ABA和GA3對山韭種子萌發、生理特性及內源激素含量的影響

胡國富， 李韋瑤， 肖匯川， 崔國文， 宋 雪， 韋銀珠， 蘇瀅淼， 秦立剛

(東北農業大學動物科學技術學院， 黑龍江 哈爾濱 150030)

山韭(AlliumsenescensL.)為百合科蔥屬多年生草本植物，也有山蔥和巖蔥之稱[1-2]。山韭具有很多的優良特性，如:適應能力強，即使是在干旱、貧瘠的地區也能保持良好的生長[3-4]；分布范圍廣，通常分布于歐洲、中亞地區、西伯利亞和中國北部，生長于海拔2 000 m以下的地區[5]；可食用，山韭生長在營養期，尤其是在結實階段，鱗莖、嫩葉和小花均可食[6]，各類家畜均喜食，特別在結實階段，是綿羊、山羊駱駝等的主要抓膘牧草；營養豐富，在各生育期均富含較高的蛋白質，是肥育牲畜的良好牧草[7-10]。

植物生長調節劑對植物種子的萌發具有明顯的促進作用，但植物生長調節劑的種類、含量水平和濃度比例對于種子萌發的促進效果不同[11-12]。研究表明，不同濃度的脫落酸(Abscisicacid，ABA)和赤霉素(Gibberellins，GA3)浸種均對種子萌發有促進作用。ABA是廣泛存在于植物體不同組織中且具有多種功能的激素，在種子休眠、生長發育等方面起著重要作用[13]。ABA對光皮樺(BetulaluminiferaWinkl)[14]、燕麥(AvenasativaL.)[15]、水稻(OryzasativaL.)[16]等種子的萌發有明顯的促進作用。GA屬于雙萜類物質，它能促進細胞分裂和細胞伸長，加速葉芽生長，影響植物淀粉酶等代謝酶的活性，有效打破種子休眠[17]。GA3能有效打破蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)[18]、滇油杉(KeteleeriaevelynianaMast.)[11]、杜鵑紅山茶(CamelliaazaleaWei)[19]等種子的休眠。在利用山韭種子作為外植體進行組織培養體系建立過程中發現，長期保存后的山韭種子在萌發過程中存在發芽率較低、發芽勢較差等問題，而在已有研究中，關于植物生長調節劑對山韭種子萌發影響的研究較少，因此本試驗通過研究不同濃度的植物生長調節劑對山韭種子萌發特性、相關酶活性和內源激素含量的影響，揭示植物生長調節劑促進山韭種子萌發的生理影響途徑，以期為山韭組培和遺傳轉化體系建立及大面積推廣栽培利用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1種子 供試材料為成熟的山韭種子，種子收獲于2019年9月東北農業大學草業科學試驗田(126°73′ N,45°75′ E，海拔134 m)。收獲后風干脫粒，清選籽粒飽滿的山韭種子置于4℃冰箱保存。千粒重約為2.03 g，含水量約為6.77%。

1.1.2試驗試劑 試驗中所用的ABA和GA3均購于博奧拓達公司。

1.2 試驗設計

表1 植物生長調節劑的濃度處理Table 1 Treatment concentrations of plant growth regulators

1.3 測定方法

1.3.1萌發指標 種子萌發試驗持續15天，在第7天計算山韭種子的發芽勢，在第15天計算發芽率、發芽指數、活力指數和苗鮮重，并計算活力指數，每天上午統計發芽數。有關計算公式如下：

發芽勢(%)=

(7天內正常發芽的種子數/供試種子總數)×100%

發芽率(%)=

(15天內正常發芽的種子數/供試種子總數)×100%

發芽指數=∑(Gt/Dt)

活力指數=GI×S

式中：Dt表示在t日的發芽數；Gt表示相應的發芽天數，S為萌發結束時鮮苗的平均芽長(mm)。

1.3.2胚根、胚芽長度及胚根、胚芽鮮重 15天發芽結束后，將山韭幼苗用蒸餾水沖洗干凈，并用濾紙吸干表面水分。每個處理隨機取10株測量胚芽長、胚根長和胚根胚芽的鮮重。

1.3.3生理指標測定 可溶性蛋白(Soluble protein，SP)和可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量，淀粉酶(Amylase，AL)、脂肪酶(Lipase，LPS)和中性蛋白酶(Neutral protease，NP)活性，均采用蘇州科銘生物技術有限公司測定試劑盒進行測定。

1.3.4內源激素的測定 吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、ABA,GA3和乙烯(Ethrel，ETH)含量均采用上海酶聯生物科技有限公司試劑盒進行測定。

1.4 數據分析

數據統計及圖表制作采用Microsoft Office Excel 2010軟件，采用IBM SPSS Statistics 22.0統計軟件進行顯著性方差分析并進行差異顯著性檢驗(Duncan)，主成分分析及相關性分析采用Origin 2021軟件。

2 結果與分析

2.1 ABA和GA3處理對山韭種子發芽的影響

由表2可知，與CK(對照)處理相比，ABA處理顯著提高了山韭種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數(P<0.05)。隨著ABA濃度的升高，山韭種子發芽勢和發芽指數呈先上升后下降的趨勢，均在ABA濃度為100 mg·L-1時達到最高，分別為33.33%和32.77。隨著ABA濃度的升高，山韭種子的發芽率與CK處理相比總體呈現升高趨勢，在濃度為100 mg·L-1時達到最高84%。ABA濃度為50 mg·L-1時山韭種子的活力指數達到最大值，顯著高于其他濃度(P<0.05)，之后隨ABA濃度的升高，山韭種子的活力指數則有不同程度的降低。

表2 ABA處理對山韭種子萌發的影響Table 2 Effects of ABA treatments on seed germination of Allium senescens L.

由表3可知，隨著GA3處理濃度的升高，山韭種子的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數均呈先升高后降低的趨勢。100 mg·L-1的GA3處理下，山韭種子的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數與CK相比均有顯著提升(P<0.05)，且均在GA3濃度為100 mg·L-1時達到最大值，分別為20.67%，79.33%，26.37，1 081.30。當GA3濃度增加到200 mg·L-1時，發芽勢、發芽指數和活力指數均有顯著下降(P<0.05)，發芽勢、發芽率和活力指數均隨GA3濃度的增加而下降，當GA3濃度增加到800 mg·L-1時，發芽勢、發芽率和活力指數降到最低，分別為2.67%，54.67%，184.54。

表3 GA3處理對山韭種子萌發的影響Table 3 Effects of GA3 treatments on seed germination of Allium senescens L.

2.2 ABA和GA3處理對山韭胚根和胚芽的影響

不同濃度的ABA處理對山韭胚芽和胚根影響不同。從圖1A可知，ABA處理對山韭胚芽和胚根長有顯著影響(P<0.05)，山韭胚芽長和胚根長均在ABA濃度為50 mg·L-1時達到最大值，分別為42.67 mm，12.67 mm，且胚芽長顯著高于CK。而當ABA升高到75 mg·L-1時，胚芽長和胚根長則降低到最低，分別為22.33 mm，2.33 mm。隨著ABA濃度的升高，胚芽重與CK相比有所增加(圖1B)。其中，當ABA濃度增加到50 mg·L-1時，胚芽重顯著高于CK且達到最大值為0.162 g(P<0.05)，胚根重也在此時達到最大值，為0.003 0 g。而當ABA升高到75 mg·L-1時，胚根重顯著低于CK且下降到最低(P<0.05)，為0.001 1 g。圖1C表明，隨著ABA濃度的增加，山韭胚芽胚根長比和胚芽胚根重比總體呈上升后下降的趨勢。當ABA升高到75 mg·L-1時，胚芽胚根長比和胚芽胚根重比均達到最高，分別為12.42，17.64。其中，胚芽根長比總是大于胚芽胚根重比。

圖1 ABA和GA3處理對山韭胚根和胚芽生長的影響Fig.1 Effects of ABA and GA3 treatments on seedling growth of Allium senescens L.注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，CK為對照組，下同Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05),CK is the control group,the same as below

由圖1可知，不同濃度的GA3處理下的山韭胚芽和胚根生長情況不同，GA3處理對山韭胚芽和胚根有顯著影響(P<0.05)。圖1D表明，隨著GA3濃度的增加，山韭胚芽和胚根長呈先升高后降低的趨勢，當GA3濃度增加到50 mg·L-1時，山韭的胚根長與CK相比顯著增加且達到最高(P<0.05)，其值為41 mm；而當GA3濃度增加到100 mg·L-1時，與CK相比，山韭的胚芽長顯著增加且最高，值為20 mm。由圖1E可見，當GA3濃度為100 mg·L-1時，胚根重升高到最大值，為0.003 3 g。當GA3濃度升高到400 mg·L-1時，胚根重顯著低于CK且最小(P<0.05)，為0.000 3 g。山韭胚芽胚根長比和胚芽胚根重比在隨GA3濃度的增加呈先下降后上升的趨勢。當GA3濃度為100 mg·L-1時，胚芽胚根長和胚芽胚根重的比值最接近，且此時胚芽胚根重值最低，為2.30。當GA3濃度為800 mg·L-1時，胚芽胚根長比和胚芽胚根重比均達到最大值，分別為9.06，10.05(圖1F)。

2.3 ABA和GA3處理對山韭胚芽生理指標和酶活性的影響

由圖2可知，與CK相比，100 mg·L-1ABA處理和100 mg·L-1GA3處理下的山韭胚芽可溶性蛋白含量顯著升高(P<0.05)，但二者之間無顯著差異。而山韭胚芽可溶性糖含量在100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3處理后均與CK相比沒有顯著變化(P<0.05)，但其含量均有增加。在酶活性方面：山韭胚芽的α-淀粉酶、β-淀粉酶、α+β淀粉酶在100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3處理下，與CK間均沒有顯著差異，但均有上升趨勢；而與CK相比，100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3處理下脂肪酶和蛋白酶均有顯著升高(P<0.05)，其中100 mg·L-1GA3處理下蛋白酶活性最高，值為9 867.79 μmol·min-1·g-1。

圖2 ABA和GA3處理對山韭胚芽生理指標和酶活性的影響Fig.2 Effects of ABA and GA3 treatments on physiological and enzymatic activity of Allium senescens L.注：ABA為脫落酸，GA3為赤霉素，下同Note:ABA is abscisicacid,GA3 is gibberellins,the same as below

2.4 ABA和GA3處理對山韭胚芽內源激素含量的影響

由圖3可知，100 mg·L-1ABA處理和100 mg·L-1GA3處理對山韭胚芽內源激素含量有顯著影響。與CK相比，ABA處理后的山韭胚芽內源ABA含量顯著降低，GA3處理后的內源IAA含量顯著降低(P<0.05)。ABA和GA3處理下的山韭胚芽內源ETH含量與CK相比均有顯著升高，且GA3處理下的ETH含量顯著高于ABA處理(P<0.05)。ABA處理下的山韭胚芽內源GA3含量顯著高于CK和GA3處理，而GA3處理下的內源GA3含量則顯著低于CK(P<0.05)。

2.5 ABA和GA3處理下山韭種子萌發各指標的綜合分析

由圖4A可知，各指標主要集中在一、二、四象限，也就是分布在100 mg·L-1ABA處理和100 mg·L-1GA3處理之間。其中，胚芽胚根長比、GA3含量、胚芽胚根重比、胚芽重和IAA主要分布在100 mg·L-1ABA處理下，說明其相關性較強；而在100 mg·L-1GA3處理附近主要分布的是胚根重、胚根長、胚芽長、ABA和ETH，說明這幾個指標之間距離較近，相關性也較強；在ABA和GA3處理下，β-淀粉酶和α+β淀粉酶之間距離很近，說明二者之間有很強的相關關系；發芽率、可溶性蛋白和α-淀粉酶之間距離較近，說明三者之間相關性較強。由圖4B可知，發芽率與發芽勢、發芽指數、活力指數、可溶性蛋白、α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶之間有極強相關性；發芽勢與發芽指數、可溶性糖、α-淀粉酶之間有較強相關性；發芽指數與可溶性蛋白、可溶性糖、α-淀粉酶之間有很強的相關關系；活力指數與酶活性和可溶性蛋白之間有強相關性；胚芽長與胚根長、胚根重、ABA，ETH之間有很強相關性，而與胚芽胚根長比、胚芽胚根重比、IAA,GA3之間有很強的負相關關系；胚芽重則與胚芽長相反，它與胚根長、胚根重、ABA，ETH有強負相關性而與胚芽胚根長比、胚芽胚根重比、IAA，GA3之間有強相關關系；胚根長、胚根重均與胚芽胚根長比、胚芽胚根重比、IAA，GA3之間負相關；同時，ABA與IAA和GA3之間也負相關；IAA和ETH之間也有強的負相關性。

圖3 ABA和GA3處理對山韭胚芽內源激素的影響Fig.3 Effects of ABA and GA3 treatments on endogenous hormone of Allium senescens L.注：IAA為吲哚乙酸，ETH為乙烯，下同Note:IAA is indole-3-acetic acid,ETH is ethrel,the same as below

3 討論

除環境因子對種子的萌發有顯著影響外，植物生長調節劑對種子萌發也有很大影響[22-23]。研究表明，低濃度的外源ABA處理可以降低內源ABA含量，從而促進種子的萌發和生長[24]。黃宇等[25]認為，適宜濃度的ABA可以顯著促進水稻種子的萌發和幼苗生長。本研究表明，隨著ABA濃度的增加，山韭種子的發芽指標和幼苗形態指標均呈先增加后降低的趨勢，在ABA濃度達到100 mg·L-1時山韭種子的萌發情況達到最佳。GA3作為一種信號物質，對種子萌發有顯著地促進作用，主要有加速細胞分裂、促進成熟細胞伸長的作用[20,26-27]。本研究表明，50～800 mg·L-1GA3浸種處理對山韭種子的萌發和幼苗生長表現為低濃度促進，高濃度抑制的效果。這與李超等[28]對燈籠樹(EnkianthuschinensisFranch.)種子萌發的研究結果相同。

種子成熟的過程中會積累大量的可溶性糖、可溶性蛋白等貯藏物質，當種子打破休眠開始萌發時，就會消耗種子內部的可溶性糖和貯藏蛋白[29]。而貯存物質分解需要酶的參與，因此，與貯存物質分解有關的酶活性增加是促進種子萌發的重要原因[30]。吳玉香等[31]在對西洋杜鵑的研究中表明，GA3處理后會使其內部的可溶性糖、可溶性蛋白發生不同的變化。本試驗中，100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3處理后的山韭種子可溶性蛋白和蛋白酶均有顯著增加，這與秦祎婷等[32]用ABA對東北紅豆杉(TaxuscuspidateSieb. et Zucc.)的研究結論一致。

圖4 ABA和GA3處理下山韭各指標主成分分析和相關性分析Fig.4 Principal component analysis and correlation analysis of all indices of Allium senescens L. in ABA and GA3 treatment

種子在萌發過程中與其內源激素含量的變化密切相關，內源激素能夠誘導貯藏物質的分解及合成并最終使種子的發芽[33]。本研究表示，100 mg·L-1ABA顯著增加了山韭胚芽GA3的含量，而顯著降低了胚芽ABA的含量；且100 mg·L-1GA3顯著降低了山韭胚芽IAA的含量，這與袁夢佳等[34]在赤霉素浸種對柴胡(BupleurumchinenseDC.)種子的研究結論相同。ABA和GA3處理均顯著增加了山韭胚芽ETH含量，GA3處理下山韭胚芽ABA和ETH含量成正比，這與黎正英等[35]的研究結果相同。發芽率與發芽勢、發芽指數、活力指數、可溶性蛋白含量、α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性、脂肪酶活性之間呈正相關性，說明發芽指標與淀粉酶活性、脂肪酶活性和可溶性蛋白含量之間密切相關性，這與雍太文等[36]在外源ABA含量對雜交水稻種子萌發的研究結論一致。ABA與GA3含量之間呈負相關性，說明ABA具有拮抗GA3的作用，這與Birgit[37]和Rohde[38]等人的研究結果一致。

4 結論

綜合種子發芽情況及形態指標，100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3是促進山韭萌發的最佳濃度。100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3處理顯著提高了發芽率、發芽勢、胚芽胚根長和胚芽胚根重且均顯著提高了可溶性蛋白含量、脂肪酶和蛋白酶活性。100 mg·L-1GA3處理顯著提高了山韭胚芽ETH含量和ABA含量，100 mg·L-1ABA的處理顯著增加了山韭胚芽GA3含量但顯著降低了ABA含量。主成分分析和相關性分析表明：山韭種子發芽率、發芽指數和活力指數與可溶性蛋白、可溶性糖含量以及酶活性之間顯著正相關。