三氯生對羊肚菌霉菌性枯萎病病原菌的抑制作用

楊 春，劉本洪，劉 蕾，張 怡

(四川大學建筑與環境學院， 成都 610065)

【研究意義】羊肚菌(Morchellaspp.)是一類名貴食(藥)用菌[1]，在國際市場上有較大需求，價格頗高，2018年全國人工栽培羊肚菌干品批發價保持在900～1400 元/kg[2]。羊肚菌屬于低溫型真菌[3]，適宜生長溫度為18～22 ℃[4]。新鮮羊肚菌上市季節非常短暫，主要在春季[5]。中國羊肚菌商業栽培開始于2012年前后，主要栽培物種為梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)和六妹羊肚菌(Morchellasextelata)，隨后國內羊肚菌的人工栽培面積不斷擴大，從2012年200 hm2[6]到2018—2019年8000～9333 hm2[7]。羊肚菌栽培在中國食用菌栽培行業占據重要地位，川渝地區是我國羊肚菌主產區[6]。與常規食用菌基質袋栽技術不同，羊肚菌整個栽培過程均暴露在復雜外部環境中，菌絲生長和子實體發育易受土壤微生物影響[8]。隨著食用菌栽培產業迅速發展和栽培規模不斷擴大，食用菌病害越來越普遍和頻繁，成為制約產業發展的主要瓶頸[9]，羊肚菌也是如此。在2013年3月，由Diplo?sporalongispora引起的霉菌性枯萎病(下文簡稱枯萎病)首次在湖北省和重慶市被發現，5%～8%菇體感染了枯萎病，如今該病害在栽培區域已十分常見[10]。【前人研究進展】以往的研究集中于致病真菌分離和鑒定。目前已知枯萎病是一種嚴重的真菌性病害且多發生于栽培后期，當環境溫度升高時病害會迅速蔓延，染病部位呈白色絨毛狀，隨染病時間增加受侵染部位會萎縮、凹陷和破損。該病原菌分生孢子具有隔膜，通常直接由菌絲膨大而成，呈橢圓形或近梭形；該病原菌的厚垣孢子近球形，通常呈串珠狀[11]。枯萎病防控措施主要為土地提前翻耕暴曬、及時撤走被污染的外源營養袋和及時采摘感病的菇體[8]。病原真菌與羊肚菌對藥物敏感程度具有相似性，這就對化學藥劑選用提出很高要求[12]。目前沒有該病害相關抑菌劑研究報道。【本研究切入點】三氯生(Triclosan，下文簡稱TCS)是一種人工合成的抑菌劑，已經被廣泛應用于口腔護理產品中[13]，如牙膏[14]和漱口水[15]。含TCS的牙膏可以有效控制牙菌斑形成和保持牙齦健康[16]。TCS在較低濃度時即可有效抑制革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、酵母菌和霉菌[17]。在與其他化學抑菌劑如六氯酚(Hexachlorophene)、氯碘羥喹(Clioquinol)、氯喹那多(Chlorquinaldol)和慶大霉素(Gentamicin)等的對比中，TCS對細菌和真菌作用效果明顯，表現為對多種細菌和真菌具有更低的最小抑制濃度[18]。TCS曾應用于平菇(Pleurotusostreatus)、大球蓋菇(Strophariarugosoannulata)和蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)等食藥用菌的液體發酵，由于液體菌種在實際生產中極易受到雜菌污染，在配制液體培養基時加入TCS(濃度為1～30 mg/L)能夠抑制雜菌生長，提高發酵成功率[19]。根據TCS在食藥用菌液體發酵中的應用，推測TCS具有抑制羊肚菌雜菌病害的可能性。【擬解決的關鍵問題】本文研究了TCS抑雜菌能力和不同濃度TCS對六妹羊肚菌和枯萎病病原菌生長產生的影響，并關注了在不同TCS濃度下六妹羊肚菌和枯萎病病原菌微觀結構的變化，為研發控制羊肚菌枯萎病的抑菌劑提供資料參考，有利于羊肚菌栽培行業的發展。

1 材料與方法

1.1 固體培養基

實驗在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養基的基礎上增加麥麩作為培養基原料，制得麥麩馬鈴薯葡萄糖瓊脂(下文簡稱WPDA培養基)培養基，每1 L培養基加入200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g麥麩和21 g瓊脂。需滅菌的培養基均在1.5×105Pa下滅菌40 min。

1.2 菌種

六妹羊肚菌母種由四川省成都市科創菌業有限公司提供。在羊肚菌收獲期間從四川省德陽市中江縣某羊肚菌栽培基地(31.023°N，104.737°E)收集出現枯萎病癥狀的菇體，用滅菌的接種環挑取感病部位的白色菌絲接種于WPDA培養基，常溫培養4 d后可發現培養基上出現具有濃密白色菌絲的菌落，將其轉接至新的WPDA培養基中純化培養。鏡檢觀察到該菌種的分生孢子呈梭形且具隔膜，還具有呈串珠狀的厚垣孢子。委托四川省成都市羅寧生物科技有限公司對病原菌菌種進行分子生物學鑒定，使用真菌通用引物ITS1和ITS4進行ITS rRNA基因的PCR擴增，使用NCBI的blastn進行堿基序列的對比，供試菌株的ITS序列與Paecilomycespenicillatus和D.longispora均具有99%的一致性，枯萎病病原菌D.longispora曾被錯誤地鑒定為P.penicillatus[12]。結合分生孢子和厚垣孢子的形態特征可判斷該菌種為D.longispora。六妹羊肚菌母種和純化后得到的枯萎病病原菌菌種均放置在培養箱中(18±0.5)℃條件下培養。

1.3 主要試劑和儀器

TCS(山東臨沂優索化工科技有限公司)、全溫培養箱HZP-250(上海精宏實驗設備有限公司)、高壓蒸汽滅菌鍋XFS-280A+(浙江新豐醫療器械有限公司)、立式顯微鏡AXIOSKOP40(卡爾·蔡司股份公司)。

1.4 TCS抑雜菌能力檢驗

首先，將0.50 g的TCS加入500 mL的純凈水中，配制得到1000 mg/L的TCS懸浮液原液。將原液按比例與WPDA培養基混合可得到含不同濃度TCS的培養基。與原液混合后的培養基液體被分裝進玻璃試管(18 mm×180 mm)中，分裝完成后使用脫脂棉塞封口。

設置2組實驗，每組實驗的TCS濃度如表1所示。TCS濃度為0 mg/L的處理為對照組(Control check，CK)。實驗1中培養基設置滅菌與不滅菌2種處理，這與評價亞麻籽環肽混合物對霉菌的抑制作用[20]和有機肥對黃瓜枯萎病的防治效果[21]的實驗設計類似，不滅菌基質中帶有各種雜菌，接近自然條件。實驗1主要是為了探究TCS在發揮抑雜菌能力的同時又對六妹羊肚菌產生較小影響的濃度范圍，為實驗2的濃度設置提供參考依據。

實驗2中，將六妹羊肚菌與枯萎病病原菌接種于同一試管培養基上，接種枯萎病病原菌3 d后再接種六妹羊肚菌，通過這種方式模擬土壤中存在枯萎病病原菌的情況。實驗2中所有培養基都經過高壓蒸汽滅菌后再接種。

實驗1和實驗2的每一種處理都設置10個重復。在實驗2的濃度條件下培養了單一的枯萎病病原菌，用以觀察不同TCS濃度下病原菌菌絲的微觀結構差異。接種后的培養基均放入培養箱中(18±0.5)℃培養。

1.5 測量菌絲生長長度

菌絲生長長度可用于評估真菌生長情況，參考在原種培養基中測量菌絲在豎直方向上的延伸長度的方式[22-25]，測量菌絲在試管中的延伸長度。實驗1在接種六妹羊肚菌3 d后測量菌絲生長長度。使用不銹鋼卷尺測量菌絲縱向的生長長度，當菌絲長至試管底部時測量范圍為試管底部至菌絲延伸上邊界，某些處理組中菌絲未長至試管底部，此時測量范圍為菌絲延伸的下邊界至上邊界。

實驗2中六妹羊肚菌與枯萎病病原菌在同一試管培養基上共同培養，六妹羊肚菌接種較枯萎病病原菌接種晚3 d。在接種枯萎病病原7 d后測量菌絲生長長度。測量菌絲生長長度的方式為測量接種塊中心位置至菌絲延伸最長處的距離。

1.6 光學顯微鏡下觀察菌絲微觀結構

實驗期間進行多次使用光學顯微鏡觀察六妹羊肚菌和枯萎病病原菌菌絲結構變化。

1.7 TCS噴施的初步對比試驗

試驗地點選擇中國四川省德陽市中江縣某羊肚菌栽培基地(31.023°N，104.737°E)，該基地多個地塊的羊肚菌菇體出現枯萎病病害癥狀。選擇4個出現感病菇體的區域，采用背負式電動噴霧器噴施濃度為40 mg/L的TCS懸浮液，噴施對象為明顯感染枯萎病的菇體，觀察噴施TCS懸浮液一周后枯萎病病癥變化。

1.8 數據統計分析

以均值(x)±2倍標準差(s)判斷每組數據的異常值。使用Kolmogorov-Smirnov檢驗和Levene檢驗分別對數據是否服從正態分布和是否具備方差齊性進行檢驗(顯著性水平α=0.05)。當數據服從正態分布且具有方差齊性時，采用單因素方差分析(α=0.05)檢驗各組處理菌絲生長長度間是否存在統計學意義上的差異，事后多重比較選擇LSD法(α=0.05)。當數據服從正態分布，但不具備方差齊性時，事后多重比較選擇Dunnett’s T3法(α=0.05)。如果數據不服從正態分布，就采用Wilcoxon符號秩和檢驗(α=0.05)。數據統計分析使用SPSS 25.0。

2 結果與分析

2.1 不同濃度TCS處理下未滅菌的培養基雜菌污染和六妹羊肚菌菌絲生長情況

對照組(0 mg/L)培養基表面出現了大量雜菌，肉眼可見地抑制了六妹羊肚菌菌絲生長(圖1-a)，統計分析結果也證實了這一點，對照組六妹羊肚菌菌絲生長長度顯著地低于20、40、80 mg/L處理下的菌絲生長長度。當TCS濃度為20 mg/L時，六妹羊肚菌菌絲生長長度顯著地高于0、40、60、80和100 mg/L處理下六妹羊肚菌菌絲生長長度，但是在培養基表面仍能發現較多雜菌(圖1-b)。高濃度TCS在抑制雜菌的同時，也抑制六妹羊肚菌的生長，TCS濃度為60和100 mg/L時，六妹羊肚菌菌絲生長長度與對照組無顯著性差異。

數據以x±s形式展示，帶有相同英文字母表示菌絲生長長度在顯著性水平為0.05的條件下不具有統計學意義上的差異。下同Data are presented as x±s, with the same English letter indicating that the mycelial length did not show a statistically significant difference at the level of 0.05.The same as below圖1 不同濃度TCS處理下未滅菌的試管培養基接種六妹羊肚菌3 d后的菌絲生長長度和培養基雜菌生長情況Fig.1 Mycelial length and undesired microbes’ growth after 3 days of inoculation of M. sextelata on unsterilized test tube media under different concentrations of TCS

在不滅菌的情況下，與對照組相比，加入TCS的培養基出現雜菌的情況明顯減少，且隨著TCS濃度的增加，抑雜菌效果就越明顯。但是，當TCS濃度過高(100 mg/L)時，TCS對六妹羊肚菌菌絲生長的抑制作用不可忽視，甚至與雜菌對六妹羊肚菌生長產生的抑制類似。

表1 各組實驗的TCS濃度設置

2.2 不同濃度TCS處理下滅菌后培養基六妹羊肚菌菌絲生長情況

實驗1-2中對照組的六妹羊肚菌菌絲生長長度最長，顯著地高于其他處理組。40 和100 mg/L TCS處理濃度下，六妹羊肚菌菌絲生長長度沒有顯著性差異。培養基不滅菌處理主要是為了檢驗TCS是否具有良好的抑雜菌效果。培養基滅菌處理可檢驗在沒有雜菌影響的情況下TCS濃度對六妹羊肚菌生長的影響。可發現隨著TCS濃度增加，六妹羊肚菌菌絲生長長度呈下降趨勢。從菌絲外觀可以看出，當TCS濃度為40～100 mg/L時，菌絲主要呈團狀(圖2-d～圖2-f)；當TCS濃度較低時，菌絲生長較為整齊。

圖2 不同濃度TCS處理下滅菌試管培養基接種六妹羊肚菌3 d后的菌絲生長長度Fig.2 Mycelial length and undesired microbes’ growth after 3 days of inoculation of M. sextelata on sterilized test tube media under different concentrations of TCS

2.3 不同濃度TCS處理下枯萎病病原菌與六妹羊肚菌共同培養時的生長情況

2.3.1 枯萎病病原菌和六妹羊肚菌菌絲生長情況 從菌絲外觀可以看出，隨著TCS濃度的增加，枯萎病病原菌和六妹羊肚菌的菌絲生長形態逐漸畸形(圖3)，這與實驗1觀察到的現象一致。

接種枯萎病病原菌25 d后每組處理已有2支培養基被用于觀察光學顯微鏡下的菌絲微觀結構；(a)接種7 d后；(b)接種4 d后，此時是接種枯萎病病原菌7 d后Two test tube media of each treatment were used to observe the microstructure of mycelium after 13 days of D. longispora inoculation; (a) After 7 days of inoculation; (b)After 4 days of inoculation, 7 days after D. longispora inoculation圖3 不同濃度TCS處理下六妹羊肚菌與枯萎病病原菌共同培養時菌絲生長長度Fig.3 Mycelial length in co-cultures of M. sextelata and D. longispora under different concentrations of TCS

接種枯萎病病原菌7 d后，40 mg/L TCS濃度下霉菌性枯萎病病原菌菌絲生長長度最短，顯著地低于0、5、10和20 mg/L處理下的菌絲生長長度。0、10和20 mg/L處理下的枯萎病病原菌菌絲生長長度之間沒有顯著性差異。同時隨著TCS濃度的增加，六妹羊肚菌的菌絲生長長度也隨之減小。因為已有2支試管種被用于觀察顯微鏡下微觀結構，所以接種枯萎病病原菌25 d后每組處理剩余8支試管種。此時可觀察到枯萎病病原菌與六妹羊肚菌交叉生長，從外觀上可看出，枯萎病病原菌菌絲在與六妹羊肚菌菌絲相接后仍逐漸向上延伸，培養基中未添加TCS的對照組中可觀察到枯萎病病原菌菌絲長滿整個培養基的現象。

2.3.2 顯微鏡觀察下的微觀結構 在顯微鏡下觀察，可在六妹羊肚菌菌絲體周圍發現枯萎病病原菌串珠狀的厚垣孢子(圖4-a、c、d)，且病原菌菌絲可能侵入了羊肚菌菌絲(圖4-b、e、f)。顯微鏡下未觀察到六妹羊肚菌的分生孢子。羊肚菌在人工栽培過程中容易產生分生孢子，但是在實驗室培養中沒有觀察到分生孢子的產生[26]。

接種枯萎病病原菌35 d后，箭頭指出附著在羊肚菌菌絲周圍的枯萎病病原菌菌絲和孢子After 35 days of D. longispora inoculation.Arrows point to the mycelia and spores of D. longispora attached to mycelia of M. sextelata圖4 不同濃度TCS處理下六妹羊肚菌與枯萎病病原菌交叉生長區域菌絲形態Fig.4 Mycelial morphology in the co-growth area of M. sextelata and D. longispora under different concentrations of TCS

在40 mg/L的TCS處理濃度下，枯萎病病原菌產生的分生孢子出現畸形、破裂和內容物外泄現象(圖5)。在其他TCS處理濃度(0、5、10、20 mg/L)下未觀察到此現象。

圖5 接種單一枯萎病病原菌41 d后不同濃度TCS處理下分生孢子形態Fig.5 Conidia morphology under different concentrations of TCS after 41 days of D. longispora inoculation

2.4 TCS噴施的初步對比試驗結果

真菌性病害爆發速度快，會很快地擴散至周圍區域[11]。初步對比試驗的結果表明對感染枯萎病的羊肚菌噴施40 mg/L的TCS懸浮液后，枯萎病未出現大范圍擴散現象。可明顯看出生長在感病菇體周圍的大部分健康菇體在7 d后并未出現枯萎病感染癥狀(圖6-e～圖6-h)且生長正常。

3 討 論

食用菌病害包括侵染性病害和競爭性病害，如木霉菌(Trichodermaspp.)是最常見的食用菌侵染性病害病原菌[27]。在對峙實驗中可觀察到棘孢木霉(T.asperellum)的分生孢子附著在平菇菌絲周圍[28]，多個木霉菌株都能侵入香菇(Lentinusedodes)菌絲體中[29]。本實驗發現枯萎病病原菌孢子附著于六妹羊肚菌菌絲周圍且病原菌菌絲侵入六妹羊肚菌菌絲的現象，這與木霉侵染平菇和香菇的表現一致，然而目前病原真菌侵染食用菌菌絲的具體過程還沒有深入研究[29]，僅推測枯萎病屬于侵染性病害。

抑制病菌的菌絲生長是抑菌劑產生效果的表現。枯萎病病原菌的菌絲生長長度隨著TCS濃度的增加而降低，表明TCS對羊肚菌枯萎病病原菌的菌絲生長表現出了抑制作用。這一結果與以下抑菌劑對某些致病菌菌絲造成的抑制效果相似：氰烯菌酯和種菌唑對水稻惡苗病病原菌(Fusariumfujikuroi)具有很高的抑真菌活性，表現為對菌絲生長產生抑制[30]。從香莢蘭(Vanillaplanifolia)中萃取的o-Vanillin能夠抑制污染糧食作物的真菌Aspergillusflavus菌絲生長，表現為隨著o-Vanillin劑量的提高，菌落直徑減小，菌絲抑制率不斷增加[31]。

TCS可以抑制細菌在FabI(烯酰—酰基載體蛋白還原酶)步驟中的脂肪酸合成，這種抑制作用會造成膜完整性的喪失[32]。雖然TCS的作用機制被歸結為對脂肪酸生物合成的抑制，但有研究證明TCS的抑菌作用至少部分是通過嵌入磷脂膜，造成膜結構擾動介導的，它可能發揮了一種獨立于抑制脂肪酸生物合成的抑菌作用[33-34]，但是這些作用都最終表現為細胞膜完整性的破壞。此外，TCS可干擾FabB(3-氧代-酰基載體蛋白合成酶I)，從而防止細菌形成菌落[35]，這解釋了在不滅菌處理下添加了TCS的培養基很少或幾乎沒有細菌污染的現象。

在真菌性病害中，病原菌和食用菌同屬于真菌，無性孢子是病原菌的初侵染與再侵染源，因此控制病原菌的孢子萌發非常重要[36]。在40 mg/L的TCS處理下枯萎病病原菌分生孢子的畸形、破裂和內容物的外泄，說明在該濃度處理下，TCS對枯萎病病原菌已表現出良好的抑真菌活性。細胞膜是真菌細胞吸收營養并與周圍環境交換物質能量的重要屏障，它的完整性在維持細胞活力方面起著重要作用[37]，破壞細胞膜的完整性是抑菌劑發揮作用的一種方式[38]。在噴施40 mg/L的TCS懸浮液后，羊肚菌枯萎病擴散現象得到有效抑制。

目前，多種化學抑菌劑被用于防治食用菌的雜菌污染和病害，選擇抑菌劑應該堅持高效、低毒和低殘留的原則，其次是考慮食用菌對抑菌劑的敏感性[39]。病原菌與食用菌同屬于真菌，具有類似的生理特征，對病原菌有強烈抑制作用的抑菌劑可能無法避免對食用菌也有抑制作用[36]。因此，應選擇具有良好防治病菌效果，又對食用菌本身影響較小的抑菌劑。中國農藥信息網(http://www.icama.org.cn/hysj/index.jhtml)的農藥登記數據中，可查詢到13 條用于食用菌(蘑菇)生產的抑菌劑，包含的農藥種類有咪鮮胺錳鹽、二氯異氰尿酸鈉、百菌清和噻菌靈，施用方法一般為拌料或噴霧。目前還未見到用于羊肚菌栽培生產的農藥備案[11]。

多菌靈常用于抑制食用菌生產過程中的雜菌生長。在PDA平板中不同濃度多菌靈對茶樹菇(Agrocybeaegerita)菌絲生長產生明顯抑制作用，不同濃度的處理組(10、15、20、25、30、35和40 μg/mL)與對照組菌絲生長速度差異極顯著(P<0.01)，且隨著濃度增大抑制作用增強[40]。對綠色木霉(T.viride)菌絲有抑制作用的多菌靈對平菇菌絲生長也具有抑制作用，500、1000、2000、4000倍稀釋的多菌靈對平菇菌絲生長速度的影響與對照相比差異極顯著(P<0.01)，抑制作用與施加藥劑濃度呈正相關[41]。測試殺真菌劑對菌蓋疣孢霉菌(Mcogoneperniciosa)和雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)菌絲的毒力差異，得到咪鮮胺類殺菌劑施保功和施保克對菌蓋疣孢霉菌菌絲、疣孢霉菌分生孢子和雙孢蘑菇菌絲都具有較強的抑制作用，而施保功在雙孢蘑菇上已取得登記，可以應用于生產[42]。

方框圈出菇體感染枯萎病的部位Boxes mark the part of morels infected by D. longispora圖6 噴施的TCS懸浮液(40 mg/L)7 d后感染枯萎病的羊肚菌生長狀態Fig.6 The growth state of morels infected by D. longispora after 7 days of spraying TCS suspension(40 mg/L)

TCS濃度的增加會造成六妹羊肚菌菌絲生長受到抑制。TCS濃度越高，抑制作用越明顯。這與上述某些在現實中得到應用的化學抑菌劑對食用菌產生的影響具有一致性。因此，選擇合適的抑菌材料和控制施用濃度十分重要。

慢性毒性試驗中，在Sprague-Dawley大鼠的飲食中以4種劑量水平(0、300、1000和3000 mg/L)施用TCS，為期2年。另外的實驗組以6000 mg/L的劑量施用1年。結果顯示，TCS對大鼠死亡率沒有顯著影響，在飲食TCS劑量為3000 mg/L的大鼠中觀察到肝臟疾病，但在1000 mg/L的劑量水平下未發現大鼠肝臟組織變化，可認為1000 mg/L是TCS長期口服的“無影響水平”，毒理學和藥代動力學研究以及臨床調查表明，TCS對人類一般沒有毒性潛力[13]。

《牙膏用原料規范》 (GB 22115—2008)中規定的TCS最大允許使用濃度為0.3%[43]，本研究結果表明40 mg/L的TCS足夠抑制羊肚菌枯萎病，該濃度僅占牙膏中最大允許使用濃度的1.3%，且并不需要長期施用。歐洲消費者安全科學委員會(Scientific Committee on Consumer Safety)評估了TCS應用于消費品的安全性，在總結中表明漱口水中0.2%的最大TCS添加濃度和牙膏中0.3%的最大TCS添加濃度是安全的[44]。盡管TCS能夠以0.3%的最大濃度被添加到牙膏(口腔護理產品)中，它在羊肚菌這一食用菌栽培上的應用安全性仍需要在未來得到進一步的研究。

4 結 論

(1)TCS能夠有效控制羊肚菌菌種生產和栽培過程中的雜菌污染，對特定的枯萎病病原菌也具有良好抑制效果，表現為對菌絲生長的抑制和孢子完整性的破壞。

(2)在田間栽培環境中病菌污染風險遠大于實驗室環境，特別是在栽培環節，羊肚菌栽培種被直接播種于土壤中，病菌污染的可能性更大。TCS噴施的初步對比試驗結果表明在這種高風險環境下，TCS仍表現出了肉眼可見的抑制羊肚菌枯萎病擴散的良好效果。

(3)高濃度的TCS會對六妹羊肚菌的生長具有抑制作用，但是與病菌污染造成的抑制作用相比，一定濃度范圍內(10～40 mg/L)TCS產生的抑制作用影響較小。本實驗的發現表明TCS可能成為一種具有前景的應對羊肚菌枯萎病的抑菌材料。

致 謝：感謝中國科學院成都山地災害與環境研究所的邱敦蓮研究員在文章撰寫和修改過程中給予的意見和建議。