紫花苜蓿MsJMT基因的克隆及其與育性的關聯分析

徐小博， 王鑫堯， 郁偉杰， 苗一凡， 徐 博

(吉林農業大學林學與草學學院， 吉林 長春 130118)

茉莉酸類物質(Jasmonates，JAs)包括茉莉酸(Jasmonate，JA)及其甲基化衍生物茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)等[1]，均參與植物的生長發育促進株體循環代謝，但不同JAs在其功能及用途方面具有差異性。茉莉酸甲基轉移酶(Jasmonate methyl transferase，JMT)是促進JA轉化為MeJA反應的關鍵酶[2]，2001年始Seo等韓籍科學家開始關注JMT對JAs分泌的促進作用，并通過相關研究表明JMT的過表達能夠顯著提高馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)[3]、人參(PanaxginsengC. A. Meyer)[4]等高等植物中MeJA含量；Qi等在大花蕙蘭(CymbidiumhybridL.)花香物質合成通路中也發現相似結果[5]。JMT作為JA與MeJA的轉化酶近年來才漸被關注，且JMT基因已成功在甘蔗(SaccharumofficinarumL.)[6]、茶樹(CamelliasinensisL.)[7]和紫蘇(PerillafrutescensL.)[8]中表達。

迄今為止，關于JMT基因的研究多從調控植物果實大小、植株形態及抗逆性等方面考慮[6-7,9]，與植物育性相關的研究暫未發現，且紫花苜蓿不育機理網絡還未構建清晰，JAs在紫花苜蓿配子體發育過程中參與哪些過程還未明晰。實驗室前期研究表明[10]，MsJMT在BSR育性混池中差異表達，那么驗證該基因是否參與紫花苜蓿的不育機制則是本試驗的基礎思路。

因此，試驗通過克隆MsJMT基因全長并進行序列分析預測其功能，使用亞細胞定位、qPCR技術等明確其在細胞學層面和核酸層面的時空表達位置與表達量的變化，意在研究JA通路與MsJMT之間的關系和二者對紫花苜蓿(MedicagosativaL.)不育系的影響，為探究紫花苜蓿的不育機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選取的紫花苜蓿不育系MSJN-1A與保持系MSJN-1B植物材料由吉林農業大學提供，于2019年6月采集自吉林農業大學動物科學技術學院牧草育種實驗基地內。

1.2 試驗方法

1.2.1紫花苜?？俁NA及cDNA的獲取 使用Plant RNA Mini Kit(OMEGA)進行試驗[11]，以RNA為模板使用ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO)進行反轉錄得到cDNA，產物保存于-20℃保存。

1.2.2MsJMT基因的獲取 實驗室于2019年7月構建紫花苜蓿不育系BSA混池(規模：30+30+2)并委托百邁克生物科技有限公司完成了三代轉錄組測序工作，結果分析可知c115887.graph_c0基因片段預測功能為調控茉莉酸O-甲基轉移酶合成[10,12-13]。通過DNAMAN Version 9軟件進行序列拼接并于NCBI Blast同源比對后得到MsJMT基因預測全長序列。以紫花苜蓿cDNA為模板，設計引物MsJMT-25(表1)并擴增MsJMT基因全長[14]。后選用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR(TAKARA)連接至pMD20-T vector。使用M13引物進行PCR檢測，上樣電泳確認條帶，將陽性子送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。菌液以1∶1 000濃度振蕩培養并抽提質粒。命名為pMD20T-MsJMT。質粒提取使用Plasmid Mini Kit Ⅰ(OMEGA)[15]。

表1 引物列表Table 1 Primer list

1.2.3MsJMT基因序列分析 采用表2中分析工具對MsJMT基因序列進行分析

表2 基因序列分析工具Table 2 Gene sequence analysis tools

1.2.4亞細胞定位 以克隆載體為模板，5′端3′端分別添加BamHI，PstI酶切位點設計引物MsJMT-pHB(表1)，配制反應體系。PCR膠回收后37℃雙酶切30 min，確認酶切充分后將膠回收產物連接至亞細胞定位載體(pHB-YFP)進行大腸桿菌轉化。電泳后根據片段位置挑選陽性子送測，確認序列一致后擴大培養并抽提質粒。命名為Phb-YFP-MsJMT。將轉化入質粒pHB-YFP空載、pHB-YFP-MsJMT的農桿菌擴繁并重懸菌體，調菌液OD600到0.6～0.8室溫靜置1 h；選取6～8周大的本室煙草，將菌液注射進煙草葉片中黑暗培養過夜，后正常培養3天，進行激光共聚焦觀察熒光。

1.2.5qPCR 以縱長為參數，提取不育系、保持系Ⅰ～Ⅳ時期花苞總RNA(Ⅰ：≤0.2 cm；Ⅱ：0.2～0.4 cm；Ⅲ：0.4～0.6；Ⅳ：0.6～0.8 cm)，每時期3個重復，根莖葉同時進行取樣。定量后反轉錄；設計擴增片段為101 bp的MsJMT-qPCR引物(表1)，以紫花苜蓿Actin2為內參[16]，配置qPCR反應體系，每組均設復孔、空白孔，短暫離心后上機；所得結果采用2-△△CT法[17]計算基因相對表達量。

1.2.6茉莉酸含量測定 采用Plant Jasmonic acid(JA)ELISA Kit(上海酶聯生物)進行測定[18]。

1.2.7外源MeJA噴施方案 初花期紫花苜蓿不育系若干株，選取其中具有頂端開放1～5朵花花序的枝條，在離花序約15 cm處剪斷，插入瓶中帶回室內水培。MeJA+0.2%DMSO+0.1%TWEEN-20用蒸餾水稀釋至0.5 mmol·L-1,1 mmol·L-1,2 mmol·L-1。將以MeJA處理的實驗組命名為A(0.5 mmol·L-1)、B(1 mmol·L-1)和C(2 mmol·L-1),對照組命名為CK，CK組除不加MeJA外與其余試劑配比相同，每組兩枝，含花序8～10個，9∶00,16∶00各1次進行噴施處理，噴施程度以花托完全濕潤為基準，5 d后取Ⅲ時期花蕾進行切片觀察[19]。

1.2.8切片方法 采用HE染色法進行染色并切片[20]。

1.2.9數據處理 數據的分析和計算采用Excel 2016和SPSS 25.0軟件進行處理。

2.1 擴增目的基因全長

以cDNA為模板擴增MsJMT基因全長，高保真酶產物如圖1所示。MsJMT基因全長為1 047 bp，電泳圖條帶清晰，位置正確，可以純化后用于后續試驗。

圖1 MsJMT基因全長擴增電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of full-length MsJMT amplification注：M為D2000 DNA Marker,1～3為MsJMT全長片段Note:M is D2000 DNA Marker,1～3 are full-length fragments of MsJMT

2.2 MsJMT基因全長序列

測序結果經分析后得到MsJMT基因全長序列1 047 bp(圖2)。

圖2 MsJMT基因全長序列Fig.2 Full length sequence of MsJMT

2.3 理化性質分析

利用NCBI中的ORF Finder程序進行分析，如圖3A所示，MsJMT潛在的編碼框為10個，MsJMT完整開放閱讀框位于核苷酸序列的1到1 047 bp之間，全長為1 047 bp，共編碼348個氨基酸。使用ProtParam工具對MsJMT基因編碼蛋白的物理和化學參數進行計算，MsJMT蛋白包括348個氨基酸，其中含量最高的氨基酸是谷氨酸Glu(33個，9.5%)、亮氨酸Leu(32個，9.2%)、纈氨酸Val(26個，7.5%)，根據Guruprasad等[21]提供的權重值計算出MsJMT蛋白不穩定系數為41.63，為不穩定蛋白。采用Prabi在線軟件對蛋白二級結構進行預測，分析結果如圖3B所示。可知蛋白質的二級結構都由α-螺旋(Alpha helix)、延伸鏈(Extended strand)和無規則卷曲(Random coil)組成，MsJMT所占比例分別是37.93%，24.14%，37.93%。利用Expasy軟件的SMART程序預測MsJMT編碼的蛋白質結構保守結構域為圖3C，發現位于16～346之間含有一個Methyltransf_7結構域，表明該蛋白GO功能為甲基轉移酶活性。參考二級結構預測于Swiss-model服務器得出蛋白三級結構預測模型(圖3D)。

圖3 MsJMT基因ORF(A)、蛋白二級結構(B)、蛋白結構域(C)和蛋白三維結構(D)預測圖Fig.3 ORF finder(A),secondary protein structure(B),protein domain(C) and protein three-dimensional structural model(D) of MsJMT gene

2.4 亞細胞定位預測

運用TargetP 2.0服務器預測MsJMT編碼蛋白的亞細胞位置，返回的結果如圖4A所示。MsJMT基因編碼的蛋白Ctp值與Tltp值均為0，僅Mtp值為0.000 8，排除了在細胞外分泌的可能。預測該蛋白主要是存在于細胞質的非分泌型蛋白，主要在細胞內發揮生物學作用。運用Cell-PLoc 2.0服務器預測,結果表明該蛋白為核質分泌蛋白(圖4B)。

2.5 BLAST比對、同源性分析和系統進化樹構建

在NCBI數據庫的非冗余蛋白數據庫(Nr)中下載與MsJMT高度同源的6條蛋白序列進行同源比對。所選取的序列和相似度結果為：蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XP_003612068.1)相似度達100%;相思豆(Abrusprecatorius，XP_027362137.1)相似度100%;野大豆(Glycinesoja，XP_028197088.1)相似度100%;密花豆(Spatholobussuberectus，TKY55844.1)相似度100%;大豆(Glycinemax，NP_001237122.1)相似度100%;野大豆(Glycinesoja，RZC23540.1)相似度99%(圖4C)。利用Clustal Omega軟件分析MsJMT與其他物種同源蛋白的進化關系，構建系統進化樹，如圖4D。MsJMT與蒺藜苜蓿分子距離最近，其次與相思豆、野大豆、密花豆、大豆等植物的分子距離相對較近，證實MsJMT基因編碼蛋白序列與這6條蛋白序列具有極高的序列相似度。

圖4 TargetP 2.0(A),Cell-PLoc 2.0(B)服務器對MsJMT基因編碼蛋白亞細胞定位預測及其編碼氨基酸序列同源比對 (C)和系統發育樹分析圖(D)Fig.4 The subcellular localization prediction from TargetP 2.0(A) and Cell-PLoc 2.0(B) server,the homology comparison of coding amino acid sequence(C)and the phylogenetic tree(D)of MsJMT gene

2.6 亞細胞定位結果

如圖5所示，激光共聚焦顯微鏡下發光部位于細胞核和細胞質。說明MsJMT在煙草葉片細胞中的瞬時表達位于細胞核和細胞質，和亞細胞定位預測結果一致。

圖5 MsJMT亞細胞定位結果Fig.5 MsJMT subcellular localization

2.7 qPCR相對定量結果

將紫花苜蓿Actin2基因作為內參基因，保持系作為參照因子(Calibrator)，計算出2-△△CT值。經T檢驗分析后得到，對比保持系，不育系花苞的MsJMT表達量在4個時期均顯著上升(P<0.05)，且在Ⅲ時期表現為極顯著(P<0.05)；在植株根莖葉部分不育系與保持系表達量差異不顯著。

圖6 MsJMT在不育系各時期的相對表達量Fig.6 The relative expression of MsJMT in male sterile lines at different stages注：不同字母表示在不同處理下差異顯著(P<0.05)，“*”表示在不同處理下差異顯著(0.01≤P<0.05)，“* *”表示在不同處理下差異極顯著(0.001≤P<0.01)，下同Note:Different letters indicate significant difference under different treatments at the 0.05 level,“*” indicates significant difference under different treatments (0.01≤P<0.05),“* *” indicates a very significant difference under different treatments (0.001≤P<0.01), the same as below

2.8 不同發育時期花苞內茉莉酸含量變化

以標準物濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標建立標準曲線得到：y≈0.000 5x+0.112 6，且R2>0.95具有可參照性。

由標準曲線得到Ⅰ～Ⅳ時期不育系保持系的花苞JA含量，結果可得，不育系JA含量在全時期內無顯著波動且低于保持系，保持系的JA含量在Ⅱ,Ⅲ時期均顯著升高，且在Ⅲ時期時達到最高，為同時期不育系的1.54倍。

圖7 紫花苜蓿不育系保持系各時期花苞內JA含量Fig.7 The content of jasmonic acid in the flower buds of the sterile lines of alfalfa was maintained

2.9 外源MeJA噴施后不育系花藥形態特征

如圖8所示，處理后，CK組花藥無開裂現象；A組花藥雖開裂但其形態不自然，可見花藥壁回縮；B組花藥裂口較大，藥室形態飽滿，開裂完全;C組噴施后出現花苞掉落現象，觀察頂部Ⅰ時期花藥形態可見4藥室與藥隔均萎縮。

圖8 不同濃度MeJA溶液噴施不育系藥切片Fig.8 Sterile line Ⅲ period sections spray on different concentrations of MeJA solution注：CK,A,B組為Ⅲ時期，C組因噴施后具花苞脫落現象故取Ⅰ時期(×80)Note:Group CK,A and B were stage Ⅲ,and group C was stage Ⅰ because of the phenomenon of flower bud shedding after spraying(×80)

3 討論

由基因序列分析可知，MsJMT基因全長1 047 bp，具有Methyltransf＿7保守結構域。陳麗蘭等[6]認為包含此保守結構域的ScJMT基因屬于SABATH甲基轉移酶家族，且在進化樹分析下發現JMT基因在植物界基因序列差異性較大，尤其在單雙子葉間親緣關系較遠，但功能性相對保守，因此具有家族共性，適合于模式植物研究。由本試驗結果可知，不育系苜蓿在花苞Ⅲ時期MsJMT表達量最高，且在Ⅰ～Ⅳ時期內，不育系花苞的表達量均高于保持系，此結果與棉花(Gossypiumspp.)細胞質雄性不育系得到的結論相同[22]，可以推斷由MsJMT調控的JMT蛋白在花苞處作用，在特定時期通過調控JA與MeJA的轉化效率從而控制育性器官內的激素水平，達到影響植株育性的目的。JMT作用于亞麻酸通路下的茉莉酸內外源轉化，催化JA甲基化形成MeJA，因此JMT主要作用于細胞內部，與亞細胞定位結果相吻合。在水稻(OryzasativaL.)中，過表達JMT基因會降低穗長、種子質量和結實率[23-24]；相同情況在擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)中也有所表現[25]，這暗示了JMT或具有影響植物育性的功能，根據qPCR結果可得，MsJMT在不育系花苞相對表達量較高，與此推論契合。

對于MeJA來說，作為JMT催化的反應產物，其為一種外源植物間介導激素，可作為植物生長調節劑使用，適量的噴施可促進花藥開裂[26]。本試驗表明，CK組不育系藥室裂口閉合；A，B組經MeJA處理使本應閉合的花藥裂口張開(圖8)?？梢娺m量濃度的MeJA雖無法促進小孢子的正常發育，但可誘導花藥開裂。而紫花苜蓿不育系的表型特征即為花藥不開裂、花粉育性差，因此MeJA在一定程度上具有改善育性功能的作用。

本試驗中，MsJMT在紫花苜蓿不育系內表達對比保持系各時期呈下調趨勢，且花苞內MsJMT的表達量與JA含量呈負相關關系，此結果與實驗室之前對紫花苜蓿進行BSR篩選在轉錄組層面得到的結果一致，因此可推斷MsJMT的過表達應當為導致紫花苜蓿雄性不育原因的其中之一。

4 結論

本試驗成功克隆了MsJMT基因全長。結果表明MsJMT的表達在不育組與可育組間具有差異。利用外源MeJA噴施證實該激素對花藥開裂具促進作用，且最適濃度為1 mmol·L-1。以上表明MsJMT可能通過影響JA通路參與植株育性表達，后續轉化驗證工作有待進行，下一步可針對該通路進行育性候選基因挖掘。