不同外源物質對鹽堿脅迫下紫蘇種子萌發、幼苗生長及生理的影響

蘇文欣， 許凌欣， 姜宛彤， 劉宇樂， 王 菲， 呂亞茹， 嚴俊鑫

(東北林業大學園林學院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

土壤鹽堿化嚴重影響了農林業的發展，并造成巨大的經濟損失。我國鹽堿地總面積達9 913萬hm2，約占全國土地面積的10%[1]。作為我國鹽堿地主要分布區域之一的東北地區，其鹽堿地總面積已達766萬hm2[2]，位于東北的松嫩平原更是世界三大蘇打鹽堿地集中分布區域之一，土壤中鹽分以NaHCO3和Na2CO3為主[3]。種子萌發期是植物生長的關鍵時期，鹽堿脅迫會嚴重抑制植物種子的正常萌發。由于萌發幼苗通常發生在土壤表面，所以種子和早期幼苗相比于成熟植株暴露在鹽堿環境中的概率更大[4]。因此，種子萌發期是對鹽堿脅迫最為敏感的時期，增強種子萌發時的耐鹽堿能力是植物在鹽堿地建植的關鍵[5]。

目前,外源鈣、褪黑素(Melatonin,MT)和赤霉素(Gibberellin,GA)緩解植物逆境脅迫的相關研究有很多。鈣是植物生長所必須的營養元素，在植物的種子萌發和生長發育過程中發揮重要作用[6]，可增強植物對非生物脅迫的抗性[7]。Ca2+可以增加膜結合Ca2+量，提高膜的穩定性，從而對鹽堿脅迫下的植物起到一定積極作用[8]。研究表明，低濃度的氯化鈣(CaCl2)能夠促進黑麥草(Loliumperenne)[9]種子萌發。MT屬于吲哚類化合物，能夠促進正常生長條件下植物的生長[10]，在逆境條件下，MT可以通過促進種子萌發、提高保護酶活性、增加滲透調節物質的積累等提高植物的抗逆性[11]。研究發現，鹽脅迫下MT可提‘敖漢’苜蓿(Medicagosativa‘Aohan’)[12]和甜葉菊(Steviarebaudiana)[13]的種子發芽率。GA是一種植物內源激素，可以促進植物細胞的生長和分裂，進而促進植物的伸長[14]。在植物種子萌發階段，GA對打破休眠、促進種子萌發起到了不可或缺的作用[15]。一定濃度的GA可促進薰衣草(Lavandulamairei)[16]和棉花(Gossypiumhirsutum)[17]種子萌發，提高甜玉米(Zeamays)[18]幼苗的抗氧化酶活性和葉綠素含量，緩解鹽脅迫。

紫蘇(Perillafrutescens)是一年生唇形科紫蘇屬草本植物，其適應性強，對土壤要求不嚴，能夠在山地、丘陵及鹽堿地種植[19]。我國紫蘇資源豐富，栽培紫蘇的歷史悠久，并且在我國北方形成了西北和東北2個傳統油用紫蘇產區[20]。黑龍江樺南縣已經成為栽培籽用紫蘇的一大產區[21]，被譽為“中國紫蘇之鄉”。作為氣味芳香的彩色葉植物，紫蘇在園林綠化中也應用廣泛[22]。目前關于紫蘇種子的研究主要是化學成分和萌發特性方面，關于緩解鹽堿脅迫對紫蘇種子萌發影響的研究鮮見報道。本研究以紫蘇種子為試驗材料，分析了CaCl2，MT，GA對鹽堿脅迫條件下紫蘇種子萌發、幼苗生長、抗氧化酶活性的影響，以期為紫蘇抗鹽堿栽培提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫蘇種子，2021年9月購自藍翔園藝種苗有限責任公司，室溫儲藏。凈種后千粒重為5.02 g，含水量為8.03%，發芽率為96.67%左右。

1.2 試驗方法

選用顆粒飽滿、大小均勻的紫蘇種子，將種子在5%的過氧化氫溶液中浸泡5 min進行消毒，再用蒸餾水沖洗3～5遍，用濾紙吸干種子表面水分。分別用5種濃度的CaCl2(5，10，15，20，25 mmol·L-1)、MT(25，50，100，200，300 μmol·L-1)、GA(25，50，100，200，300 mg·L-1)浸種24 h，以蒸餾水浸泡24 h的紫蘇種子作為對照(對照記為CK，5個濃度梯度分別記為T1，T2，T3，T4，T5)，共16個處理，每個處理重復3次。采用培養皿濾紙發芽法[23]，將浸種后風干的種子置于鋪有2層濾紙直徑為9 cm的培養皿內，每個培養皿50粒種子。向培養皿中加入NaCl和NaHCO3按物質的量比例1：1混合[24]的濃度為80 mmol·L-1的脅迫溶液5 mL(溶液濃度根據前期預試驗確定，pH 8.36，水勢-0.28 MPa)，最后用保鮮膜封口，減少水分蒸發。將培養皿置于光照培養箱中進行培養，設置25℃恒溫，相對濕度75%，光周期為12 h光照/12 h黑暗，每隔24 h觀察并記錄紫蘇種子萌發情況，第10 d結束發芽試驗，取幼苗測定其生長指標。

幼苗生長試驗于種子萌發試驗后進行，萌發試驗結束后將培養皿中的幼苗繼續在光照培養箱中培養5 d，之后將出芽15 d的幼苗移栽至穴盤中(泥炭土∶珍珠巖∶蛭石=5∶1∶1)，繼續進行脅迫處理，采用盆浸法使脅迫溶液完全浸透基質，每個處理重復3次，30株幼苗為一個重復，移入穴盤15 d后取樣測定其生理指標。

1.3 測定指標與方法

1.3.1種子萌發指標測定 以胚根長度達到種子長度的1/2為發芽標準，第4 d統計發芽勢，第10 d計算發芽率、發芽指數、活力指數。

發芽勢(GE)=

(第4 d發芽種子數/供試種子數)×100%；

發芽率(GP)=

(第10 d發芽種子數/供試種子數)×100%；

發芽指數(GI)=∑Gt/Dt；Gt為第t天種子發芽數，Dt為相應的發芽天數；

活力指數(VI)=GI×S；S為胚根長[25]。

1.3.2幼苗生長指標測定 胚根長、胚芽長：每個處理隨機取10株幼苗，使用游標卡尺測量出長度，取其平均值，每個處理重復3次。

鮮重：每個處理隨機取10株幼苗，用濾紙吸干表面水分，采用稱重法測量10株幼苗的總重，每個處理重復3次。

1.3.3幼苗生理指標測定 取幼苗葉片測定其抗氧化酶活性，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法[26]測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[27]測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法[26]測定。

1.4 數據分析

使用Microsoft Excel 2016進行數據整理，用SPSS 25.0進行數據分析，用Duncan法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

采用模糊數學隸屬函數法，對不同處理下紫蘇種子萌發、幼苗生長和生理指標進行綜合評價，計算公式為[28]：

X(ij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

式中，X(ij)為i處理下j指標的隸屬函數值，Xij為i處理下j指標的測定值，Xjmin為j指標的最小觀測值，Xjmax為j指標的最大觀測值。

2 結果與分析

2.1 氯化鈣、褪黑素、赤霉素對紫蘇種子萌發指標的影響

由表1可以看出，鹽堿脅迫下不同濃度外源物質浸種處理對紫蘇種子萌發的影響不同。隨著3種外源物質濃度的上升，種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數呈先升高后降低的趨勢。在CaCl2處理中，各項種子萌發指標都在10 mmol·L-1濃度下達到最高值，較CK顯著增加(P<0.05)。而20，25 mmol·L-1的CaCl2使種子發芽率較CK稍有降低，表明適宜濃度的CaCl2能夠促進鹽堿脅迫下紫蘇種子萌發，而到達一定濃度后CaCl2反而會對紫蘇種子萌發產生抑制作用。MT處理下，除發芽率在300 μmol·L-1濃度較CK稍有降低外，其余萌發指標均高于CK，各項指標均在100 μmol·L-1濃度達到最大值，分別較CK增加了9.68%，16.22%，13.2%，75.75%，差異顯著(P<0.05)。不同濃度GA均能夠促進紫蘇種子萌發。發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均在50 mg·L-1濃度下達到峰值，分別較CK增長了10.48%，18.01%，16.36%，79.2%，差異顯著(P<0.05)。在不同濃度的3種外源物質處理中，50 mg·L-1的GA是促進種子萌發的最佳處理。

表1 不同濃度CaCl2，MT和GA處理對鹽堿脅迫下紫蘇種子萌發的影響Table 1 Effects of different concentrations of CaCl2,MT and GA on the germination of Perilla frutescens seeds under saline-alkali stress

2.2 氯化鈣、褪黑素、赤霉素對紫蘇幼苗生長指標的影響

由圖1所示，隨著CaCl2和MT濃度的增加，紫蘇幼苗的胚根長、胚芽長和鮮重均呈現先升高后下降的趨勢；而在GA處理下，除胚根長隨GA濃度的增加呈先升后降趨勢外，胚芽長和鮮重均逐漸增加。不同濃度的CaCl2均較CK促進了紫蘇胚根、胚芽的伸長和鮮重的增加，這3項指標均在10 mmol·L-1處理下達到最高值，分別較CK增加了52.84%，20.59%，40.04%，差異顯著(P<0.05)。在MT處理中，與CK相比50～300 μmol·L-1濃度使胚根長顯著增加(P<0.05)，25～200 μmol·L-1濃度使鮮重顯著增加(P<0.05)，而胚芽長受MT影響不大。胚根長和鮮重均在100 μmol·L-1濃度下達到最大值，胚芽長則在50 μmol·L-1濃度達到最高值。不同濃度的GA均能使胚根長、胚芽長和鮮重較CK顯著增加(P<0.05)，3個指標分別較CK增加了32%～54.06%，23.77%～67.74%，44.07%～97.42%。3種外源物質處理中，100 mg·L-1MT是促進鹽堿脅迫下紫蘇幼苗胚根伸長的最佳處理，300 mg·L-1GA是促進胚芽伸長和鮮重增長的最佳處理。

圖1 不同濃度CaCl2，MT和GA處理對鹽堿脅迫下紫蘇幼苗胚根長(A)、胚芽長(B)、鮮重(C)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of CaCl2,MT and GA on the radicle length (A),embryo length (B) and fresh weight (C) of Perilla frutescens seedlings under saline-alkali stress

2.3 氯化鈣、褪黑素、赤霉素對紫蘇幼苗抗氧化酶活性的影響

從圖2可以看出，在鹽堿脅迫下一定濃度的3種外源物質對幼苗的抗氧化酶活性具有促進作用，且隨著外源物質濃度的增加，3種酶活性均呈現出先升高后降低的趨勢。CaCl2處理中，SOD和CAT活性均在10 mmol·L-1濃度下達到峰值，較CK分別增加了167.34%，198.82%，差異顯著(P<0.05)。POD活性在5 mmol·L-1濃度達到最大值，較CK增加31.11%，差異顯著(P<0.05)。300 mmol·L-1CaCl2使3種酶活性較CK降低，其中CAT活性較CK降低了55.42%，差異顯著(P<0.05)。MT處理中，3種酶均在100 μmol·L-1濃度達到最大值，較CK分別增加了176.1%，241.42%，49.74%，差異顯著(P<0.05)。25～100 mg·L-1的GA處理能夠顯著增加3種酶活性(P<0.05)，SOD和CAT活性在50 mg·L-1濃度下達到最大值，而POD活性則在25 mg·L-1濃度下最高。300 mg·L-1GA處理下，POD活性較CK降低了6.67%，差異顯著(P<0.05)。3種外源物質浸種處理中，100 μmol·L-1MT是提高紫蘇幼苗抗氧化酶活性的最佳處理。

圖2 不同濃度CaCl2，MT和GA處理對鹽堿脅迫下紫蘇幼苗SOD(A)、CAT(B)、POD(C)活性的影響Fig.2 Effects of different concentrations of CaCl2,MT and GA on SOD (A),CAT (B) and POD (C) activities of Perilla frutescens seedlings under saline-alkali stress

2.4 綜合評價

為篩選出緩解鹽堿脅迫下的最佳處理，采用隸屬函數法對不同處理下的10個指標進行綜合評價，評價結果如表2所示。不同濃度3種外源物質浸種處理均能夠在不同程度上緩解紫蘇受到的鹽堿脅迫。其中以50 mg·L-1的GA促進效果最好。其次是100 μmol·L-1的MT和10 mmol·L-1的CaCl2，其隸屬平均值分別排第2和第3。

表2 不同濃度CaCl2，MT和GA浸種對鹽堿脅迫下紫蘇種子萌發和幼苗生長的綜合評價Table 2 Comprehensive evaluation of seed germination and seedling growth of Perilla frutescens under saline-alkali stress by seed soaking with different concentrations of CaCl2,MT and GA

3 討論

3.1 不同外源物質對鹽堿脅迫下紫蘇種子萌發和幼苗生長的影響

種子萌發期是植物對鹽堿脅迫最敏感的時期，這一時期的耐鹽堿能力能夠在一定程度上反應該植物對鹽堿脅迫的抗性[29]。紫蘇在種子萌發和幼苗生長階段具有較強的耐鹽性，能夠種植于中度以下的鹽漬地[30]。蘇銀玲等[31]研究發現，紫蘇對中性鹽NaCl的抗性較強，而對堿性鹽NaHCO3和Na2CO3以及混合鹽堿的抗性相對較差，當堿性混合鹽濃度達到25 mmol/L時就會顯著抑制紫蘇的種子萌發。本研究中，隨著CaCl2濃度的增加，鹽堿脅迫下紫蘇的種子萌發指標和幼苗生長指標均呈現出先升高后降低的趨勢，其中發芽率在20 mmol·L-1和25 mmol·L-1CaCl2處理下較對照降低，這與杜志花等[9]對黑麥草的研究結果一致，CaCl2能促進種子萌發，但高濃度的CaCl2反而會起到抑制作用。可能是由于低濃度的鈣離子增強了生物膜的穩定性，而且作為第二信使保證了鈣信號通路的正常傳導[32]，而高濃度的鈣離子會導致水勢降低，使得種子吸水困難，從而抑制種子萌發[9]。不同濃度處理中，其中以10 mmol·L-1濃度為最佳，這與李永濤等[33]發現10 mmol·L-1CaCl2對促進NaCl脅迫下蘆葦(Phragmitesaustralis)種子萌發效果最好的研究結果一致。

MT廣泛存在于植物中，能夠促進種子萌發和胚根生長[11]。本研究不同濃度MT處理下，紫蘇種子的發芽勢、發芽指數、活力指數、胚根長、鮮重都較對照增加，而種子發芽率和胚芽長在最高濃度300 μmol·L-1處理下較對照略有下降，且隨著MT濃度上升，各項指標均呈先升后降的趨勢，其中以100 μmol·L-1為最佳處理濃度，這與熊艷麗等[34]對MT緩解扁穗雀麥(Bromuscatharticus)鹽脅迫的研究結果一致。已有研究表明，這種MT對種子萌發和幼苗生長表現出低濃度促進高濃度抑制的現象普遍存在于多種植物中[35]，可能原因是過高濃度的MT誘導蛋白質氧化變性，從而導致活性氧積累，使脅迫加劇[5]。

GA與脫落酸(ABA)具有拮抗作用，能夠打破由ABA積累導致的休眠，促進種子萌發[36]。本次試驗中，不同濃度GA浸種均促進了紫蘇種子萌發和幼苗生長。其中除胚芽長和鮮重隨GA濃度升高而不斷增加外，其余各指標均呈先增后減的趨勢，這與張麗麗等[37]發現NaCl脅迫下耐鹽水稻(Oryzasativa)品種長白9號種子萌發指標和主胚根長隨GA濃度增加而出現先升后降，而芽長不斷增加的研究結果一致。其原因可能是過高濃度GA擾亂了種子內部正常的生理代謝，使得其緩解效果變差[27]。胚芽的不斷伸長則表明，植物的不同部位對GA的敏感度不同。

3.2 不同外源物質對鹽堿脅迫下紫蘇幼苗抗氧化酶活性的影響

正常情況下，植物體內活性氧含量能夠維持平衡，逆境脅迫會使植物細胞產生過量的活性氧自由基(ROS)，對植物的正常生長發育有很大不良影響。保護酶系統可以通過消除過量的自由基，從而保護植物的細胞膜。SOD，CAT，POD等是保護酶系統中的重要成分。施加外源鈣能夠誘導EnFeSOD，EnCAT2，EnAPX等與抗氧化酶相關的基因的表達，提高抗氧化酶活性，清除鹽堿脅迫導致細胞內過量積累的活性氧[38]。本研究中，隨著CaCl2，MT，GA濃度增加，鹽堿脅迫下紫蘇幼苗的3種酶活性都呈現出先升高后下降的趨勢。CaCl2浸種處理中，5～15 mmol·L-1的CaCl2均能顯著提高3種抗氧化酶活性，以10 mmol·L-1為最佳濃度，這與張春平等[39]研究發現NaCl脅迫下，10 mmol·L-1CaCl2是提高紫蘇幼苗抗氧化酶活性的最佳濃度一致。

MT不僅能有效清除ROS，其與活性氧反應產生的代謝物N1-乙酰基-N2-5-甲酰基-甲氧基犬尿胺、2-羥基褪黑素、環3-羥基褪黑素等也可以作為有效的抗氧化劑[40]。添加的外源MT主要通過上調SOD，CAT，POD，APX等基因的表達，提高抗氧化酶活性，抵抗鹽堿環境引起的氧化脅迫[35]。本試驗中，50～200 μmol·L-1MT浸種能夠顯著提高紫蘇幼苗抗氧化酶活性，且在100 μmol·L-1濃度下達到峰值。這與范海霞等[41]研究MT緩解NaCl對金盞菊(Calendulaofficinalis)幼苗脅迫的結果一致。鹽脅迫下褪黑素可以顯著提高紫花苜蓿(Medicagosativa)[42]幼苗的POD和SOD活性，但對CAT活性影響不大。以上相關研究表明一定濃度的褪黑素能夠通過提高抗氧化酶活性來緩解鹽堿脅迫對植物幼苗生長的抑制作用，但是不同植物對其響應不同。

NaCl脅迫下GA可以提高板藍根(Isatisindigotica)[43]和番茄(Lycopersiconesculentum)[44]幼苗的抗氧化酶活性，緩解脅迫對植物帶來的氧化損傷，促進幼苗生長。本研究中，不同濃度GA均提高了SOD，CAT，POD的活性，其中25～100 mg·L-1濃度處理下的3種抗氧化酶活性較對照顯著提高，以50 mg·L-1為最佳處理濃度。朱秀紅等[45]對3種泡桐研究發現，GA增強毛泡桐(Paulowniatomentosa)抗氧化酶活性的最佳濃度是400 mg·L-1，白花泡桐(Paulowniafortunei)和臺灣泡桐(Paulowniakawakamii)的最佳濃度為600 mg·L-1，這表明，植物種類不同，提高抗氧化酶活性所需的GA濃度不同，另外，處理方法和鹽堿脅迫中鹽分類型和濃度都會影響GA的最佳處理濃度。

4 結論

紫蘇對混合鹽堿的抗性不強，鹽堿脅迫會抑制其種子萌發和幼苗生長，而通過施用外源激素可以緩解這一脅迫。本研究表明，CaCl2，MT和GA都能夠促進鹽堿脅迫下紫蘇的種子萌發和幼苗生長，且隨處理濃度的增加，種子萌發和幼苗生長指標以及抗氧化酶活性均呈先上升后下降的趨勢。其中10 mmol·L-1CaCl2，100 μmol·L-1MT和50 mg·L-1GA處理可以顯著促進紫蘇的各項指標。隸屬函數分析結果顯示，50 mg·L-1GA浸種是緩解鹽堿脅迫下紫蘇種子萌發和幼苗生長的最佳處理。在以NaCl和NaHCO3為主的鹽堿地種植紫蘇時，可以使用50 mg·L-1GA對紫蘇種子進行預處理，提高其在鹽堿地的出苗率、促進幼苗生長。