多基因表達與結直腸癌患者病理特征對預后的風險模型構建分析

高艷紅,李華,趙金來,王陽

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界范圍內最常見、發病率最高的癌癥之一，占所有新發癌癥的10%，2020年占所有癌癥死亡人數的9.4%[1-2]。CRC的發生發展受年齡、遺傳等不可改變的風險因素影響，還與環境及飲食習慣等可控因素相關[3]。到2030年，預計全球CRC負擔將增加60%，每年新增病例超過220萬例，且超過110萬人因此死亡[4]。外科手術是CRC最重要的治療方式之一，不同CRC患者的預后差異很大，5年生存率在10%～90%，故準確評估CRC患者預后是一項嚴峻的挑戰[5-6]。目前，預后評估主要基于組織學特征及病理分期，但即使對患者進行分層處理后，同一危險分層的患者生存時間也存在差異，這嚴重影響了患者預后的評估[7]。基因組的不穩定性是CRC發展的重要特征[8]，腫瘤DNA、腫瘤源性細胞及血液中的miRNA常用于CRC的診斷。研究顯示，晚期惡性病變可使循環核酸水平升高約15倍[9]，提示CRC患者預后可能與基因表達間存在一定聯系。故基于此，本研究通過對多基因表達與CRC患者預后間的關系進行分析，并構建預測模型，以便對CRC患者預后提供敏感、特異的預測模型，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年1月—2021年1月于唐山市中心醫院消化內科及胃腸外科行手術治療的299例結直腸癌患者納入研究，根據患者預后將其分為預后良好組及預后不良組，預后不良組患者TMN分期Ⅳ期及低分化比例明顯高于預后良好組(P<0.01)，而2組患者性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、家族史、腫瘤部位、腫瘤直徑、基礎疾病等資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。本研究通過醫院倫理委員會審核并批準(20181226318)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①經病理確診為結直腸癌；②首次行手術治療；③年齡18～75歲；④病例資料完整者。(2)排除標準：①合并其他腫瘤患者；②合并炎性反應，心、腦、腎等臟器功能障礙不耐受手術患者；③合并血液系統或自身免疫系統疾病者；④合并感染性疾病者；⑤合并精神或神經系統疾病，不能配合者。

表1 預后良好組及預后不良組結直腸癌患者基線資料比較Tab.1 Comparison of baseline data of colorectal cancer patients between good prognosis group and poor prognosis group

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 相關基因表達水平檢測：采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)對基因的表達量進行檢測，擬研究Cdc2樣激酶1(Cdc2-like kinases，CLK1)、溶質載體家族2成員3(solute carrier family 2 member 3，SLC2A3)、顆粒酶B(granzyme B，GZMB)及趨化因子配體11(chemokine C-X-C motif ligand 11，CXCL11)基因表達水平。患者均于入院次日清晨抽取空腹肘靜脈血5 ml，離心留取上層血清，置于-20℃環境保存。采用TRIzolTM試劑(Takara生物有限公司生產)提取血清總RNA，用PrimeScriptTM RT試劑盒(Takara生物有限公司生產)進行反轉錄，取cDNA作為熒光定量模板。反應條件為：95℃ 5 min、95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共45個循環。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量(以健康對照人群基因的中位表達量為1)。

1.3.2 隨訪：對患者預后情況進行為期1年的隨訪，術后前3個月每個月要求患者于門診隨診，后每3個月至醫院隨訪1次，若患者未能如期回院面訪，則對患者進行電話或微信隨訪。預后不良定義為結直腸癌患者腫瘤發生、發展、轉移、復發或患者死亡。隨訪過程中有8例患者失聯，按脫落處理，最終共納入患者291例，其中預后不良(組)患者67例，預后良好(組)患者224例。

2 結 果

2.1 2組患者基因相對表達量比較 預后不良組患者的CLK1、SLC2A3 mRNA表達水平明顯高于預后良好組，而GZMB、CXCL11 mRNA表達水平明顯低于預后良好組(P均<0.01)，見表2。

2.3 結直腸癌患者預后影響因素COX回歸分析 以結直腸癌患者預后為因變量，上述資料中P<0.05項目(病理分化程度、TNM分期、CLK1、SLC2A3、GZMB、CXCL11)為自變量，進行單因素COX回歸分析顯示，高、中分化，TMN分期Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ期，高GZMB、CXCL11 mRNA表達是結直腸癌患者預后良好的保護因素，高CLK1、SLC2A3 mRNA表達是結直腸癌患者預后不良的危險因素(P均<0.05);多因素COX回歸分析顯示，高CLK1、SLC2A3 mRNA表達是結直腸癌患者預后不良的危險因素，高GZMB、CXCL11 mRNA表達是結直腸癌患者預后不良的保護因素(P均<0.01)，見表3。

表2 2組結直腸癌患者基因相對表達量比較Tab.2 Comparison of relative gene expression in colorectal cancer patients between the two groups

2.4 風險預測因子的選擇及預測風險模型圖的構建 根據COX回歸分析結果，CLK1、SLC2A3、GZMB、CXCL11 mRNA構建多基因表達風險模型圖，見圖1。風險評分公式=CLK1×1.994+SLC2A3×2.027-GZMB×7.256-CXCL11×5.359。

2.5 結直腸癌患者預后預測模型預測價值分析 應用ROC曲線對納入研究的患者進行內部驗證，結果顯示，CLK1、SLC2A3、GZMB、CXCL11及多基因表達風險模型預測CRC患者預后的AUC分別為0.570、0.635、0.679、0.582及0.758，四項聯合預測價值顯著優于各指標單獨檢測(Z=4.751、4.129、4.483、5.003，均P<0.01)，見表4、圖2。

3 討 論

結直腸癌(CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，2020年新增CRC病例超過190萬，死亡93.5萬人，盡管近年來CRC的診斷及治療取得了巨大進展，但由于CRC轉移及復發率較高，導致其生存率仍不令人滿意[10]。總的來說，CRC在發病率方面排名第三，但在病死率方面排名第二，其特點是療效不佳，預后不良[1, 11]。越來越多的數據表明，轉移性CRC患者的5年生存率為10%～15%，此外，侵襲及轉移導致了90%的CRC患者死亡[12-15]。近年來隨著基因組學研究的不斷深入，基因技術廣泛應用于臨床，能有效識別腫瘤的發生、發展并進行診斷，且能對患者預后進行評估[16-18]。因此，本研究通過對CLK1、SLC2A3、GZMB及CXCL11基因進行分析，篩選影響CRC患者術后預后的風險因素并構建風險預測模型，該模型可以較好地反映患者CRC術后預后情況，對CRC患者術后預測方面有一定的指導意義。同時用于構建模型的4個基因可以為CRC術后預后不良的相關基礎研究提供可供選擇的分子標志物。

表3 結直腸癌患者預后影響因素的單因素及多因素COX回歸分析Tab.3 Univariate and multivariate COX regression analysis of prognostic factors in colorectal cancer patients

注：A.患者危險評分的分布情況，藍色代表預后不良風險較低患者，紅色代表預后不良風險較高患者；B.患者預后不良的發生情況，藍色代表預后良好，紅色代表預后欠佳；C.患者不同基因表達情況及其危險圖1 結直腸癌多基因表達風險評分圖Fig.1 Polygene expression risk score chart

表4 風險模型對結直腸癌患者預后預測價值Tab.4 Prognostic value of risk model for colorectal cancer patients

圖2 多基因表達風險模型預測CRC術后預后風險ROC曲線Fig.2 Polygene expression risk model for predicting CRC postoperative prognosis risk ROC curve

CLK為雙特異性激酶，參與細胞存活、細胞周期控制、分化等多種細胞功能，與糖尿病、白血病及腫瘤的發生發展相關[19-20]。研究顯示[21]，CLK1 mRNA在多種惡性腫瘤中表達異常，且不同腫瘤間表達差異巨大，本研究顯示，CLK1低表達與CRC預后不良有關，而在腎癌患者中高CLK1表達患者預后不佳，這可能與腫瘤間的異質性相關[22-24]。CLK1表達下降可抑制AMPK磷酸化，從而使下游mTOR信號通路激活，上調HIF-1α，增加糖酵解能力，影響線粒體功能，抑制Bcl-2介導的細胞凋亡，而mTOR信號通路系細胞生長、增殖及抗凋亡的重要調節通路，與CRC惡化、轉移密切相關[25-27]，故CLK1高表達可能通過介導該通路而使患者預后欠佳。SLC2A蛋白質家族能催化葡萄糖，是細胞能量的中心調節器，SLC2A3是膜轉運蛋白，其能跨膜轉運葡萄糖[28]。研究顯示[29-30]，在CRC患者中，SLC2A3可以通過激活YAP蛋白從而使CRC腫瘤細胞的侵襲性增加，SLC2A3高表達表明CRC具有更強的攻擊性，使CRC患者出現更高的浸潤水平及臨床分期，促進CRC的進展，此外，SLC2A3與CRC中CD4+和CD8+T細胞的浸潤相關，進一步證實，SLC2A3高表達與CRC發生、發展相關。且多因素COX回歸分析結果顯示，CLK1及SLC2A3高表達程度越高，其預后不佳風險越高。

GZMB為絲氨酸蛋白酶家族成員，是一種有效的細胞毒性分子，由毒性T淋巴細胞及自然殺傷細胞所合成的GZMB能通過穿孔素形成的通道進入腫瘤細胞，靶向消滅癌細胞，除誘導細胞死亡之外，還具有促進組織發育及修復作用[31-32]。目前認為GZMB是抑制腫瘤活動的主要分子，但針對不同腫瘤GZMB表達不同，在口腔鱗癌、膽管癌等多種癌癥中，GZMB表達更高[33]，而在肺腺癌及肺鱗癌等癌癥中表達較低[34]，而這可能與腫瘤表達的異質性及患者的FoxP3表達相關，但大多數癌癥患者，隨著GZMB表達的增加，存活率上升[35]，與本研究結果相一致，預后良好組患者的GZMB表達明顯高于預后不良組。趨化因子是分泌蛋白家族的成員，除與炎性反應密切相關外，趨化因子及其受體在腫瘤細胞增殖、遷移及抗凋亡中也具有重要意義[36]。CXCL11是ELR-CXC趨化因子家族的成員，癌細胞可以通過自分泌或調節微環境中的腫瘤基質細胞釋放CXCL11，CXCL11不僅調節癌細胞的定向運動，還參與腫瘤細胞進出血管、免疫逃逸、增殖及血管生成的過程[37]。相關研究顯示[38]，CXCL11的表達與肺癌患者的總生存期延長呈正相關，這與本研究結果一致，CXCL11高表達的患者其預后良好。CXCL11是RBP-Jκ的新靶點，RBP-Jκ是Notch信號通路的主要轉錄因子，而Notch通路的失調和異常激活與人類腫瘤發生、發展相關[39]，CXCL11高表達患者預后良好可能與此相關。

將COX回歸分析得到的風險構建模型圖，可知CLK1及SLC2A3高表達與預后不良相關，而GZMB及CXCL11高表達與預后良好相關。此外，通過繪制ROC曲線可知，4種基因聯合預測結直腸癌患者預后具有較高的診斷價值，特異度及敏感度相較于其他單一指標具有預測優勢。

綜上，基于多基因表達構建的CRC預后預測模型，能有效對CRC患者術后進行預后評估，并具有較高價值。但本研究具有一定局限性，納入樣本相對較少，并未對相關基因的具體作用機制進行分析，故應進行進一步深入研究，對相關基因表達的具體靶點及其與性別、年齡、地域等因素間的關系進行分析。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

高艷紅：提出研究思路，設計研究方向，課題設計，論文撰寫；李華：設計研究方案、研究流程，論文審核，論文修改；趙金來：實施研究過程，資料搜集整理；王陽：分析整理試驗數據，進行統計學分析