氟啶胺在三七中的降解行為及安全性評價

李文希，代雪芳，張雪燕，浦恩堂

(云南省農業科學院農業環境資源研究所，昆明 650205)

【研究意義】三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F. h. Chen]為五加科人參屬多年生宿根草本植物，是馳名中外的名貴中藥材，也是預防和治療心血管疾病的首選藥材[1-2]。云南文山是三七的道地產區，常年種植面積及產量均占全國的60%以上[3]。三七屬多年生植物，生長環境溫暖陰濕，導致病蟲害問題十分嚴重。目前生產上三七病蟲害防治大多依賴化學農藥，但三七上的登記用藥與實際生產用藥嚴重失衡，大部分農藥的使用均無科學的用藥依據，導致三七中農藥殘留失控，給食品安全及生態環境安全帶來巨大風險[4-5]。另一方面，歐盟、美國、日本、韓國等發達國家對進口中藥材及保健品提出了嚴苛的農殘限量指標，并以此作為貿易技術壁壘限制藥材進口，三七產品出口面臨著嚴峻的挑戰。因此開展農藥田間規范殘留試驗，研究其在三七中的降解行為及殘留水平，并進行膳食攝入風險評估，對制定三七中的農藥殘留限量標準及指導三七生產安全合理用藥具有重要意義。【前人研究進展】通常情況下，通過莖葉施用的農藥會附著于作物表面或被作物吸收，通過自然滴落、雨水沖刷等方式進入環境中，并發生遷移、代謝、富集等一系列生化過程[6]。目前，關于農藥在三七及環境中的降解行為及殘留特征的研究報道較少，僅涉及苯醚甲環唑[7]、多菌靈[8]及百菌清[9]等使用較普遍的農藥。【本研究切入點】氟啶胺(Fluazinam，圖1)是一種新型取代苯胺類保護性殺菌劑，通過阻斷病菌能量(ATP)的形成而使病原物死亡，被用于多種作物的病害防治，且同市面上的大多數殺菌劑無交互抗性[10-11]。但氟啶胺被報道對人體有潛在威脅，可引發哮喘病、皮炎等免疫系統疾病[12]。根據農業部小作物農藥登記專項和國家農藥殘留限量標準小作物補點專項項目組調查，氟啶胺對三七圓斑病、黑斑病等病害均有良好的防治效果。目前，關于氟啶胺的殘留行為研究主要集中在菊花[12]、黃瓜[13]、馬鈴薯[14]、辣椒[15]、蔥[16]等作物中，其在三七及環境中的殘留行為及安全性尚不明確。【擬解決的關鍵問題】本文在前人建立的方法基礎上[11-17]，采用超高效液相色譜—串聯質譜(UPLC-MS/MS)建立了氟啶胺在三七和土壤基質中的殘留定量分析方法，通過開展田間試驗，跟蹤監測了氟啶胺在三七莖葉、根部及土壤中的轉移、降解和富集過程，并建立相應降解模型；研究了不同施藥影響因子條件下氟啶胺在三七主要藥用部位塊根、須根及花中的殘留特征，開展膳食攝入風險評估，以期為三七上的合理用藥奠定科學基礎。

圖1 氟啶胺結構式Fig.1 Structural formula of fluazinam

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters I-Class ACQUITY 超高效液相色譜儀和Xevo TQD 三重四極桿串聯質譜儀(美國Waters公司)；TARGIN VXIII多管渦旋振蕩儀(北京踏錦科技有限公司)；LXJ-IIB 低速大容量多管離心機(上海安亭科學儀器廠)；SIGMA 1-14 離心機(德國Sigma公司)；BUCHI R-200旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司)；TM-767III攪拌機(中山海盤公司)。

氟啶胺標準品(Fluazinam，CAS號：79622-59-6,德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)：純度99.5%；50%氟啶胺懸浮劑(50% fluazinam suspension，深圳諾普信農化股份有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，上海麥克林生化科技有限公司)；氯化鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳(GCB,上海安譜實驗科技股份有限公司)；純水(屈臣氏蒸餾水)；0.22 μm微孔濾膜(天津津騰實驗設備有限公司)。1000 mg/L氟啶胺標準溶液配制：準確稱取氟啶胺標準品0.01 g(精確至0.0001 g)于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，轉入棕色儲液瓶中保存備用。

1.2 分析檢測

1.2.1 樣品制備 干燥的塊根、須根和三七花樣品用植物粉碎機粉碎，過40目篩 (孔徑425 μm)，混合均勻；冷凍的鮮植株和根系樣品加入適量干冰用植物粉碎機打成粉狀，混合均勻，開口放置于冷凍條件下待干冰完全揮發；土壤樣品去除雜物后混合均勻。

1.2.2 提取 稱取5.0 g(精確到0.1 g)樣品于50 mL離心管中，加入純水(干樣10 mL、鮮樣5 mL)，再加入乙腈25 mL，渦旋提取10 min；加入NaCl 8 g，渦旋1 min后以3000 r/min離心5 min，待凈化。

1.2.3 凈化 移取1.0 mL上層清液于裝有PSA 50 mg和GCB 15 mg的2 mL離心管中(土壤樣品為50 mg PSA)，渦旋1 min后以10 000 r/min的速率離心3 min，用1 mL針管移取上清液經0.22 μm有機系濾膜過濾后轉移至進樣瓶中，用UPLC-MS/MS測定。

1.2.4 UPLC-MS/MS檢測條件 超高效液相系統(UPLC)條件：Acquity UPLC BEH C18柱 (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm)，柱溫35 ℃，進樣體積1.0 μL，流動相為甲醇(A)和水(B)，流速為0.4 mL/min，流動相梯度為：0～2.00 min，10%～90%A；2.00～4.00 min，90%A；4.00～4.10 min，90%～10%A；4.10～7.00 min，10%A。

串聯質譜(MS/MS)條件：電噴霧離子源(ESI)，負離子掃描，毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度400 ℃；脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮氣，脫溶劑氣流量800 L/h，錐孔氣流量50 L/h；碰撞氣為高純氬氣；采用多重反應監測模式(MRM)，以定量離子對、定性離子對和保留時間定性，以無干擾、響應高的定量離子對定量，質譜參數見表1。

1.2.5 標準曲線 取空白樣品，按照上述前處理方法提取、凈化得到空白基質溶液，將氟啶胺標準溶液分別用乙腈和空白基質溶液逐級稀釋配制為質量濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L的系列標準溶液，按照上述儀器條件檢測，以氟啶胺的質量濃度和對應峰面積繪制標準曲線。

1.2.6 檢測方法確證 檢測方法的確證包括對方法的線性范圍、基質效應、特異性、準確性、重復性及靈敏度(定量限)的考察和確證，其中方法特異性通過對比空白樣品色譜圖與標準溶液色譜圖，確認在目標物出峰處無雜質干擾；準確性及重復性通過添加回收試驗確證，在空白樣本(三七塊根、須根、植株、根系、花及土壤)中分別添加3檔水平的氟啶胺標準溶液，每檔添加水平重復5次，按上述前處理及檢測方法檢測樣品，以平均回收率評估方法準確性及相對標準偏差(RSD)評估方法重復性；方法的定量限為采用添加方法能準確檢測的目標物最低濃度；基質效應(ME)為基質與溶劑標準曲線的斜率比，當ME在0.9～1.1時，表示基質效應不明顯，低于或超過該范圍則表示基質減弱/增強效應。

1.3 田間試驗

田間試驗按照NY/T 788—2004《農藥殘留試驗準則》[18]和《農藥登記殘留田間試驗標準操作規程》[19]進行試驗設計，于2018年8—10月在云南省曲靖市沾益區、昆明市石林縣、紅河州彌勒市、文山州丘北縣進行，包括殘留消解試驗及最終殘留試驗，試驗信息見表2。選擇地勢平整，作物長勢良好的三七地塊進行田間試驗，供試作物為三年生三七，采用標準遮蔭棚設施栽培，試驗安排在三七第3年生育期，試驗期間進行正常的田間管理，不施用目標農藥。將試驗區劃分為面積為15 m2的小區，每種處理重復3次，另設空白對照區。

1.3.1 消解動態試驗 將50%氟啶胺懸浮劑按375 g a.i./hm2莖葉噴霧施藥1次，分別于施藥后當天(2 h)、1、3、5、7、14、21、30、45和60 d采集三七植株、鮮三七根、0～10 cm深根際土壤樣品。每次每小區采用棋盤法采挖三七10～15株，分為植株和根系，再采集三七根系附近0～10 cm深土壤樣品約1 kg，同時將根系上附著的泥土刮下，合并裝入聚乙烯封口袋中，植株部分切成約1 cm小段，根系部分用清水洗凈后切片，分別放入聚乙烯封口袋中。在附近選擇一塊墑情適中的地塊，將三七拔除，單獨進行土壤消解試驗，按相同的施藥劑量施藥，并在相同間隔期采集0～10 cm深土壤樣品約1 kg，放入聚乙烯封口袋中。所有樣品均置于<-18 ℃條件下冷凍保存。

1.3.2 最終殘留試驗 將50%氟啶胺懸浮劑按不同施藥劑量、施藥次數噴施于三七植株，并在不同采收間隔期采集樣品。分別設低劑量(最高推薦劑量，有效成分250 g/hm2)及高劑量處理區(1.5倍最高推薦劑量，有效成分375 g/hm2)，施藥3次和4次，施藥間隔期7 d，末次施藥后5、7、14 d采集三七花樣本，7、14、21 d采集三七根樣本。每小區每次采用棋盤法采集三七新鮮蓓蕾約200 g，攤開，用遠紅外燈照射(表面溫度40～50 ℃)至含水量≤13%(約1～2 d，期間不定時翻動)，裝袋密封；采挖10～15株生長正常、無病害、成熟的三七全株，清理根部泥土，剪棄地上部分植株，根系洗凈后分為塊根和須根，塊根切片后與須根分別用遠紅外燈照射(表面溫度40～50 ℃)至含水量≤13%(約2～3 d，期間不定時翻動)，裝袋密封；所有樣品均置于<-18 ℃條件下冷凍保存。

1.4 數據分析

為保證檢測結果的準確性，采用基質標準曲線—外標法對試驗樣品進行定量，按下式計算樣品中氟啶胺的殘留量。

(1)

式中，C為殘留量(mg/kg)；A為樣品峰面積；V為提

表1 氟啶胺串聯質譜參數

表2 試驗點信息

取溶液的體積(mL)，m為樣品質量(g)，b為標準曲線截距，a為標準曲線斜率。

氟啶胺的降解趨勢采用一級反應動力學方程計算。

Ct=C0e-kt

(2)

式中,Ct為農藥殘留量(mg/kg)；C0為農藥原始殘留量(mg/kg)；k為降解系數；t表示施藥后時間(d)。

半衰期t1/2表示農藥殘留量消解一半所需要的時間。

(3)

式中,k表示消解系數。

氟啶胺的膳食攝入風險以風險概率RQ(%)表示[20-21]。

NEDI=∑(STMRi×Fi)

(4)

(5)

式中,NEDI為農藥的國家估算每日攝入量(mg)；STMRi為農藥在特定食品中的殘留中值(mg/kg)，如果沒有殘留中值則用相應的MRL值代替；Fi為該食品的一般人群消費量(kg)；式(5)中b.w.為人體重(kg)；ADI為每日允許攝入量(mg/kg bw)。RQ為一般人群攝入該農藥的風險概率，當RQ≤100%時，認為對一般人群無健康風險，比值越小風險越低。

2 結果與分析

2.1 前處理方法優化

在前人建立的前處理方法基礎上[12,17]，重點考察了不同凈化方法—分散固相萃取法(d-SPE)、固相萃取法(SPE)及不同凈化劑的凈化效果，并以方法的回收率及基質效應進行對比評價。以三七塊根為例，在空白樣品中添加氟啶胺標準溶液使添加濃度為0.2 mg/kg，靜置30 min后，采用1.2.2的方法提取，取上清液用不同的方法凈化。結果如圖2所示，柱形圖表示方法的回收率，灰色方框內為可接受回收率70%～110%，而三角符號表示方法的基質效應(ME)，紅線位置表示ME為1即無基質效應，回收率符合要求的前提下基質效應越低表示干擾越少，凈化效果越好。從圖2可看出，未凈化的樣品溶液呈基質增強效應(ME>1.1)，樣品凈化后基質效應有不同程度的降低，其中以采用PSA/C1850 mg+GCB 15 mg、PSA/C1850 mg+GCB 15 mg+無水MgSO4150 mg為凈化劑的d-SPE法和采用氨基柱(NH2)的SPE法的基質效應最低，凈化效果最好；但SPE法操作復雜，需要使用較多的有機溶劑，且氨基柱會吸附目標物，無法洗脫(回收率接近0)。綜合幾種基質的凈化對比結果后，最終決定采用以PSA 50 mg + GCB 15 mg(土壤樣品用PSA 50 mg)作為凈化劑的分散固相萃取法對樣品提取液進行凈化，該方法操作簡便，方法技術指標均滿足殘留分析的要求。

圖2 不同凈化條件下添加氟啶胺0.2 mg/kg于三七塊根的凈化效果對比(n=3)Fig.2 Comparison of purification efficiency of adding 0.2 mg/kg fluazinam in P. notoginsengroot tuber under different clean-upconditions (n=3)

2.2 分析方法的確證

如圖3所示，以三七塊根為例，通過對比基質空白樣品與標準溶液及添加樣品色譜圖可確定在空白樣品中目標物出峰處的干擾峰的響應值低于最低添加濃度響應值的30%，因此對樣品檢測無影響。方法的關鍵技術參數列于表3中，在0.002～0.200 mg/L(植株為0.002～1.000 mg/L)濃度內，氟啶胺在三七塊根、須根、植株、根系、花及土壤基質中均呈現良好的線性關系，相關系數大于0.99；基質效應均不顯著，在0.9～1.1內；定量限為0.01～0.02 mg/kg。添加回收結果表明，氟啶胺在所有基質中的回收率在82%～103%，RSD為1%～13%，準確度及精密度均符合農藥殘留分析的要求。

A：三七塊根基質氟啶胺標準溶液0.002 mg/L；B：三七塊根空白對照；C：三七塊根添加氟啶胺0.01 mg/kgA: The 0.002 mg/L fluazinam matrix-matched standard solution of P. notoginseng root tuber; B: The blank control of P. notoginseng root tuber; C: The 0.01 mg/kg sample of fluazinam in P. notoginseng root tuber圖3 氟啶胺在三七塊根中的添加回收色譜圖Fig.3 Chromatograms of fortified samples of fluazinam in P. notoginseng root tuber

2.3 消解動態試驗

2.3.1 氟啶胺在三七體系中的消解動態 2個試驗點氟啶胺在三七體系中的消解動態曲線如圖4～5所示。施藥后2 h氟啶胺在三七植株中的原始沉積量分別為36.2(沾益)和31.1 mg/kg(彌勒)，殘留量隨間隔期延長逐漸降低，7 d降解率55%～60%，30 d后降解率99%以上，消解動態符合一級動力學模型，降解方程為C=27.332e-0.106t，r=0.9824(沾益)和C=22.6e-0.094t，r=0.9545(彌勒)，半衰期分別為6.5和7.4 d。施藥后2 h氟啶胺在根際土壤中即能被檢測到，原始沉積量為0.046～0.053 mg/kg，之后殘留量逐漸升高，分別于施藥后14(沾益)和5 d(彌勒)達到峰值，為0.45和0.22 mg/kg，殘留量隨時間呈波動性降解，60 d后均低于0.05 mg/kg，降解趨勢不符合一級動力學模型。氟啶胺在根系中的原始沉積量為0.033～0.057 mg/kg，之后殘留量逐漸升高，分別于5(沾益)和14 d(彌勒)達到第1個高峰0.098～0.110 mg/kg，于21(沾益)和30 d (彌勒)達到第2個高峰0.068～0.16 mg/kg，降解趨勢不符合一級動力學方程。氟啶胺在土壤中的原始沉積量為0.23～0.61 mg/kg，之后殘留量在14 d內(沾益)和21 d(彌勒)內隨時間的推移逐漸降低，分別降解49%和86%，之后殘留量呈波動性降解，60 d后降解86%～89%，擬合降解方程分別為：C=0.5715e-0.023t，r=0.782(沾益)；C=0.2139e-0.033t，r=0.7359(彌勒)，半衰期分別為30.1和20 d。

圖4 沾益試驗點氟啶胺在三七體系中的消解動態曲線(n=3)Fig.4 Dissipation dynamic curves of fluazinam in P. notoginseng systemin Zhanyi (n=3)

圖5 彌勒試驗點氟啶胺在三七體系中的消解動態曲線Fig.5 Dissipation dynamic curves of fluazinam in P. notoginseng systemin Mile (n=3)

表3 方法的線性范圍、相關系數、基質效應、平均回收率、相對標準偏差(n=5)及定量限

氟啶胺為保護性殺菌劑，本身不具有內吸傳導性，噴施后氟啶胺藥劑主要附著于三七地上部分莖葉上，到達地下部分的藥劑量較低；此外，氟啶胺在根際土壤中的最大殘留量分別為沾益14 d時的0.45 mg/kg以及彌勒5 d時的0.22 mg/kg，約為直接噴施于土壤中的最大沉積量的63%～70%，由此可推斷噴施于作物的大部分藥劑最終將進入土壤，至少占噴施總量的60%以上。氟啶胺在三七根系中的殘留量分別為0.057～0.160 mg/kg(沾益)和0.022～0.098 mg/kg(彌勒)，說明雖然氟啶胺不具有內吸性，但有一定的滲透性，進入土壤中的氟啶胺藥劑可通過滲透擴散作用進入三七根系中，而沾益的殘留水平高于彌勒，這可能與土壤中的微生物群落及其對藥劑的利用降解能力有關，在彌勒土壤中氟啶胺的降解半衰期更短、降解速率更快，因此最終進入三七根系中的藥劑量更少，表現為更低的殘留水平。

2.4 最終殘留試驗

最終殘留試驗結果表明，4個地點三七花中氟啶胺的最終殘留量為0.015～0.860 mg/kg，三七塊根為0.045～0.750 mg/kg，須根為0.029～0.920 mg/kg。不同施藥因子下氟啶胺在不同基質中的殘留分布如圖6～8所示，增大施藥劑量，三七花和塊根中的殘留量均顯著增加(P<0.01)，但在三七須根中差異不顯著(P>0.05)；而增加施藥次數，3種基質中的殘留變化均不顯著(P>0.05)；此外，隨著采收間隔期的延長氟啶胺在三七花中表現為7 d內顯著降低(P<0.001)，而7～14 d輕微升高(P>0.05)，究其原因可能與農藥性質有關，氟啶胺雖無內吸傳導性，但具有一定滲透擴散性，在施藥初期附于植株(三七花)表面的藥劑受滴灌水或雨水沖刷而進入土壤，殘留量大幅降低，隨著時間的推移，藥劑逐漸滲透吸附于植株表皮，因此殘留量變化趨于穩定。三七塊根和須根中的氟啶胺殘留隨采收間隔期變化不顯著(P>0.1)，氟啶胺主要通過根際土壤滲透進入三七根系中，同時伴隨滲透、擴散、富集和降解行為，過程受土壤性質和微生物影響，因此隨采收間隔期波動不明顯。

圖6 不同施藥劑量下三七中氟啶胺最終殘留量Fig.6 The final residues of fluazinam in P.notoginseng at different doses

圖7 不同施藥次數下三七中氟啶胺最終殘留量Fig.7 The final residues of fluazinam in P.notoginseng at different application times

圖8 不同采收間隔期三七中氟啶胺最終殘留量Fig.8 The final residues of fluazinam in P.notoginseng at different harvesting intervals

2.5 膳食攝入風險評估

氟啶胺ADI值為0.01 mg/kg bw[22]。根據中國農藥信息網氟啶胺在中國的登記使用情況，結合中國居民人均膳食結構調查數據[23]、農藥毒理學數據以及本研究獲得的規范殘留試驗中值(表4)，以收獲期21 d三七須根中氟啶胺殘留中值數據進行風險評估。結果如表5所示，氟啶胺的國家估算每日攝入量(NEDI)為0.45 mg，每日允許攝入量為0.63 mg，風險概率為71.4%，說明50%氟啶胺懸浮劑按照推薦劑量在三七上施用，對消費者的慢性膳食攝入風險在安全范圍內。

表4 氟啶胺在三七花、塊根、須根中的最終殘留量

表5 氟啶胺膳食攝入風險評估結果

3 討 論

3.1 氟啶胺在三七中的消解動態

目前，已有對氟啶胺在馬鈴薯[11,14]、菊花[12]、黃瓜[13]、辣椒[15]、蔥[16]等作物中的殘留消解研究報道，研究表明氟啶胺在這些作物上的降解均較快，半衰期為1.0～8.7 d，屬于易于降解的農藥，與本研究結果相似。但是報道的氟啶胺在土壤中的降解速率差異較大，氟啶胺在土壤中降解主要依靠土壤微生物分解，受土壤pH、濕度、有機質含量及土壤微生物影響[24]，因此存在明顯的地區差異。此外，分析苯醚甲環唑[7]、多菌靈[8]及百菌清[9]在三七中的降解行為可知，內吸性殺菌劑苯醚甲環唑和多菌靈可迅速被三七植物吸收并傳導至地下根部，施藥后3 d內地下根部殘留量達到峰值，且殘留較高(約為0.7 mg/kg)，遠高于非內吸性農藥百菌清及氟啶胺。

3.2 氟啶胺在收獲期三七中的殘留水平

最終殘留試驗表明，施藥后7 d內三七花中氟啶胺殘留大幅降低，之后殘留則變化較小，因此三七花的采收間隔期宜在施藥7 d以后。氟啶胺在三七根中的殘留量在施藥后21 d內變化幅度較小，氟啶胺不具有內吸傳導作用，大部分藥劑將殘留于地上部分及土壤環境中，到達地下根部的殘留較少，但由于三七收獲后要進行干制處理，脫水后作物中的農藥經過濃縮富集，因此在三七干樣中殘留較高，這一現象在其他干制作物中也有類似的現象[12]。目前中國制定氟啶胺在三七塊根中的MRL值為1 mg/kg，三七須根中的MRL值為2 mg/kg[22]，推薦安全采收間隔期為7 d。

4 結 論

采用超高效液相色譜—串聯質譜(UPLC-MS/MS)建立了三七和土壤基質中氟啶胺殘留的提取定量方法。氟啶胺在三七植株上的半衰期為6.5～7.4 d，在土壤中的半衰期為20.0～30.1 d，在根際土壤和三七根系中的消解不符合一級動力學反應模型，呈先升高后波動性降解的趨勢。50%氟啶胺懸浮劑分別按250和375 g a.i./hm2的劑量噴霧施藥3和4次，施藥間隔7 d，施藥后7、14、21 d三七塊根中氟啶胺的殘留量均<1 mg/kg，三七須根中氟啶胺的殘留量均<2 mg/kg，推薦安全采收間隔期(PHI)7 d。膳食攝入風險評估結果顯示，氟啶胺的風險概率(RQ)為71.4%，風險在安全范圍內。