基于網絡藥理學和實驗驗證探討薏苡附子敗醬散治療潰瘍性結腸炎作用機制

陳麗萍，季蓉，繆志偉

張家港市中醫醫院，江蘇 張家港215600

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）以反復發作的腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便為主要臨床表現。近年來，全球UC發病率逐漸升高，東亞地區平均年發病率約1.14/10萬人。UC發病原因及機制復雜，可能與感染、遺傳、吸煙、飲食、藥物等因素有關。目前西醫治療UC采用氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑、微生態制劑及生物制劑等，效果確切，但長期使用不良反應大、易形成藥物依賴、價格高昂，限制其臨床應用。

UC可歸屬中醫學“痢疾”“腸癰”范疇，病機為脾虛濕盛，寒熱互結，脾虛、濕盛兩者相互影響，互為因果，濕郁日久可蘊毒化熱，壅滯腸腑，與氣血搏結，血敗肉腐成膿。該病病機復雜，為本虛標實、寒熱錯雜之證，治療頗為棘手。薏苡附子敗醬散出自《金匱要略》，由薏苡仁、附子、敗醬草組成，功效溫陽健脾、清熱祛濕。研究顯示，薏苡附子敗醬散聯合西藥治療UC效果優于單純西藥。薏苡附子敗醬散能通過修復腸黏膜、抗氧化應激治療UC。目前對于該方治療UC的具體機制研究較少，藥效作用物質基礎闡釋尚不全面。網絡藥理學通過構建藥物-疾病-靶點網絡，綜合分析藥物成分及作用機制，既能宏觀分析藥物的作用，又可獨立呈現某種特定疾病相關的靶點及通路，其系統性和整體性的研究思路與中醫藥整體觀及辨證論治的原則高度吻合。本研究利用網絡藥理學研究方法，探究薏苡附子敗醬散治療UC的作用機制，并通過實驗進行初步驗證，為進一步揭示該方的藥理作用和藥效物質提供依據。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分及靶點預測

利用TCMSP 數據庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以“薏苡仁”“附子”“敗醬草”為關鍵詞進行檢索，對口服生物利用度（OB）＞30%和類藥性（DL）＞0.18的化學成分進行篩選，并獲得相關靶點。通過中醫藥整合藥理學研究平臺（TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Index/index.html）檢索“薏苡仁”“附子”的化學成分，將其成分結構式導入SwissADME平臺（http://www.swissadme.ch/），篩選胃腸道吸收值（GA）為“High”及DL包含至少2個“YES”的活性成分，將篩選得到的有效成分通過TCMIP 及SwissTargrtPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）獲取相關靶基因（probability＞0），剔除重復項，得到薏苡附子敗醬散活性成分對應的靶基因，利用UniProt數據庫（https://sparql.uniprot.org/）規范靶基因命名。

1.2 疾病相關靶點及共同靶點獲取

通過GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM（https://omim.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）數據庫，以“Ulcerative Colitis”為檢索詞進行檢索，獲得UC相關靶基因并刪除重復項，將其與薏苡附子敗醬散有效成分對應的靶點基因映射，共同基因即薏苡附子敗醬散治療UC的靶基因。

1.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建

將藥物活性成分及藥物與疾病共同基因數據導入Cytoscape3.7.2軟件，構建藥物-成分-靶點-疾病網絡圖。

1.4 蛋白相互作用網絡構建

在STRING數據庫（https://string-db.org/）中選擇“multiple proteins”（多蛋白），導入藥物與疾病共同靶基因名，物種（species）選擇“Homo sapiens”（人類）進行檢索，得到蛋白相互作用（PPI）網絡，設置最低互作分數為“high confidence（0.7）”，導出TSV 文件，使用R語言計算核心靶點交互次數并進行排序，制作柱形圖。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

使用OmicShare（基迪奧）在線平臺（https://www.omicshare.com/）對薏苡附子敗醬散治療UC核心靶點進行GO功能富集分析，得到二級分類柱狀圖，使用R語言進行KEGG通路富集分析，根據調整后的值進行排序，選擇前20項分別制作柱形圖。

1.6 實驗驗證

1.6.1 動物、試藥與儀器

C57BL/6小鼠，SPF級，雄性，40只，體質量18～20 g，購自蘇州新藥研究中心有限公司，動物生產許可證號SYXK（蘇）2017-0001。飼養于溫度（24±1）℃、濕度40%～60%環境，自然晝夜節律，自由攝食飲水。動物實驗由張家港市中醫醫院醫學倫理委員會審核通過（AF-SOP-38-1.0）。

薏苡仁、黑順片、敗醬草，購自北京同仁堂藥店。將薏苡仁30 g、黑順片6 g、敗醬草15 g浸泡30 min，以10倍量水將黑順片先煎30 min，加入其他藥物，再煎30 min，紗布過濾，取濾液，再加8倍量水將所有藥物煎煮30 min后過濾。2次濾液合并，凝縮成1.05 g/mL的藥液，置于4 ℃冰箱保存備用。柳氮磺吡啶腸溶片（批號09180811），上海信誼天平藥業有限公司。將柳氮磺吡啶腸溶片研磨成粉末狀，溶解于含0.5%CMC-Na的蒸餾水中，即得終濃度為10 mg/mL的藥液。葡聚糖硫酸鈉（MW 36 000～5 000，批號S0221，MP 公司），表皮生長因子受體（EGFR）一抗（批號ab52894，Abcam公司），p-AKT一抗（批號4060S，CST公司），AKT一抗（批號4691S，CST公司），GAPDH一抗（批號ab9485，Abcam公司），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）一抗（批號9662S，CST 公司），Alexa Fluor488偶聯二抗（批號ab150077，Abcam公司），山羊抗兔IgG H&L（批號ab205718，Abcam公司）。

CUT 4062 石蠟切片機（德國SLEE 公司），URFL-T熒光顯微鏡（日本Olympus公司），LAS 500凝膠成像分析系統（GE Healthcare Bio-Sciences公司），PO Box 998 酶標儀（BioTek 公司），Fresco21 高速冷凍離心機（ThermoFisher Scientific 公司），Mini PROTEANTetra Cell蛋白電泳儀（Bio-Rad公司）。

1.6.2 分組、造模、給藥及取材

將小鼠隨機分為正常組、模型組、柳氮磺吡啶組、薏苡附子敗醬散組，每組10只。適應性喂養3 d后，模型組、柳氮磺吡啶組、薏苡附子敗醬散組予2.5%葡聚糖硫酸鈉自由飲用，7 d后替換為蒸餾水，正常組予蒸餾水自由飲用。根據藥物等效劑量換算，柳氮磺吡啶組每日予100 mg/kg柳氮磺吡啶腸溶片藥液灌胃，薏苡附子敗醬散組每日予10.5 g/kg薏苡附子敗醬散藥液灌胃，正常組與模型組每日予蒸餾水灌胃，灌胃體積均為0.2 mL，連續10 d。給藥結束后頸椎脫臼處死小鼠，剖取結腸，用PBS沖洗干凈，取遠端結腸組織。

1.6.3 結腸HE染色及病理評分

取結腸組織，多聚甲醛固定，石蠟切片后行HE染色，光鏡下觀察腸黏膜形態、腺體結構及炎細胞浸潤情況等病理變化。參照Dieleman標準對結腸組織進行病理評分，組織學損傷程度用炎癥、病變深度、隱窩破壞評分與病變范圍評分之和表示。

1.6.4 免疫熒光染色

取結腸組織石蠟切片，在100 ℃檸檬酸鈉中浸泡20 min，PBS洗玻片，5 min×3次，置于0.2%Triton穿孔2 min，放入5%牛血清中封閉1 h，加入Caspase3一抗（1∶1 000），4 ℃過夜，PBS洗玻片，5 min×3次，于黑暗中敷相應的熒光二抗（1∶500）50 min，PBS洗5 min×3次，加DAPI封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.6.5 蛋白印跡法

取30 mg結腸組織，加入適量裂解液、蛋白酶抑制劑和去磷酸化酶抑制劑，于研磨機中研碎后，4 ℃、12 000×離心10 min 后取上清，定量后加入loading buffer，100 ℃加熱5 min，8%SDS-PAGE，400 mA恒流轉膜1 h，封閉液中封閉1 h，分別加入EGFR一抗（1∶5 000）、p-AKT一抗（1∶1 000）、AKT一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶2 500），4 ℃過夜，TBST洗8 min×3次，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗8 min×3次，ECL顯影，計算EGFR、p-AKT、AKT表達量。

1.6.6 統計學方法

2 結果

2.1 薏苡附子敗醬散活性成分和潛在靶點

基于TCMSP、TCMIP數據庫及SwissADME平臺檢索并篩選出薏苡附子敗醬散活性成分66種，其中薏苡仁成分10種、附子成分43種、敗醬草成分13種。通過TCMSP、TCMIP、SwissTargrtPrediction 數據庫進行靶點預測，使用UniProt數據庫規范命名并排除重復靶點，共獲得193個靶點。

2.2 潰瘍性結腸炎相關基因

使用GeneCards、OMIM、DrugBank數據庫檢索獲得UC相關基因4 215個，將其與薏苡附子敗醬散活性成分對應的靶基因進行比對，得到100個共同靶點。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡

將藥物活性成分和共同靶點導入Cytoscape3.7.2軟件，藥物-成分-靶點-疾病網絡見圖1。該網絡包括100個靶點及薏苡附子敗醬散與這些基因相關的32個有效成分，見表1。

表1 薏苡附子敗醬散有效成分

圖1 薏苡附子敗醬散治療UC藥物-成分-靶點-疾病網絡

2.4 共同靶點相互作用網絡

將藥物與疾病的共同靶點100個導入STRING數據庫進行分析和可視化處理，得到薏苡附子敗醬散治療UC靶點PPI網絡，結果見圖2。使用R語言計算靶點的交互次數，選取排名前30位的靶點作為薏苡附子敗醬散治療UC的核心靶點，制作條形圖，結果見圖3。可以看出，核心靶點包括JUN、MYC、ESR1、CCND1、EGFR、RELA（NF-κB）、CASP3、HIF1A、IL-6、HDAC1等。

圖2 薏苡附子敗醬散治療UC靶點PPI網絡

圖3 薏苡附子敗醬散治療UC核心靶點

2.5 GO和KEGG通路富集分析結果

對薏苡附子敗醬散治療UC核心靶點進行GO功能富集分析，得到二級分類柱狀圖，見圖4。生物過程（Biological Process）主要富集條目為細胞進程、代謝過程、生物調節、刺激反應等，分子功能（Molecular Function）主要富集條目為連接、催化活性、分子功能調控等，細胞組分（Cellular Component）主要富集條目為細胞、細胞組分、細胞器等。使用R 軟件進行KEGG通路富集分析，根據調整后的值進行排序，排名前20位的通路見圖5。薏苡附子敗醬散治療UC的藥理作用可能涉及肝炎、病毒感染、癌癥、AGE-RAGE、細胞凋亡、TNF、p53、PI3K/Akt等信號通路。

圖4 薏苡附子敗醬散治療UC核心靶點GO富集分析

圖5 薏苡附子敗醬散治療UC核心靶點KEGG富集分析

2.6 靶點驗證

2.6.1 薏苡附子敗醬散對模型小鼠結腸組織病理形態的影響

模型組結腸黏膜不完整，大部分腺體被破壞，結構紊亂，大量炎性細胞浸潤，可見黏膜下水腫及多灶性潰瘍形成。柳氮磺吡啶組有部分腺體被破壞，黏膜結構尚完整，炎性細胞浸潤情況較模型組改善。薏苡附子敗醬散組黏膜結構接近正常，腺體破壞較少，炎性細胞浸潤情況顯著改善。組織病理評分模型組明顯高于正常組（＜0.01），柳氮磺吡啶組和薏苡附子敗醬散組均低于模型組（＜0.01），見圖6。

圖6 各組小鼠結腸組織病理形態（HE染色，×100）及病理評分（，每組10只）

2.6.2 薏苡附子敗醬散對模型小鼠結腸組織EGFR、p-AKT表達的影響

Western blot 實驗結果顯示，模型組結腸組織EGFR、p-AKT 的表達水平較正常組顯著升高（＜0.01），柳氮磺吡啶組和薏苡附子敗醬散組較模型組顯著降低（＜0.01），見圖7、表2。

圖7 各組小鼠結腸組織p-AKT及EGFR表達免疫印跡

表2 各組小鼠結腸組織p-AKT及EGFR表達比較（）

2.6.3 薏苡附子敗醬散對模型小鼠結腸組織Caspase3表達的影響

免疫熒光染色結果顯示，模型組小鼠結腸組織Caspase3的熒光強度較正常組明顯增強，經柳氮磺吡啶及薏苡附子敗醬散治療后，Caspase3的熒光強度均有不同程度減弱，見圖8。

圖8 各組小鼠結腸組織Caspase3表達（免疫熒光染色，×100）

3 討論

薏苡附子敗醬散出自《金匱要略·瘡癰腸癰浸淫病脈證并治》“腸癰之為病，其身甲錯，腹皮急，按之濡，如腫狀，腹無積聚，身無熱，脈數，此為腸內有癰膿，薏苡附子敗醬散主之”。其組方精煉，具有溫陽健脾、清熱祛濕功效，臨床常用于UC的治療。現代藥理學研究表明，薏苡附子敗醬散具有良好的調節免疫、鎮痛消炎、抗氧化、抗腫瘤的療效。另有研究發現，薏苡附子敗醬散能夠通過上調核因子E2 相關因子2（Nrf2）及其下游抗氧化蛋白血紅素氧合酶1（HO-1）表達、增加Nrf2 mRNA表達從而達到治療UC目的。以上研究在一定程度上揭示了薏苡附子敗醬散治療UC的相關機制。本研究基于多成分、多靶點作用的研究思路，應用網絡藥理學方法對薏苡附子敗醬散的有效成分進行篩選，預測其治療UC的關鍵靶點和信號通路，并采用動物實驗對關鍵靶點及相關通路進行驗證，為薏苡附子敗醬散治療UC的機制研究奠定相關基礎。

本研究篩選出薏苡附子敗醬散治療UC活性成分32個，其中對應靶點較多的活性成分有槲皮黃素、木犀草素、山柰酚、薏苡素、刺槐素、β-谷甾醇等，其中大多數均具有良好的口服生物利用度及類藥性。有研究表明，敗醬草含有多種黃酮類化合物，經水解后其苷元主要是槲皮素與山柰酚，由于產地、批次的差異，槲皮素與山柰酚的含量分別在0.061～1.046 mg/g 與0.045～0.701 mg/g。張珊珊等通過構建體內外腹瀉模型發現敗醬草中提取的總黃酮可以抑制腸蠕動，具有潛在的抗腹瀉活性。槲皮素能通過AhR調控的炎癥機制修復腸炎小鼠缺失的上皮結構，緩解腸炎小鼠癥狀。薏苡素最早從薏苡根提取，黃克俊等用浸泡超聲法進行前處理，采用高效液相法測定薏苡素在薏苡仁中的含量為0.8 mg/100 g。薏苡素具有抗炎特性，能抑制NF-κB、MAPK信號通路及NLRP3炎性小體，下調IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 等炎性因子表達。β-谷甾醇存在于敗醬草中，彭金詠等從6 kg白花敗醬草粗粉中提取到β-谷甾醇50 mg。有研究表明，β-谷甾醇能抑制腫瘤細胞的增殖與分化，誘導腫瘤細胞的凋亡。同時，其具有良好的抗炎活性，能有效改善葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠腸炎，降低結腸組織中炎癥因子如IL-1β、IL-6、MCP-1 及COX-2 的mRNA表達。因此，推測槲皮素、山柰酚、薏苡素、β-谷甾醇可能為薏苡附子敗醬散治療UC的關鍵成分。

藥物活性成分相關靶基因與UC相關靶基因取交集得到100個共同靶點，即薏苡附子敗醬散治療UC的靶點。基于STRING數據庫構建薏苡附子敗醬散治療UC靶點PPI 網絡，篩選出的核心基因有JUN、MYC、ESR1、CCND1、EGFR、RELA（NF-κB）、CASP3、HIF1A、IL-6、HDAC1 等。JUN、MYC、ESR1、CCND1與腫瘤的形成密切相關，共同參與細胞的增殖、分化、凋亡、惡性轉變等過程。EGFR能誘導細胞增殖，可通過作用于下游的炎癥通路而誘發炎癥反應，同時參與腫瘤的侵襲與轉移。以上基因的富集在一定程度上闡釋了UC易于癌變的特性。NF-κB參與UC促炎因子的表達，UC患者及腸炎模型的結腸組織均可見NF-κB活化。Caspase3是引起細胞凋亡的關鍵酶，異常的細胞凋亡參與UC潰瘍形成，有研究顯示Caspase3在UC小鼠表達較正常組多。IL-6在急性炎癥反應中占據中心地位，其在腸炎小鼠中呈現高表達，并且IL-6血清水平對UC的緩解及復發具有預測作用。由此，可以推測薏苡附子敗醬散對UC的治療作用與其多靶點協同合作有關，具體體現在薏苡附子敗醬散能調控細胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應等。

對核心基因進行GO功能富集分析，結果顯示，生物過程主要富集條目為細胞進程、代謝過程、生物調節、刺激反應等，分子功能主要富集條目為連接、催化活性、分子功能調控等，細胞組分主要富集條目為細胞、細胞組分、細胞器等。核心基因GO功能富集分析結果的多樣性表明薏苡附子敗醬散能通過多種生理過程干預UC的發生發展，體現了中藥復方多成分、多靶點協同增效的優勢。KEGG通路富集分析發現薏苡附子敗醬散治療UC的通路主要涉及肝炎、病毒感染、癌癥、AGE-RAGE、細胞凋亡、TNF、p53、PI3K/Akt等多條信號通路。TNF-α參與UC的發生發展，根據UC內科處理國際指南（2015年多倫多共識），抗TNF單抗被推薦用于UC的治療，目前已獲得很好的療效。PI3K/Akt是參與細胞增殖、分化及凋亡的經典通路，已有研究證實該通路與UC的發病機制密切相關，PI3K/Akt通路抑制劑能明顯緩解UC小鼠的疾病狀態及結腸鏡下表現。不斷復發的UC具有癌變傾向，薏苡附子敗醬散中多種有效成分均與抗腫瘤效應相關，而KEGG結果顯示薏苡附子敗醬散治療UC還涉及多條癌癥通路，我們可以推測薏苡附子敗醬散能在一定程度上防止UC進一步發展成為腸癌。

動物實驗結果顯示，薏苡附子敗醬散對UC小鼠的結腸病理具有改善作用，而且能降低p-AKT、Caspase3、EGFR在腸炎小鼠結腸表達，這與既往研究本方中敗醬草能抑制AKT有關通路一致。EGFR是PI3K/Akt的上游基因，調控著細胞增殖，同時能作用于下游基因參與炎癥反應，而Caspase3與細胞凋亡有關，EGFR、p-AKT及Caspase3表達增加提示UC小鼠結腸上皮細胞的凋亡及增殖指數均高于正常小鼠。這可能是由于在炎癥活動區域，黏膜上皮細胞凋亡速率明顯增加，為保持結腸黏膜正常功能，上皮細胞則會呈現代償性過度增殖。因此，我們推測薏苡附子敗醬散能通過作用于EGFR/PI3K/Akt通路及Caspase3調控細胞增殖及凋亡的平衡達到治療UC的目的。薏苡附子敗醬散成分復雜，其對UC治療作用的機制有待于進一步實驗驗證。

綜上，本研究通過網絡藥理學研究方法，從分子水平闡述了薏苡附子敗醬散治療UC的相關機制，為該方的治療效果提供理論支持，同時在動物水平上驗證了部分網絡藥理學結果，可為后續深入研究提供線索。