預知子聯合雷公藤紅素對肝癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用及對NF-κB通路的影響

張夜航，彭佩克，方肇勤，盧文麗

上海中醫藥大學基礎醫學院，上海201203

原發性肝癌（以下簡稱“肝癌”）在全世界常見36種惡性腫瘤中發病率居第6位，致死率居第3位。肝癌起病隱匿，增殖迅速，臨床多數患者在診斷時已為中晚期或出現轉移，需要接受除手術、介入等手段外的全身性系統治療，中醫藥是系統治療的重要組成部分。課題組前期體外實驗研究發現，行氣活血法代表中藥預知子醇提物能有效抑制多種肝癌細胞增殖，聯合雷公藤紅素具有協同增效作用，能誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期，然而其體內作用效果尚不清楚。核因子（NF）-κB通路是與腫瘤和炎癥密切相關的經典通路，雷公藤紅素在多種腫瘤研究中顯示對該通路的抑制作用，且多有聯合用藥探索，而預知子對該通路的影響較少涉及。因此，本研究通過建立SMMC7721肝癌荷瘤裸鼠模型，觀察預知子聯合雷公藤紅素對腫瘤生長影響，并從NF-κB通路探討二者聯合的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及細胞

雄性Balb/c裸鼠30只，體質量16～18 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物公司，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心SPF 級實驗室，使用許可證號SYXK（滬）2020-0009。本研究經上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（PZSHUTCM201120006）。人肝癌SMMC7721細胞，購自中國科學院上海細胞庫。細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基，置于37 ℃、5%CO培養箱中培養，3～4 d 傳代1 次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2 藥物及制備

預知子藥材1 000 g，上海康橋中藥飲片有限公司，批號200723，獲取種子208 g，60 ℃干燥過夜，粉碎，加入10倍體積50%乙醇浸泡2 h，80 ℃回流提取2次，每次2 h，合并回流液，過濾，濃縮至膏狀、無醇味，凍干，得凍干粉47 g，置于-80 ℃冰箱保存備用。雷公藤紅素，美國MedChemExpress公司，批號78528。參考文獻[10-11]方法，稱取一定量殼聚糖粉末，磁力攪拌下溶解于0.1 mol/L鹽酸溶液中，4 ℃過夜充分溶脹并除去氣泡，次日4 000 r/min離心10 min去除雜質，置于4 ℃冰箱備用。稱取一定量甘油磷酸鈉粉末，于雙蒸水中充分溶解，置于4 ℃冰箱備用。于4 ℃向殼聚糖溶液中逐滴加入甘油磷酸鈉溶液，繼續攪拌約10 min，即得空白殼聚糖/甘油磷酸鈉凝膠溶液。將適量預知子凍干粉溶于甘油磷酸鈉溶液，4 ℃下逐滴加至殼聚糖溶液，使其終濃度為60 mg/mL；將一定量雷公藤紅素溶于二甲基亞砜，逐滴加至殼聚糖溶液中，再向該溶液中滴加甘油磷酸鈉溶液，搖晃混勻，使其終濃度為0.33 mg/mL；同法制成含相同濃度的預知子提取物和雷公藤紅素的混合溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美國Corning 公司，批號分別為33920003、26219003、22420008），殼聚糖（生工生物工程上海股份有限公司，批號G925BA0023），PageRuler預染蛋白ladder（美國Thermo Scientific，批號00792185），青霉素-鏈霉素、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（上海碧云天生物技術有限公司，貨號分別為C0222、A0216、P0013B、P1005、P1045-2），超敏ECL化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號120319201009），小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號241171031026），β-甘油磷酸二鈉（美國Merck，批號BCCD6874），NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）一抗、周期蛋白D1（Cyclin D1）一抗、周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）一抗（英國Abcam，批號分別為GR3275776-6、GR275907-38、GR3233421-7、GR3302404-8），p-NF-κB p65（Ser536）一抗、p-IκBα（Ser32/Ser36）一抗（美國Affinity Biosciences，貨號AF2006、AF2002），IκB激酶α一抗（IKKα，上海碧云天生物技術有限公司，批號121918211028），β-actin單抗（美國Affinity Biosciences公司，批號85r7978）。Alpha 1-2 LD plus 冷凍干燥機（德國CHRIST），CP2250 分析天平（德國Sartorus 公司），MH-1 搖床（海門其林貝爾儀器），Model 310 CO培養箱、1300 SERIES A2 生物安全柜、HPS RT2 加熱磁力攪拌器（美國Thermo Scientific公司），ELX-800全自動酶標儀（美國Bio-Tek公司），XDS-1B倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠），PowerPacBasic 電泳儀及配套電泳槽、170-3930 小型濕轉槽（美國Bio-Rad 公司），FluorChem E 凝膠成像與分析系統（美國Protein-Simple公司），Tissuelyser-64L多樣品組織研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）。

1.4 造模、分組及給藥

裸鼠適應性飼養3 d后，每只右腋皮下接種0.2 mL SMMC7721細胞懸液（1.5×10個/mL）。7 d后待腫瘤長出，隨機將裸鼠分為模型對照組、預知子提取物組（0.30 g/kg）、雷公藤紅素組（1.67×10g/kg）和聯合組（以上劑量聯合），分別為7、7、8、8只，分別于分組后第1、6、11日經皮瘤內注射相應藥物，每次100 μL，共3次。

1.5 指標檢測

1.5.1 一般情況

每2日觀察裸鼠飲食、活動及生長狀況，稱量裸鼠體質量，計算瘤體積（0.5×a×b，a為長徑，b為寬徑）。第16日脫頸處死動物，取瘤組織后稱定質量，計算瘤指數和抑瘤率，瘤指數＝瘤質量÷去瘤體質量，抑瘤率（%）＝（模型對照組平均瘤質量－給藥組平均瘤質量）÷模型對照組平均瘤質量×100%。取肝、脾、左腎并稱重，計算臟器指數，臟器指數＝臟器質量÷去瘤體質量。

1.5.2 ELISA檢測

第16日處死動物前，摘眼球取血，4 ℃靜置2 h，2 000 r/min離心20 min，取血清，按ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清TNF-α含量。

1.5.3 HE染色

將瘤組織置于10%福爾馬林溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，60 ℃浸蠟2 h，切片機切片（厚度約5 μm），37 ℃恒溫箱中烘干過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水洗后，蘇木素染色5 min，蒸餾水浸洗，伊紅染色1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，正置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.4 Western blot檢測

取瘤組織，加入RIPA裂解液（含磷酸酶和蛋白酶抑制劑）裂解，采用磁珠粉碎后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液測定蛋白濃度；蛋白上樣量約30 μg，電泳，蛋白轉移至0.45 μm PVDF膜，5%BSA室溫封閉2 h，加入IKKα一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶2 000）、p-NF-κB p65 一抗（1∶1 000）、IκBα 一抗（1∶2 000）、p-IκBα 一抗（1∶1 000）、Cyclin D1一抗（1∶20 000）、CDK2一抗（1∶5 000）、β-actin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，滴加二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，ECL顯色曝光，用FluorChem E凝膠成像與分析系統獲得條帶，Image J軟件計算條帶灰度值，以β-actin為內參，計算蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 預知子聯合雷公藤紅素對荷瘤裸鼠一般狀況的影響

實驗過程中，模型對照組死亡2只、雷公藤紅素組死亡1只，其余2組未出現動物死亡。

各組裸鼠初始（第1日）體質量及瘤體積差異無統計學意義（＞0.05）；實驗第16日，與模型對照組比較，雷公藤紅素組裸鼠體質量、去瘤體質量、瘤質量、瘤指數、瘤體積顯著減少（＜0.05），聯合組裸鼠瘤質量、瘤體積顯著減少（＜0.05）。預知子提取物組、雷公藤紅素組、聯合組抑瘤率分別為6.68%、35.08%、22.00%。見表1。

表1 各組裸鼠一般狀況比較（）

與模型對照組比較，預知子提取物組、雷公藤紅素組、聯合組裸鼠肝質量、肝指數、左腎質量顯著降低（＜0.05），預知子提取物組和雷公藤紅素組裸鼠左腎指數顯著降低（＜0.05）。見表2。

表2 各組裸鼠臟器質量和指數比較（）

2.2 預知子聯合雷公藤紅素對荷瘤裸鼠血清腫瘤壞死因子-α含量的影響

與模型對照組比較，各給藥組裸鼠血清TNF-α含量顯著增加（＜0.05），各給藥組間差異無統計學意義（＞0.05）。見表3。

表3 各組裸鼠血清TNF-α含量比較（，pg/mL）

2.3 預知子聯合雷公藤紅素對荷瘤裸鼠瘤組織形態的影響

模型對照組裸鼠腫瘤細胞大小不一，部分區域出現壞死、細胞核消失、炎性細胞浸潤，可見少量巨噬細胞；預知子提取物組裸鼠瘤組織核深染細胞和炎性細胞較少，但有間質增多現象；雷公藤紅素組裸鼠瘤組織也出現間質增多、核深染及炎性細胞減少現象，同時部分區域細胞排列疏松，細胞核變小甚至消失；聯合組裸鼠腫瘤細胞大小不一、排列相對無序，間質增多依然存在，壞死區域出現明顯炎性細胞浸潤堆積。見圖1。

圖1 各組裸鼠瘤組織形態（HE染色，×200）

2.4 預知子聯合雷公藤紅素對荷瘤裸鼠核因子-κB通路相關蛋白表達的影響

2.4.1 對上游IKKα 和下游CDK2、Cyclin D1 蛋白表達的影響

與模型對照組比較，雷公藤紅素組裸鼠瘤組織IKKα、CDK2、Cyclin D1 蛋白表達顯著降低（＜0.05），且與預知子提取物組和聯合組比較差異有統計學意義（＜0.05）。見圖2。

圖2 各組裸鼠瘤組織IKKα、CDK2、Cylin D1蛋白表達比較（，每組3～6只）

2.4.2 對IκBα、NF-κB p65蛋白表達的影響

與模型對照組比較，聯合組裸鼠瘤組織IκBα、p-IκBα蛋白表達顯著降低（＜0.05），雷公藤紅素組裸鼠瘤組織NF-κB p65蛋白表達顯著降低（＜0.05），各給藥組瘤組織p-NF-κB p65蛋白表達有下降趨勢，但差異無統計學意義（＞0.05）。見圖3。

圖3 各組裸鼠瘤組織IκBα、NF-κB p65蛋白表達比較（，每組3～6只）

3 討論

對于惡性腫瘤、慢性病等難治性疾病，因單藥治療在耐藥性及不良反應等方面存在局限性，單一靶點、單一藥物的常規治療策略已經逐漸轉向多成分、多靶點的聯合療法，且具有減量、增效、減毒等優勢。雖然聯合用藥理念成為共識，但傳統全身給藥方式療效不佳，局部或靶向治療可能成為未來腫瘤治療的新方向。局部或靶向治療需要媒介，可注射溫敏性載藥系統，如殼聚糖/甘油磷酸鈉載藥系統。該系統能在低溫下保持液態、體溫下形成凝膠，且具有良好的生物相容性、降解性、可控緩釋等特點，許多研究者嘗試將該系統用于實驗動物腫瘤局部給藥，以形成局部給藥儲存和緩釋系統，達到較好的抑制腫瘤細胞增殖效果。本實驗根據前期體外實驗結果，借助可注射溫敏性殼聚糖/甘油磷酸鈉載藥系統，將預知子提取物和雷公藤紅素共載，觀察局部聯合給藥對腫瘤生長的抑制作用，并分析可能的作用機制。

本研究結果顯示，給藥干預總體呈積極效應。從動物生存情況分析，模型對照組死亡2只，推測與腫瘤不斷生長、動物負荷增加、局部壓迫和應激有關；雷公藤紅素組死亡1只，而預知子提取物組和聯合組均未出現動物死亡。從抑制腫瘤生長上分析，3個給藥組按抑瘤率由高到低排序依次為雷公藤紅素組、聯合組、預知子提取物組，即抑瘤率以雷公藤紅素最高，但同時在3個給藥組中，雷公藤紅素組裸鼠生存情況較差，肝、腎質量和指數及去瘤體質量等均較低，而聯合組在一定程度上能糾正以上變化。此外，研究還發現，各給藥組裸鼠血清TNF-α含量增加，但各給藥組間無顯著差異，還需綜合其他血清學指標如白細胞介素-6、白細胞介素-1β等輔助判斷。同時，瘤組織HE染色結果提示，經預知子提取物或雷公藤紅素作用后，局部細胞形態學發生改變，且聯用后炎癥、壞死程度加重。

有研究表明，可通過影響NF-κB通路活性，如抑制IκBα蛋白磷酸化，從而影響肝癌預后。在其他腫瘤研究方面，NF-κB抑制劑雷公藤紅素與組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA 聯用可抑制SAHA 單藥引起的NF-κB激活，既有協同抗肺癌活性又未增加毒性。還有研究將多烯紫杉醇與雷公藤紅素共載，用于治療乳腺癌荷瘤小鼠，發現多烯紫杉醇對NF-κB p65等蛋白表達影響不大，而雷公藤紅素對該通路有較好抑制作用，最終發揮協同抗腫瘤作用。本研究中，單用雷公藤紅素能抑制NF-κB通路，包括NF-κB p65、上游IKKα以及下游CDK2、Cyclin D1分子；單用預知子提取物對該通路影響不大，但與雷公藤紅素聯合后又能一定程度逆轉雷公藤紅素引起的相應變化。這些分子水平的變化，與各組去瘤體質量、抑瘤率等指標變化趨勢基本一致。此外，預知子提取物組和雷公藤紅素組p-IκBα水平總體呈下降趨勢，且在聯合組呈現顯著下調趨勢。因此，推測p-IκBα可能是二者聯合發揮作用的重要靶點之一。

現有給藥方式和劑量條件下，就抑制腫瘤增殖效果而言，預知子提取物作用并不十分顯著，雷公藤紅素最為突出，聯合組居中。此結果與體外實驗聯合組抑瘤效應最強不完全一致?？赡芘c本研究采用的殼聚糖/甘油磷酸鈉載藥系統有關。該載藥系統對于預知子提取物凍干粉載藥有限，而對于雷公藤紅素卻有較大的容許空間，一定程度上限制了預知子藥效發揮，也影響了預知子和雷公藤紅素的劑量比例，而劑量比例直接影響能否發揮最大聯合作用。鑒于目前文獻所載藥物多為中藥單體，如紫杉醇、去甲斑蝥素、姜黃素等。因此，今后可以將預知子提取物進行進一步萃取、提純，明確其發揮藥效的物質基礎；另一方面，可以考慮優化載藥體系，如采用脂質體、納米顆粒等微載體系統，優化二者抑制肝癌細胞增殖的聯合作用，拓展肝癌協同用藥研究空間。