宣和豬PID1基因外顯子3的SNP檢測及其與肉質性狀的關聯分析

劉 梅，朱怡軒，王孝義，陳 強，董新星，嚴達偉，李明麗

(云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201)

【研究意義】宣和豬是針對優質豬肉市場和宣威火腿產業需求，以地方豬種烏金豬為基礎培育素材、歷經10余年選育而成的新品種，于2018年獲得國家畜禽新品種證書。宣和豬不僅在繁殖、生長、胴體等主要生產性能上較烏金豬大幅改進，且烏金豬肉質優良、適應性強、耐粗飼、母性好等優點得以有效保持[1]，優質高效特征明顯，是優質豬肉及宣威火腿生產的理想品種。但目前，關于宣和豬主要的經濟性狀的具體分子遺傳機制還不明確。通過候選基因等途徑研究其肉質性狀的遺傳基礎，揭示相關候選基因的遺傳效應，對于進一步加快其遺傳改良具有非常重要的意義。【前人研究進展】磷酸酪氨酸互作結構域1(Phosphotyrosine interaction domin containing 1,PID1)基因是Wang等[2-3]通過抑制消減雜交技術從肥胖人群腹膜后脂肪組織中篩選出的一個基因。據研究報道，PID1基因的主要生物學作用是降低胰島素的敏感性，在脂肪、骨骼肌、心肌等胰島素作用的靶組織中均呈較高表達。PID1是脂肪組織和肌肉中葡萄糖攝取的負調節因子，與脂蛋白相關受體蛋白1(Lipoprotein receptor-related protein 1, LRP1)相互作用以降低脂肪細胞的胰島素敏感性[4]，并經過降低胰島素受體底物-1(Insulin receptor substrate, IRSs-1)/磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase, AKT)信號通路[5-6]、減少葡萄糖轉運子4(Glucose transporter, GLUT4)向包膜轉位的機制，引發成熟脂肪細胞胰島素刺激下葡萄糖攝取率的降低[7-8]。研究還發現腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis Factor-α, TNF-α)不僅降低胰島素敏感性，還顯著上調3T3-L1成熟脂肪細胞中PID1基因的表達[9-10]，TNF-α和PID1基因對胰島素的調節都是通過IRSs-1/PI3K/AKT信號通路，而PID1蛋白作為信號分子在脂肪形成以及細胞生長過程中發揮作用，推測PID1基因可能作為重要的分子介質參與TNF-α誘導的胰島素抵抗。并且PID1還促進3T3-L1成熟脂肪細胞中脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)基因mRNA的表達，FASN是脂肪酸從頭合成的關鍵限速酶，促進長鏈飽和脂肪酸的合成[11]，同時PID1基因表達過量能顯著降低3T3-L1前體脂肪細胞的葡萄糖轉換，促進3T3-L1前體脂肪細胞的增殖和脂肪細胞數目的增多[12]，最終使脂肪沉積增多。曾勇慶等[13]研究發現，萊蕪豬、魯萊黑豬肌內脂肪含量明顯高于大白豬，而錢源等[14]研究發現，在3個品種中，PID1基因mRNA表達量具有顯著差異，表現為萊蕪豬>魯萊黑豬>大白豬，且肌內脂肪含量與PID1基因mRNA表達量呈顯著正相關。此外，錢源等[15]還發現，在高、中、低3種肌內脂肪含量的萊蕪豬中，PID1基因mRNA表達量越高，肌內脂肪含量也越高，由此推測PID1基因可能是影響包括肌內脂肪含量的肉質性狀的候選基因。【本研究切入點】本研究以PID1基因作為候選基因研究宣和豬的肉質性狀，基于外顯子3的SNP突變位點多態性分析每個突變位點與豬肉質性狀之間的關聯，用來表明每個SNP位點的具體效應。【擬解決的關鍵問題】為實際育種中使用PID1基因標記改良宣和豬的肉質性狀提供一些科學數據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗中所用的119頭宣和豬(♀76頭，♂43頭)都來自于云南省宣威市良種豬場，試驗豬群生長健康狀況均良好、系譜清晰，采用相同條件的飼養管理。每頭試驗豬采集耳組織樣約1～2 g，保存于裝有75%酒精的EP管中，儲于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 肉質測定

對119只試驗豬的肉質性能測定在云南省宣威市屠宰場完成。在豬群日齡為165～183 d、體重為95～105 kg時對其進行屠宰，取其倒數第3～4肋間的背最長肌和腰大肌樣品，按照《豬肌肉品質測定技術規范》(NY/T 821—2004)進行肉質測定。測定肌內脂肪、失水率、滴水損失、肉色、大理石紋、熟肉率等肉質評價指標。其中肌內脂肪含量(Intramuscular fat content, IMF)、滴水損失(Drip loss)、失水率(Water loss rate)、大理石紋(Marbling score)及肉色(Meat color)使用背最長肌進行數據測定，熟肉率(Cooked rate)數據的測定則使用腰大肌。

1.3 基因多態性測定

1.3.1 基因組DNA的提取和檢測 采用DNA提取試劑盒(TSINGKE)，于2019年12月在云南農業大學動物繁殖與育種實驗室對豬耳組織進行DNA的提取。取5 μL待檢的DNA原液與1～2 μL 6×loading buffer混合均勻，點樣于1.0%瓊脂糖凝膠中，110 V恒壓電泳35 min，在全自動凝膠成像分析儀下觀察DNA條帶有無及亮度情況，以檢測DNA提取質量。DNA檢測合格后，在-20 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 引物合成與PCR擴增 根據Ensembl數據庫中的豬PID1基因(序列號：ENSSSCG0007001 3396)的序列，利用 Primer Premier 5.0設計了6對引物，涵蓋了PID1基因的第3外顯子，在第5號引物(序列為F5：5′-CCCAGCAGAGGAAAGAAG-3′，R5：5′-CAAAGGCGTACACGGACA-3′，預期擴增片段為679 bp)的預擴增片段中檢出SNP位點，其余5對引物都未檢測到突變位點。引物均由北京擎科(昆明)生物技術有限公司制作合成，合成的引物放于-20 ℃ 冰箱儲存備用。PCR擴增體系：DNA模板1.0 μL，2×PCR mix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54.0 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共設置35個循環，最后72 ℃下延伸7 min。PCR所得產物使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行實驗室檢測。

1.3.3 目標片段測序和基因型測定 經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的PCR產物由北京擎科(昆明)生物技術有限公司對其進行DNA正向測序。使用SeqMan、BioEdit等軟件對試驗樣品DNA序列進行后續的分析比對，識別其多態位點，并經過堿基序列判斷其個體的基因型。每個SNP位點的位置和基因型使用全基因組序列和相應的堿基名稱對其進行正確的命名。

1.4 數據分析

1.4.1 群體遺傳結構分析 (1)基因頻率。基因頻率是指在一個群體中某一等位基因的數量與占據同一基因座的全部等位基因總數的比例，即：

Pi= (2Nii+Nij)/2N

式中，Nii為ii基因型所有的個體數目，Nij為ij基因型所有的個體數目，N為所有檢測的個體數目，Pi為i等位基因所占的頻率。

(2)基因型頻率。在檢測個體基因型的基礎上，進行各SNP位點基因型頻率的計算，基因型頻率按以下公式計算：

Pij=Nij/N

式中，Pij表示ij基因型的頻率，Nij表示ij基因型的個體數，N表示檢測個體數。

(3)多態信息含量。多態信息含量(Polymorphic information content,PIC)是用于估計SNP位點多態性高低的一個指標。當PIC<0.25時為低度多態，當0.25 ≤PIC<0.5時為中度多態，當PIC≥0.5時為高度多態，多態信息含量按以下公式計算：

式中，m表示等位基因數目，pi表示第i個等位基因所占的頻率，pj表示第j個等位基因所占的頻率。

(4)雜合度(Heterozygosity,H)是指某一SNP位點上雜合子所占的比例，按以下公式計算：

式中，m為某一SNP位點所具有的等位基因數；pi表示第i個等位基因的頻率。

(5)Hardy-Weinberg平衡檢驗。對豬群某一SNP位點是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態的分析采用χ2檢驗。假設群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態，根據樣本實際基因頻率計算各種基因型的理論頻率及理論個體數，然后計算χ2值：

1.4.2 單倍型分析 對PID1基因的4個SNP位點使用Phase 2.0軟件對其進行單倍型分析，得到PID1基因的單倍型和單倍型組合的類型，并根據該結果計算其頻率。

1.4.3 不同的基因型和單倍型組合與肉質性狀之間的關聯分析 使用以下最小二乘模型對宣和豬PID1基因外顯子3上的4個SNP位點的不同基因型和單倍型組合與肉質性狀進行關聯分析：

Yijl=μ+Gi+Sj+eijl

根據上述最小二乘模型[16]，4個SNP位點不同的基因型和單倍型組合性狀的平均數及標準差使用SAS 9.2[17]進行計算，結果表示形式為“平均數±標準差”，差異顯著性根據Duncan法進行檢驗，差異顯著以P<0.05表示，差異極顯著以P<0.01表示。

2 結果與分析

2.1 PID1基因的PCR擴增與基因分型

2.1.1 PCR擴增結果 試驗樣品使用第5號引物經過PCR擴增以后，PCR擴增效果通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測結果見圖1，擴增產物片段大小與預期擴增片段長度一致，符合進一步序列測序的要求。

圖1 PID1基因 PCR擴增結果Fig.1 PCR amplified results of PID1 gene

2.1.2 基因多態性 在宣和豬PID1基因外顯子3區域檢測到4個SNP變異位點，分別為253 643 bp處的T→C(T253643C)、253 675 bp處的G→C(G253675C)、253 734 bp處的A→G(A253734G)和253 827 bp處的G→A(G253827A)。各位點均檢測出3種基因型，即：T253643C位點的TT、TC和CC基因型(圖2)；G253675C位點的GG、GC和CC基因型(圖3)；A253734G位點的AA、AG和GG基因型(圖4)；G253827A位點的GG、GA和AA基因型(圖5)。

圖2 PID1基因T253643C位點測序Fig.2 Sequenced of T253643C site in PID1 gene

圖3 PID1基因G253675C位點測序Fig.3 Sequenced of G253675C site in PID1 gene

圖4 PID1基因A253734G位點測序Fig.4 Sequenced of A253734G site in PID1 gene

圖5 PID1基因G253827A位點測序Fig.5 Sequenced of G253827A site in PID1 gene

2.2 各個位點的基因型與基因頻率

宣和豬PID1基因外顯子3的4個SNP位點的等位基因頻率及基因型頻率見表1。T253643C、G253675C、A253734G和G253827A位點分別以TT(0.4034)、GC(0.4790)、AG(0.4538)、AA(0.4454)基因型頻率最高，以CC(0.2101)、CC(0.1597)、AA(0.2605)、GG(0.1261)基因型頻率最低。從多態信息(PIC)和雜合度(H)和的數值看，4個位點遺傳多樣性較為豐富，都屬于中度多態且均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P<0.05)。

表1 宣和豬PID1基因各SNP位點的基因型及基因頻率

2.3 4個位點單倍型及其頻率

根據表2～3可知，宣和豬PID1基因上的4個SNP位點共有9種單倍型和24種單倍型組合，其中CGGA單倍型的頻率(0.366)最高，CCGA單倍型的頻率(0.008)最低；單倍型組合以CGGA/TCAA組合的頻率(0.168)最高，CGGA/CGGA的頻率(0.160)次之，7種單倍型組合CGGA/TGAA、CGGA/TCGA、CCGA/CCGA、CCAG/TGAG、CCAG/TCAA、TGAG/TCAG和TCGA/TCGA頻率(0.008)最低且均只檢出1個個體。

表2 單倍型及其頻率

表3 單倍型組合及其頻率

續表3 Continued table 3

2.4 PID1基因SNP位點與肉質性狀的關聯

2.4.1 各位點不同基因型的肉質性狀差異 宣和豬PID1基因4個SNP位點不同基因型的肉質性狀如表4所示。G253675C位點與大理石紋存在顯著關聯(P<0.05)，A253734G位點與失水率和IMF含量存在顯著關聯(P<0.05)，G253827A位點與失水率存在顯著關聯(P<0.05)。其中，T253643C位點的TC基因型個體除熟肉率低以外，其他5個性狀均表現最佳，但與其它基因型都無顯著性差異(P>0.05)；G253675C位點GC基因型個體的大理石紋、失水率、熟肉率以及滴水損失均表現最佳，其大理石紋與CC基因型個體間存在顯著差異(P<0.05)，較CC基因型個體顯著高0.43分；A253734G位點AG基因型個體的大理石紋和失水率表現最佳，其失水率與GG基因型個體間存在顯著差異(P<0.05)，較GG基因型低3.83%，GG和AA基因型個體的IMF含量存在顯著差異(P<0.05)，GG基因型較AA基因型高0.45%，AA基因型個體的肉色、熟肉率和滴水損失均表現最佳，但與其它基因型無顯著差異；G253827A位點GG基因型個體的大理石紋、失水率和熟肉率均表現最佳，其失水率和AA基因型存在顯著差異(P<0.05)，較AA基因型低3.68%。

表4 宣和豬PID1基因SNP位點各基因型的肉質性狀

2.4.2 4位點不同單倍型組合的肉質性狀差異 由5表可知，在大理石紋、失水率、熟肉率和IMF含量這4個性狀中，最優組合均含有CGGA單倍型，而性狀最差的組合均含有TCAA單倍型。其中CGGA/CCAG組合的大理石紋評分(3.00分)最高，較最低組合TCAA/TCAA(2.30分)高0.7分；CGGA/TGAG組合的失水率(9.91%)最低，較最高組合TCAA/TCAA(17.51%)低7.6%；CGGA/TCAG組合的熟肉率(66.05%)最高，較最低組合TCAA/TCAA(63.07%)高2.98%；CGGA/TGGG組合的IMF含量最高(3.56%)，較最低組合TCAA/TCAA(2.26%)高1.3%；TGAG/TCAA組合的滴水損失(1.91%)最低，較最高組合TCAA/TCAG(3.77%)低1.86%。其中CGGA/TGAG、CGGA/TCAA和TG AG/TCAA組合的滴水損失較TCAA/TCAG組合顯著低(P<0.05)；TCAA/TCAA組合的大理石紋評分、熟肉率和IMF含量均為最低，而失水率則為最高，因此，該組合具有明顯降低肉質性狀的效應。

表5 宣和豬PID1基因SNPs位點各單倍型組合的肉質性狀

3 討 論

3.1 宣和豬PID1基因多態性

本試驗在宣和豬PID1基因的外顯子3區域檢測到4個SNP變異位點，分別是T253643C、G253675C、A253734G和G253827A，且均為中度多態(PIC為0.3482～0.3748)，雜合度在0.4490～0.4997，遺傳多樣性豐富。前人關于豬PID1基因的研究主要集中在CDS區的第267位點上的C→T突變，在萊蕪豬和魯萊黑豬中均表現為中度多態(0.25

3.2 宣和豬PID1基因SNP位點對肉質性狀的影響

不同位點各基因型的關聯分析結果表明，除T253643C位點外，G253675C、A253734G和G2538 27A位點對宣和豬的肉質性狀存在一定的影響。其中，G253675C位點對宣和豬的大理石紋評分有影響，以GC型個體的評分最高，表現出肉質優勢；A253734G位點對宣和豬失水率和IMF含量有影響，以AG基因型的失水率最低，以GG基因型的IMF的含量最高；G253827A位點對宣和豬的失水率有影響，GG型個體的失水率最低，說明其肉質更為理想。進一步對上述4個位點不同單倍型組合分析結果顯示，10種單倍型組合對宣和豬的滴水損失和IMF含量具有一定影響，CGGA/CCAG組合的大理石紋評分最高(3.00±0.35)，CGGA/TGAG組合的失水率(9.91±2.68)最低，CGGA/TCAG組合的熟肉率最高(66.05±1.09)，TGAG/TCAA組合的滴水損失(1.91±0.53)最低，CGGA/TGGG組合的IMF含量(3.56±0.32)最高，表明攜帶有CGGA單倍型個體的整體肉質水平較高。

3.3 宣和豬PID1基因未來研究展望

IMF含量是重要的肉質性狀之一，尤其對肉的風味及嫩度等有顯著的協同效應，其受多基因控制，主效基因和微效基因之間通過形成復雜的網絡和信號傳導通路來影響肉的品質。但目前，主效基因仍未確定，研究多集中于與肌內脂肪沉積有關的候選基因來揭示其對肉質的影響，PID1基因就是其中之一。錢源等[14]研究結果顯示，PID1基因在不同豬品種的肝臟中mRNA的表達量與IMF含量呈顯著正相關。研究表明，肝臟不僅是機體脂肪代謝的重要器官，還是改造脂肪的主要器官，能調整外源性脂肪酸的碳鏈長短及飽和度，影響肌內脂肪酸的組成，進而影響豬肉的風味[20]。本研究中宣和豬的IMF含量(2.26～3.56)比較理想，但個體間無顯著差異。徐正剛[18]的研究發現PID1基因對豬的肌內脂肪沉積性狀有一定的影響，但檢測到的突變位點與本研究不同，推測這可能是由于豬種不同所致。

目前，關于豬PID1基因的研究報道仍較少，主要集中在基因的克隆、組織表達規律以及其與肌內沉積性狀關聯分析方面，PID1基因能否作為豬肉質性狀相關候選基因以及其影響機制還有待更進一步的研究分析。如果可以對PID1基因其他區域的SNP位點進行測定分析，并在不同的豬種中進行研究確認，將更有利于深入揭示PID1基因對豬肉質性狀的真實效應，對表明PID1基因在育種實踐中應用的可行性具有非常重要的意義。

4 結 論

本研究根據PCR產物直接測序法對119頭宣和豬PID1基因外顯子3的SNP位點進行了檢測，共檢測到4個SNP位點，結合肉質性狀數據進行關聯分析，發現G253675C位點與大理石紋評分存在顯著關聯、A253734G位點與失水率和IMF含量存在顯著關聯、G253827A位點與失水率存在顯著關聯(P<0.05)，攜帶有CGGA單倍型個體的整體肉質較好，而帶有TCAA單倍型個體的肉質則較差，結果顯示PID1基因對宣和豬肉質性狀有一定的影響。