h以上[11]。

設置2組非生物陰極反應器，其中1組陰極添加0.5 g ABC-800，不添加生物炭材料的另外1組設為對照組，測定陰極9 d的硝態氮、亞硝態氮濃度。根據非生物陰極的結果，進行BES的生物陰極試驗。在微生物馴化完成后，向試驗組分別加入0.5 g ABC-800、ABC-800N和ABC-800K，并以加入的生物炭材料命名反應器，探究不同生物炭對生物陰極反硝化效果的影響。每24 h從陰極室中部取5 mL水樣，依據《水和廢水監測分析方法》[12]測定硝氮和亞硝氮濃度。所有的測試至少進行3次，取平均值。

1.4 高通量測序試驗

陰極的電勢與脫氮效果穩定之后，取各組反應器陰極碳刷上的微生物進行測序。試驗前分上、中、下3處剪取約3 cm的樣品，并與陰極液共同置于EP管中，混合均勻。經DNA提取后，以細菌的16S rRNA基因的V3～V4可變區為靶標進行PCR擴增（ABI GeneAmp 9700，美國）。擴增時的正向引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG），反向引物為 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。純化的擴增子在Illumina Miseq測序平臺上測序，可以同時完成傳統基因組學、功能基因組學等的研究。

2 結果與分析

2.1 生物炭材料的結構表征

2.1.1 生物炭材料的表面形貌

ABC-800、ABC-800N和ABC-800K 3種生物炭材料的表面形貌如圖1所示。由圖1可知，ABC-800的表面較為平滑，偶見顆粒或結晶，掃描區域未出現明顯孔狀結構；生物炭ABC-800N孔洞呈現蠕蟲刻蝕狀，孔洞碳壁互相連通，孔隙結構以微孔為主；而KOH改性后的ABC-800K材料表面為溝壑狀，孔洞穿插于碳壁中，孔隙率較大。可見，2種改性方式都可有效改善生物炭的表面形貌，增加材料表面的孔隙結構。

3種藍藻生物炭表面N、O元素含量的分布如圖2、圖3所示。由圖2可知，3種藍藻生物炭材料中N元素（圖中紅色散點）的分布區域有較大差異，ABC-800N的N元素分布最為廣泛，即其表面含量最高；ABC-800K次之，而ABC-800的N元素含量最低。由圖3可知，O元素（圖中綠色散點）的分布情況與N元素較為相似，ABC-800N在O元素分布上仍表現出最高豐度，而ABC-800最低。通過對3種材料表面元素含量進行分析（表1）可知，ABC-800N中N、O元素含量最高，這可能會使該材料擁有較好的電子傳遞性能。

圖 1 3種生物炭材料的表面形貌Fig.1 Surface morphology of the three biochar materials

圖 2 3種生物炭材料表面N元素含量分布Fig.2 Distribution of N element content on the surface of three biochar materials

圖 3 3種生物炭材料表面O元素含量分布Fig.3 Distribution of O element content on the surface of three biochar materials

表 1 3種生物炭材料表面元素含量Table 1 Surface element contents of the three biochar materials %

2.1.2 生物炭材料的孔隙結構

3種生物炭的N2吸附-脫附曲線、孔徑分布如圖4所示，其中圖4(b)縱坐標dV/dW為孔徑的微分分布，表示孔容隨孔徑變化的關系。由圖4(a)可知，2種改性藍藻生物炭的吸附曲線為Ⅰ型曲線，說明孔內的吸附勢較強，材料改性后微孔數量增多。中壓區出現滯后環，表明改性材料中具有一定數量的中孔[13]。由圖4(b)可知，未經改性的ABC-800平均孔徑較大，孔容較小；而改性的平均孔徑顯著減小，孔容增加，說明對藍藻生物炭的改性可以有效改善材料表面的孔隙結構。此外，ABC-800、ABC-800N、ABC-800K的比表面積分別為1.65、1 040.04和1 731.58 m2/g，表明2種改性方式可以極大地提升藍藻生物炭的比表面積。

圖 4 3種生物炭的N2吸附-脫附曲線和孔徑分布Fig.4 Nitrogen adsorption-desorption isotherms and pore width distribution of the three materials

2.1.3 生物炭表面的官能團組成

由圖5可見，3種生物炭的FTIR譜圖較為相似，其中在3 425 cm-1處出現的寬帶峰，是由于醇、酚羥基或羧基中—OH的伸縮振動引起的；而2 925 cm-1處的吸收峰多數為脂肪烴中C—H的伸縮振動所引起[14]。在1 600 cm-1處有明顯的吸收峰，應歸因于芳香族中C=C結構的伸縮振動，以及共軛醌或酮上存在的C=O結構的伸縮振動[15]。而1 389 cm-1處的吸收峰，則與羧基或苯酚中的—OH結構的彎曲振動相關[16]。在750 cm-1處出現了1個小的吸收峰，可能是高溫熱解過程中產生的吡啶結構所引起的環振動[17]。因此，藍藻生物炭及其改性材料擁有豐富的官能團結構。由于共軛醌、酮結構是良好的電子傳遞結構，既可接受電子也可釋放電子；而ABC-800N芳香類結構C=O官能團所對應的吸收峰強度(1 600 cm-1)大于ABC-800及ABC-800K，因此在生物相容性和電子傳遞能力方面，ABC-800N可能優于ABC-800及ABC-800K。

2.2 生物炭對BES脫氮的影響

2.2.1 對非生物陰極脫氮的影響

2組非生物陰極BES反應器硝氮、亞硝氮濃度隨時間的變化如圖6所示。由圖6可知，當各陰極初始硝態氮濃度為100 mg/L時，由于添加生物炭材料的作用，從第1天起各非生物陰極反應器中硝氮濃度呈現不同程度的下降趨勢。第9天時對照組陰極室內硝氮濃度為79.66 mg/L，而加入ABC-800的BES組反應器陰極硝氮濃度僅為60.52 mg/L，較對照組硝氮脫除率提高112.49%。這表明ABC-800的加入使得BES陰極硝氮的脫除效率提高，其機理為陽極產生的電子經由外部的導線傳遞到陰極后，經過陰極電極后被溶液中的硝酸鹽利用，從而進行還原脫氮，但各反應器中亞硝氮濃度呈現積累的趨勢。對照組的9 d亞硝氮積累濃度遠高于ABC-800組，在第9天時達5.86 mg/L，而ABC-800組僅為1.68 mg/L。這可能是因為亞硝氮更難以接受來自電極上的電子，而ABC-800作為電子穿梭載體，其本身可能會促進亞硝氮的還原。

圖 5 不同生物炭材料的FTIR譜圖Fig.5 FTIR spectra of different biochar materials

圖 6 2 組非生物陰極硝氮、亞硝氮濃度隨時間的變化Fig.6 Variation of nitrate and nitrite concentrations with time in two groups of abiotic cathodes

2.2.2 對生物陰極脫氮的影響

各組BES陰極室內硝氮和亞硝氮濃度變化如圖7所示。由圖7可知，加入3種生物炭后生物陰極中硝氮的濃度均有所下降，其中ABC-800N組和ABC-800K組效果較好，第7天時硝氮濃度分別為5.45和50.75 mg/L，而ABC-800組次之，硝氮濃度為72.06 mg/L；對照組硝氮濃度最高，為99.44 mg/L。4組反應器7 d脫氮效率分別為29.6%（對照組）、46.5%（ABC-800）、96.0%（ABC-800N）和 62.5%（ABC-800K）。這說明加入生物炭后BES陰極的硝氮去除效率明顯提升，且ABC-800N的效果最好。其原因可能是改性后藍藻生物炭表面含有豐富的含氧官能團，且ABC-800N含有較多的與生物相容性及電子傳遞能力相關的芳香性含氧功能基團。但各反應器中亞硝氮濃度的變化表現出一定的差異：對照組和ABC-800組亞硝氮濃度呈上升趨勢，而ABC-800N和ABC-800K組則先上升后下降（圖7）。其中，第3天ABC-800N組達到峰值（1.26 mg/L），而ABC-800K則為5.36（mg/L）；第7天亞硝氮濃度分別為12.06（對照組）、7.21（ABC-800）、0.27（ABC-800N）和2.66（ABC-800K）mg/L，表明對照組和 ABC-800組中均有一定程度的亞硝氮積累，而ABC-800N和ABC-800K組中亞硝氮的脫除效率更高。

圖 7 投加3種生物炭材料后生物陰極硝氮、亞硝氮濃度隨時間的變化Fig.7 Variation of nitrate and nitrite concentrations with time in biological cathode under the addition of three biochar materials

2.3 高通量測序分析

2.3.1 門水平上微生物種群分布

投加不同生物炭材料時共有OTU在門水平的相對豐度如表2所示。由表2可知，加入改性藍藻生物炭后，BES陰極微生物群落在門水平上顯示出較大的差異性。4個試驗組相對豐度占比較高的有變形菌門（Proteobacteria，均值＞30%）、擬桿菌門（Bacteroidota，均值＞12%）以及綠彎菌門（Chloroflexi，均值＞8%）。其中，對照組中的優勢菌群為變形菌門（相對豐度占比為52.15%）和擬桿菌門（12.91%），而加入生物炭后，變形菌門的相對豐度有所下降，分別為37.63%（ABC-800）、30.96%（ABC-800N）和36.02%（ABC-800K）；同時擬桿菌門的含量有所上升，達27.49%（ABC-800）、28.88%（ABC-800N）和21.89%（ABC-800K）。此外，相較于對照組，加入生物炭后BES陰極中放線菌門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對豐度也有所上升， ABC-800N組的相對豐度幾乎是對照組的20倍。因此，在加入生物炭后，氫自養反硝化BES的陰極微生物群落結構發生了較大的變化。原因是生物炭的加入可以改變陰極表面的比表面積與孔徑分布，此外不同的改性方式會導致陰極表面的官能團以及N、O元素含量發生不同程度變化，從而可以不同程度改變微生物的群落分布。

表 2 投加不同生物炭材料后各組反應器微生物的共有OTU在門水平的相對豐度Table 2 Relative abundance of shared OTU of microorganisms in each reactor at phylum level after different biochar materials addition %

2.3.2 屬水平上微生物的群落差異

各組反應器中除了有其特有的微生物種群外，共有的微生物菌屬的相對豐度也有較大差異。因此通過橫向比較各反應器中同一微生物的相對豐度可以判斷加入生物炭后微生物結構的變化(圖8)。與對照組相比，加入藍藻生物炭后BES陰極的微生物群落結構發生很大變化，其中ABC-800N組的陶厄氏菌屬（Thauera）、JGI_0001001_H03以及Thiobacillus等屬的相對豐度明顯提升。Thauera是一種典型的氫自養反硝化細菌，已證實存在于在多種氫營養型反應器中，并與種間電子的直接傳遞過程（DIET）相關[18]；JGI_0001001_H03屬細菌目前較少見于文獻報道中，Yao等[19]在其反硝化效率較好的CW-C組反應器中發現該細菌大量富集，表明其與反硝化過程相關；Thiobacillus也是一種常見的自養反硝化菌，它可以利用電極上的電子作為電子供體進行硝氮的還原，并且與N2O的產生相關[20]。ABC-800組中豐度較高的種屬為PHOS-HE36，其是一種典型的反硝化劑[21]。ABC-800K 組中，Thermomonas及Chitinophagaceae的豐度較高。Bacteroidetes_VC2.1_Bac22見諸于硫酸鹽還原環境中，表明其有可能參與了硫酸鹽的還原[22]；而Thermomonas則是一種效果很好的反硝化劑[23]；Chitinophagaceae是一種氨氧化細菌[24]。這表明ABC-800K組微生物結構發生了不同的改變，出現了其他的代謝機制。

圖 8 添加不同生物炭材料時反應器內微生物種群相對豐度Fig.8 Relative abundance of microbial population in reactors with different biochar materials addition

3 結論

（1）經硝酸改性后的生物炭（ABC-800N）增加了材料本身的比表面積，且其表面含有較多的與生物相容性及電子傳遞能力相關的芳香性含氧官能團。

（2）將ABC-800N投加到BES生物陰極后，其脫氮效率相較對照組明顯提高。

（3）生物陰極高通量測序結果表明，在門和屬水平上，各組反應器的優勢菌屬都包含電活性、產氫和反硝化相關的微生物群落；投加ABC-800N可以促進BES反應器中陰極的氫自養反硝化過程，緩解亞硝態氮的積累，同時提高了與氫自養反硝化及電子傳遞相關的微生物菌屬豐度。