荒漠草原不同放牧強度下土壤酶化學計量特征的研究

李雅男, 李邵宇, 史世斌, 王占海, 張 彬, 陳 恒, 趙萌莉*

(1. 內蒙古農業大學草原與資源環境學院/ 草地資源教育部重點實驗室, 內蒙古 呼和浩特 010019； 2. 內蒙古自治區水利科學 研究院， 內蒙古 呼和浩特 010051； 3.呼倫貝爾市農牧技術推廣中心， 內蒙古 呼倫貝爾 021008； 4．內蒙古赤峰市克什克騰旗 農牧局， 內蒙古 赤峰 025350)

土壤酶是土壤生物生命活動的產物，作為微生物養分需求的指示器[1]，其活性可以反映土壤生物代謝和物質轉化等情況[2]。土壤酶種類繁多，根據存在位置，可將其分為游離酶、胞內酶和胞外酶[3]；根據其反應類型，可分為異構酶、水解酶、轉移酶、裂合酶、氧化還原酶和合成酶[4]。堿性磷酸酶(ALP)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β-葡萄糖苷酶(βG) 和α葡萄糖苷酶(αG)均屬于水解酶，且與土壤碳(C)、氮(N)、磷(P)等營養元素的循環密切相關[4]，通常用其活性來反映土壤微生物代謝速率和生物化學循環過程[5]。環境因子發生變化土壤酶活性也會隨之發生顯著變化，研究發現海拔高度增加會提高土壤酶活性[6]，土壤酶活性隨土壤有機質含量增加而增加[7]；草地利用方式和利用強度是影響土壤酶活性的重要因素，不同刈割強度下羊草草原的土壤酶活性變化規律不盡相同[8]，長期圍封會提高高寒草原土壤酶活性[9]，目前，不同放牧強度下，土壤養分轉化機理尚無定論，土壤酶活性的變化及其機制亟待探討。

土壤酶化學計量可表征微生物的養分缺乏情況[10]，全球尺度上，土壤酶化學計量比約為C:N:P=1:1:1，由于氣候環境海拔等因素，不同區域的酶化學計量比值會有所偏離，而偏離程度越大說明該地區受該元素限制越嚴重[11]。Moorhead等[12]通過計算土壤酶化學計量比，碳元素的相對限制量用向量長度表示，氮和磷相對限制量用向量角度表示，以將土壤酶活性與養分的需求比例量化。Sinsabaugh等[11]對全球24個生態系統，41個樣地的土壤酶化學計量比整合發現，土壤C:P與溫度變化呈顯著負相關，溫度升高會提高微生物活性和土壤酶活性，提高微生物的代謝速率，進而改變土壤酶化學計量比[13]；溫室氣體(尤其是CO2)的排放也會通過改變植物根系及根系分泌物，改變活性碳的地下分配格局，增強土壤微生物對C的利用能力，從而改變土壤酶化學計量比[14]；Castor等[15]研究降水對土壤酶化學計量比的影響發現，降水改變了細菌和真菌的相對豐度及群落組成，影響土壤微生物吸收養分的能力，因而改變土壤酶化學計量比。因此，在全球變化背景下研究土壤酶化學計量比，對明確土壤養分循環對其響應機制具有重要意義。

荒漠草原是重要的生態系統，因其植被稀疏、土壤貧瘠，對環境變化較為敏感，成為生態學領域的重要研究對象[16]。放牧是草地利用的重要途徑，主要通過家畜的啃食、踐踏、排泄行為影響土壤基質、緊實度、容重、含水量、pH和養分循環[17]，其中土壤物理性質對放牧的響應更加劇烈[18]。放牧通過改變土壤基質，對微生物群落產生影響，改變了細菌和真菌的多樣性，影響土壤養分循環，進而影響土壤酶活性[19]。目前，不同放牧強度條件下，荒漠草原土壤微生物的養分限制情況及機理尚無定論。本研究依托四子王旗短花針茅(Stipabreviflora)荒漠草原長期放牧平臺，分析不同放牧強度下土壤理化性質及其與土壤C、N、P循環密切循環的土壤酶之間的關系，擬回答以下問題：(1) 不同放牧強度下土壤理化性質、酶活性及酶化學計量比如何變化？(2)不同放牧強度下荒漠草原微生物養分限制情況及其驅動機制如何？本研究旨在探究荒漠草原土壤酶在不同放牧強度下的調控機制和適應策略，為荒漠草原合理利用及生態系統修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗地位于內蒙古自治區烏蘭察布市四子王王府一隊(41°46′52″N，111°53′44″E)，該地區海拔約1 450 m，屬溫帶大陸性季風氣候，冬季寒冷漫長，夏季炎熱期短，最低溫度出現在1月，最高溫度出現在7月，極端最高氣溫35.7℃。干旱少雨，年均降水量約為299 mm，且分布極不均勻。建群種為短花針茅(Stipabreviflora)，優勢種為無芒隱子草(Cleistogenessongorica)和冷蒿(Artemosiafrigida)，植被蓋度較低。土壤為淡栗鈣土，土層深約1 m，土體堅硬且透氣性較差，有機質含量低，較貧瘠[20]。

1.2 試驗設計

試驗區于2004年圍建，采用圍欄放牧的管理方式，長期放牧18年，每年6月開始放牧，10月結束。圍欄總面積50 hm2，分為3個大區組，各小區面積基本一致(樣地設計見圖1)。試驗采用隨機區組設計，每個區組內設置4個不同放牧強度：重度(Heavy grazing,HG)、中度(Moderate grazing,MG)、輕度放牧區(Light grazing,LG)和對照區(Contral,CK)，共計12個小區，每個小區內載畜率分別為2.71，1.82，0.91，0羊單位·hm-2·半年-1,各小區分別放牧12，8，4，0只羊(蒙古羯羊，體重約60 kg)，每天放牧12小時(6：00—18：00)。

圖1 實驗小區示意圖Fig.1 Diagrammatic illustration of the experimental block

1.3 樣品采集

2021年5月于內蒙古四子王旗荒漠草原長期放牧平臺進行，因土壤異質性較大[19]，故選取試驗區地勢平坦的區域，用網格法采集土壤樣品。每個小區設置3個10 m×10 m的大樣方，樣方內間隔2 m收集0～10 cm的表層土壤。樣地內12個小區取1 296鉆土，6鉆合1鉆，共計216份土壤樣品，每個處理54個重復。將土樣過2 mm篩，以剔除植物根系、動物糞便、石塊等雜質，充分混合后裝入自封袋，放入冰盒帶回點實驗室待測。測定土壤酶活性的土樣于—80℃冰箱保存，測定土壤理化性質的土樣風干保存。

1.4 測定項目與方法

表1 測定指標及測定方法[11]Table 1 Measurement indexes and measurement methods

1.5 數據處理與分析

文中將部分數據取對數轉化以符合正態分布，酶C∶N∶P通過ln (αG +βG)∶ln(NAG+LAP)∶ln(ALP)計算，公式如下[4]：

土壤C∶N酶活性比=ln(αG+βG)∶ln(NAG+LAP)

(1)

土壤C∶P酶活性比=ln(αG+βG)∶lnALP

(2)

土壤N∶P酶活性比=ln(NAG+LAP)∶lnALP

(3)

根據酶化學計量比假說[11]，采用公式(4)和(5)計算酶化學計量的向量長度(Vector L)和角度(Vector A)[21]

Vector L=SQRT(x2+y2)

(4)

Vector A=DEGREES[ATAN2(x,y)]

(5)

式中：x表示相對C和P獲得的酶活性，y表示C和N獲得的酶活性，Vector L的長短表示土壤微生物碳限制程度的高低，長度越長，碳的限制越強；Vector A的大小表示土壤微生物氮、磷的限制程度的高低，大于45°表明存在磷限制，小于45°表明存在氮限制，越偏離45°說明限制越嚴重。

采用單因素(One-Way ANOVE)方差分析比較不同放牧強度下，土壤理化性質、土壤微生物生物量、土壤養分及其化學計量比的變化規律。采用Pearson相關和逐步回歸分析檢驗土壤微生物C,N限制與土壤理化性質、養分及養分化學計量比的關系。使用SPSS (IBM SPSS 23)軟件進行ANOVA和Pearson相關分析，小提琴圖及相對重要性圖使用Origin 2019b (OrginLab 9.0)繪制，土壤C,N限制與其他因子之間的相關關系熱圖使用R(R Core Team 3.6.3) 繪制。

2 結果與分析

2.1 不同放牧強度土壤理化性質

土壤毛管持水量(CC)、土壤有機碳(SOC)含量、土壤全氮(STN)含量、土壤全磷(STP)含量、土壤可溶性有機碳(DOC)含量、土壤速效磷(SAP)含量、無機氮(Inorganic N)含量以及土壤微生物量(MBC、MBN、MBP)均隨放牧強度增加而降低(P<0.05)；土壤容重(SBD)、土壤pH、土壤C∶N、土壤C∶P隨放牧強度增加而增加(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同放牧強度土壤理化性質Fig.2 Physicochemical properties of soil with different grazing intensity注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同。CC：土壤毛管持水量，SBD：土壤容重，SOC：土壤有機談，STN：土壤全氮，STP：土壤全磷，DOC：土壤可溶性有機碳，SAP：土壤速效磷，MBC：土壤微生物量碳，MBN：土壤微生物量氮，MBP：土壤微生物量磷Note：Different letters indicate significant differences between treatments (P<0.05),the same as below. CC:soil capillary water holding capacity,SBD:soil bulk density,SOC:soil organic talk,STN:soil total nitrogen,STP:soil total phosphorus,DOC:soil soluble organic carbon,SAP:soil fast-acting phosphorus,MBC:soil microbial carbon,MBN:soil microbial nitrogen,MBP:soil microbial phosphorus

2.2 不同放牧強度土壤酶活性及其化學計量比

從圖3可以看出，與C，N，P相關的5種土壤酶活性均隨放牧強度增加而降低，土壤酶活性在CK均顯著高于其他放牧強度(P<0.05)。從圖4可以看出，土壤酶化學計量比隨放牧強度增加變化趨勢不一致，隨放牧強度增加，土壤C∶N酶化學計量呈上升趨勢，土壤C∶P酶化學計量比未發生顯著變化，土壤N∶P酶化學計量比呈下降趨勢(P<0.05)。

圖3 不同載畜率土壤酶活性Fig.3 Enzyme activitie of soils with different stocking rates

圖4 不同載畜率土壤酶化學計量比Fig.4 Enzyme stoichiometric ratios of soils with different stocking rates注：ln(αG+βG)/ln(NAG+LAP)：土壤C∶N酶化學計量比，ln(αG+βG)/ln(ALP)：C∶P酶化學計量比，ln(NAG+LAP)/ln(ALP)：N∶P酶化學計量比，下同Note：Soil C∶N enzyme stoichiometry ratio(ln(αG+βG)/ln(NAG+LAP)),C∶P enzyme stoichiometry ratio(ln(αG+βG)/ln(ALP)),N∶P enzyme stoichiometry ratio(ln(NAG+LAP)/ln(ALP)),the same as below

2.3 不同放牧強度土壤養分對微生物的限制

從圖5可以看出，所有酶樣點都在線下(1∶1線)，且不同放牧強度下向量長度(Vectoe Lengh)和向量角度(Vectoe Angle)均存在顯著差異(P<0.05)。隨放牧強度增加，Vectoe Lengh和Vectoe Angle均呈現出增加趨勢，且不同放牧強度Vectoe Angle值均小于45°，Vectoe Angle最大值出現在HG。根據酶化學計量比假說[11]，樣地內土壤微生物受到C限制和N限制。

圖5 不同放牧強度下基于酶活性比值的向量長度和角度Fig.5 Vector length and angle based on the ratio of enzyme activity at different stocking rates

2.4 土壤酶活性與環境因子的關系

從圖6可以看出，C限制(向量長度)與N限制(向量角度)呈正相關，SOC，MBC，Inorganic N，TN，MBN，MBP均與C限制呈負相關關系，N限制與土壤C∶N，BD和C限制呈正相關關系，與N∶P，CC，SOC，MBC，Inorganic N，DOC，TN，MBN，MBP，TP，SAP均呈負相關關系。

從圖7可以看出，土壤理化性質對C限制和N限制的貢獻率不同，MBN對C限制的貢獻率最大，其次為Inorganic N，MBP，MBC，SOC，pH，TN，N∶P，C∶N，BD，C∶P，CC，DOC，SOC和TP對C限制的貢獻率最小，而MBP對N限制的貢獻率最大，TN和MBN次之，C∶N，DOC，CC，Inorganic N，N∶P，MBC，TP，C∶P，SOC更小，pH和BD最小(圖7)。

圖6 土壤酶活性與理化性質的關系Fig.6 Relationship between soil enzyme activity and physicochemical properties注：藍色圓圈表示兩因子間呈負相關關系，紅色圓圈表示兩因子間呈正相關關系，數字表示相關性大小Note:Blue circles indicate negative correlation between the two factors,red circles indicate positive correlation between the two factors,and numbers indicate the magnitude of correlation

圖7 理化性質的相對重要性Fig.7 Relative importance of physical and chemical properties注：圖(a)為土壤理化性質對向量長度的相對重要性，圖(b)為土壤理化性質對向量角度的相對重要性Note：Figure (a) shows the relative importance of soil physical and chemical properties on vector length,andFigure (b) shows the relative importance of soil physical and chemical properties on vector angle

3 討論

3.1 放牧對土壤酶活性及其化學計量比的影響

土壤酶可反映土壤微生物代謝和物質轉化情況。放牧主要通過影響土壤理化性質、土壤養分、土壤養分化學計量比及土壤微生物生物量影響土壤酶活性。由于放牧家畜的踩踏行為，土壤容重增加(圖2)，減小了土壤孔隙度，土壤滲透率較小，導致土壤含水量降低(圖2)[22]，進而降低土壤微生物的代謝產酶能力[23]，導致土壤酶活性降低。Martens等[24]研究發現，土壤水解酶活性隨土壤容重增加顯著降低，隨含水量增加顯著提高(P<0.05)，與本研究結果一致。家畜通過采食行為改變了草地養分循環，致使土壤養分配比格局發生變化。本研究發現，隨放牧強度增強，土壤養分均呈現出不同程度的降低趨勢，這是由于放牧會顯著減少植物地上生物量、立枯草含量及凋落物的積累，影響養分歸還，隨著放牧強度的增加，養分向土壤的歸還越來越少，故養分含量降低[25]。一方面，養分含量降低導致土壤養分循環速率降低，抑制了土壤酶活性，另一方面，土壤中酶作用底物的擴散由于土壤養分減少受到抑制，因而微生物對養分需求提高，進而土壤酶活性降低[26]。

放牧對土壤C，N，P元素計量比產生了不同程度的影響(圖2)，這也可能是酶活性受限制的主要原因之一[27]，王強等[28]在研究施用生物炭對塿土土壤微生物代謝養分限制和碳利用效率的影響中也發現，土壤C，N，P與胞外酶活性和生態酶化學計量的變化存在緊密聯系。綜上，土壤養分含量直接決定了土壤養分化學計量比，間接限制微生物活性。土壤微生物生物量隨放牧強度增加均表現為不同程度的降低(圖2)，這可能是由于家畜過度采食導致植物生物量減少導致的[28]，家畜的踐踏導致的裸斑裸塊面積增加，風蝕作用變強，土壤有機質減少[29]，這也可能引起土壤微生物生物量降低。由于放牧改變了土壤理化性質及養分特征，土壤微生物代謝活性發生改變，進而改變土壤微生物群落結構及其對養分的利用效率[30-31]，繼而改變土壤酶活性。

3.2 不同放牧強度下微生物限制及響應機制

根據酶化學計量比假說[11]，向量夾角小于45度(圖5)，表明荒漠草原土壤微生物受到C，N限制，且隨著放牧強度的增加，C，N限制加重。土壤酶活性與土壤理化性質相關性表明(圖6)，驅動微生物C限制和N限制的環境因子并不相同。其中，對C限制貢獻率最大的環境因子是MBN(圖7)。基于酶資源分配理論，微生物根據其獲取養分的多少改變其生存策略，當養分充足時增加酶分泌，養分匱乏時減少酶分泌[32]，MBN的含量隨放牧強度增加顯著降低，與N相關的酶活性降低，系統將投入更多的養分平衡N素的缺失，導致與C相關酶可利用養分減少，造成微生物受C限制。此外，微生物受C限制的原因還可能是放牧動物的采食降低了群落地上、地下生產力，進而影響養分循環速率[33]，微生物活性降低。長期放牧減少凋落物的累積，其向土壤返還的養分減少[34]，影響土壤對植物根系的養分供給，土壤養分的有效性會隨根系對養分競爭的加劇而降低，阻礙微生物獲取養分[35]。此外，也可能由于根系沉積減少了C源，進而增加了微生物C限制[36]。

土壤中N含量及C∶N是造成土壤微生物受到N限制的兩個重要原因。養分與土壤酶活性具有趨同性[37]，土壤養分可以通過調節酶的分泌改變土壤酶活性，同時，土壤養分含量發生變化會改變土壤酶的生化特性，這也會使土壤酶活性發生變化[29]，土壤中N含量隨放牧強度增加顯著降低，不能為與N相關的酶提供充足的反應底物，故土壤酶活性降低，引起微生物受到N限制。土壤養分化學計量比可以表征土壤養分供給能力[33]，當C∶N較高時,表明土壤中N素相對充足,充足的N含量可以滿足微生物的生長和新陳代謝,而土壤C∶N較低時,用于微生物代謝的N素就會釋放到土壤中[38]。已有研究表明，土壤有機質分解速率隨土壤C∶N增加而降低[38]，土壤C∶N與放牧強度呈負相關關系，在重度放牧條件下，土壤有機質分解速率最低，土壤N素含量逐漸匱乏[39]。養分化學計量比變化導致土壤養分供應的不平衡，進而導致微生物的養分限制[34]。此外，放牧家畜的踐踏作用增加了土壤容重，降低了土壤含水量，限制了微生物活性[40]，這也可能是導致微生物受N限制的原因。

4 結論

隨載畜率增加，與C(αG,βG)、N(NAG,LAP)、P(ALP)相關的5種酶活性均降低，土壤C∶N酶化學計量增加(P<0.05)，土壤C∶P酶化學計量比未發生顯著變化，土壤N∶P酶化學計量比降低。荒漠草原受C，N限制，驅動C限制的主要因子為MBN，驅動N限制的主要因子為MBP，且放牧強度越強，養分限制越嚴重。放牧主要通過影響土壤理化性質及養分含量影響微生物化學計量，因此，適當加入C，N元素有助于退化荒漠草原的修復。