sRNA STnc290對(duì)鼠傷寒沙門菌侵染細(xì)胞及致病力的影響

寧程程，李 娜，郭 蘊(yùn)，季春輝，王立霞，李志遠(yuǎn)，喬 軍，孟慶玲，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2. 中國(guó)獸藥監(jiān)察所，北京 100081)

【研究意義】鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium，STM)是一種革蘭氏陰性人獸共患病原菌，STM感染人后可引起人類腸炎和敗血癥[1]，感染家畜后可導(dǎo)致家畜急性胃腸炎以及懷孕母畜流產(chǎn)，同時(shí)可引起家禽、犬、貓及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等發(fā)生副傷寒，表現(xiàn)為胃腸炎或者敗血癥[2-3]。STM主要的感染途徑是消化道，進(jìn)入體內(nèi)后可通過(guò)其致病島表達(dá)多種毒力因子，在宿主胞內(nèi)寄生和繁殖[4]，不僅給畜牧業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)人類的公共衛(wèi)生帶來(lái)嚴(yán)重的威脅。【前人研究進(jìn)展】細(xì)菌小RNA(small RNA，sRNA)是一類長(zhǎng)度在40～500 nt[5]，能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控mRNA的非編碼RNA(no-coding RNA，ncRNA)[6]。sRNAs的合成受到多種因素的調(diào)控，通常與特定的環(huán)境脅迫或應(yīng)激條件的誘導(dǎo)有關(guān)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)sRNAs可通過(guò)與mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)發(fā)揮其生物學(xué)功能，參與細(xì)菌的代謝、環(huán)境應(yīng)激、生物被膜形成及毒力等的調(diào)控[9]。【本研究切入點(diǎn)】至今，在STM中已經(jīng)鑒定出280個(gè)sRNA分子，但大部分sRNA對(duì)毒力是否有調(diào)控作用尚不清楚[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在STM侵染小鼠巨噬細(xì)胞的條件下，sRNASTnc290基因的表達(dá)量顯著上調(diào)[10]，但對(duì)STnc290的生物學(xué)功能至今尚未深入研究。因此，本研究通過(guò)分析STnc290基因的分子特征，利用λ-Red同源重組構(gòu)建STnc290基因缺失株及回補(bǔ)株，通過(guò)細(xì)胞侵染及小鼠致病性試驗(yàn)檢測(cè)STnc290基因?qū)TM的影響。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究為深入揭示STnc290基因調(diào)控STM的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑

鼠傷寒沙門菌(STM)野毒株SL1344，λ-Red同源重組相關(guān)質(zhì)粒pKD46、pKD3、pCP20、pBR322及小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

pMD19-T 載體、限制性內(nèi)切酶BamH I和HindIII，購(gòu)自TaKaRa公司；TaqDNA 聚合酶、dNTPs、T4DNA Ligase、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司； DNA Marker 購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；DNA 膠回收試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒均購(gòu)自天根公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中公布的鼠傷寒沙門菌SL1344株的全基因組序列(GenBank登錄號(hào)：FQ312003.1)，利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)包含STnc290基因擴(kuò)增引物P1/2、缺失引物P3/4、回補(bǔ)株構(gòu)建引物P5/6、鑒定引物P7/8，P9/10為pqaA基因擴(kuò)增引物，P11/12為narX基因擴(kuò)增引物。上述引物由北京睿博興生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

1.3 sRNA STnc290基因的擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析

提取STM-SL1344菌株基因組，以P1/2為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增STnc290基因。PCR產(chǎn)物膠回收產(chǎn)物連接pMD19-T，轉(zhuǎn)化至DH5α，菌液PCR驗(yàn)證，篩選陽(yáng)性單克隆，送至北京睿博興生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用softberry軟件(http://www.softberry.com/berry.phtmlΔtopic=bprom&group=programs & subgroup=gfindb)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子；利用RNAstructure(http://rna.urmc.rochester.edu)對(duì)sRNASTnc290二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用TargetRNA2(http://cs.wellesley.edu/～btjaden/TargetRNA2)預(yù)測(cè)sRNASTnc290作用的潛在靶基因。

1.4 STM-STnc290基因缺失和回補(bǔ)株的構(gòu)建及鑒定

缺失株構(gòu)建參考王志林等[11]的方法，以pKD3質(zhì)粒為模板，用P3/4引物擴(kuò)增STnc290基因同源左右臂序列。將擴(kuò)增片段膠回收，電轉(zhuǎn)化至SL1344/pKD46感受態(tài)細(xì)胞中，用引物P1/2鑒定重組子并測(cè)序，重組菌命名為ΔSTnc290：：cat。制備ΔSTnc290：：cat感受態(tài)細(xì)胞，將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，用引物P1/2對(duì)重組子進(jìn)行PCR并測(cè)序，篩選得到缺失株ΔSTnc290。以STM-SL1344基因組為模板，以P5/6為引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收，連接pMD19-T，測(cè)序驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確片段與pBR322質(zhì)粒，分別進(jìn)行BamH I和HindIII酶切，T4連接酶過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，菌液PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證成功重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入ΔSTnc290感受態(tài)細(xì)胞中，獲得互補(bǔ)株ΔSTnc290/STnc290。

1.5 STnc290基因缺失對(duì)STM生長(zhǎng)特性的影響

挑取STM-SL1344、STM-ΔSTnc290、ΔSTnc290/STnc290單菌落于1.5 mL EP管中，37 ℃ 200 r/min恒溫?fù)u床過(guò)夜。次日調(diào)整菌液OD600nm值為0.2轉(zhuǎn)接至50 mL LB中，每隔2 h分別吸取200 μL菌液測(cè)定OD600nm值，連續(xù)測(cè)定16 h，重復(fù)3次，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 STnc290基因缺失對(duì)STM黏附和侵襲細(xì)胞能力的影響

侵染細(xì)胞試驗(yàn)參照信素華[12]的方法，STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株分別以細(xì)菌細(xì)胞感染復(fù)數(shù)比10∶1，侵染2×105小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，37 ℃恒溫培養(yǎng)1 h后取出，PBS清洗后，每孔0.2%TritonX-100，重懸細(xì)胞細(xì)菌混合物，離心6000 r/min，5 min，棄上清，PBS重懸，倍比稀釋，涂布SS板計(jì)數(shù)。侵襲試驗(yàn)感染細(xì)胞同上，37 ℃作用1 h后，PBS清洗，加入100 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h后，裂解細(xì)胞，PBS重懸，相同倍比稀釋，涂板計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。細(xì)菌量=平板單菌落/mL×稀釋倍數(shù)；黏附率=細(xì)胞黏附細(xì)菌量/每孔加入的總細(xì)菌量×100%；侵襲率=細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌量/每孔加入的總細(xì)菌量×100%。

1.7 STnc290基因缺失對(duì)STM致病力的影響

將STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株，分別以2×102、2×103、2×104、2×105、2×106、2×107、2×108劑量，腹腔注射6周齡BALB/c小鼠，每個(gè)劑量注射6只小鼠。以PBS腹腔注射為陰性對(duì)照組，用改良寇氏法計(jì)算小鼠半數(shù)致死量(LD50)，并繪制小鼠生存曲線。野毒株、缺失株、回補(bǔ)株分別以2×104CFU/mL亞致死劑量感染6周齡BALB/c小鼠。分別在第1、3、5、7和9日取小鼠肝臟和脾臟，在PBS中勻漿研磨，倍比稀釋，涂板計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。

1.8 STnc290基因缺失對(duì)預(yù)測(cè)靶基因表達(dá)的影響

將STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，同黏附和侵襲試驗(yàn)條件相同，分別提取總RNA，以P9～P10和P11～P12為引物，利用qRT-PCR進(jìn)行靶基因pqaA和narX基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)。以16sRNA基因作為內(nèi)參對(duì)照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件(USA)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。采用方差分析對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。采用卡方檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05，差異顯著；當(dāng)P<0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 STM sRNA STnc290基因的分子特征分析

用引物P1/2擴(kuò)增STnc290片段測(cè)序長(zhǎng)度為398 bp，與預(yù)期大小相符(圖1-B)。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小為398 bp，其中STnc290為79 bp。在STnc290基因上游存在-10box和-35box啟動(dòng)子核心序列，還存在σ因子rpoD16結(jié)合位點(diǎn)(圖1-A)。STnc290基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)由3個(gè)莖環(huán)構(gòu)成，符合典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1-C)。通過(guò)TargetRNA2軟件預(yù)測(cè)出pqaA和narX基因2個(gè)潛在的靶基因(圖1-D)。

2.2 STM-STnc290基因缺失和回補(bǔ)株的構(gòu)建與鑒定

以P1/2引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為398 bp，以P3/4缺失引物擴(kuò)增左右同源臂產(chǎn)物大小為1159 bp(圖2-泳道2、3)，說(shuō)明STnc290基因已被含pKD3的左右同源臂片段替換。以鑒定引物P7/8進(jìn)行PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證STnc290片段大小為484 bp(圖2-泳道5)；ΔSTnc290：：cat片段大小為1464 bp，說(shuō)明同源重組成功，成功將STnc290基因替換(圖2-泳道6)；ΔSTnc290片段大小為543 bp，說(shuō)明已成功消除打靶片段，成功獲得缺失株(圖2-泳道7)；ΔSTnc290/STnc290片段大小為484 bp，說(shuō)明已成功獲得回補(bǔ)株(圖2-泳道8)，以上片段大小均與預(yù)測(cè)產(chǎn)物相符，測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果均正確。pBR322-STnc290雙酶切鑒定，得到4363和399 bp的酶切條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2-泳道9)，說(shuō)明已成功構(gòu)建回補(bǔ)株。

M1、M2、M3: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：陰性對(duì)照；2：引物P1/2擴(kuò)增STnc290基因片段；3：引物P3/4擴(kuò)增ΔSTnc290：：cat重組株片段；4：陰性對(duì)照；5：引物P7/8擴(kuò)增STnc290基因片段；6：引物P7/8擴(kuò)增 ΔSTnc290：：cat重組株片段；7：引物P7/8擴(kuò)增ΔSTnc290缺失株片段；8：引物P7/8擴(kuò)增ΔSTnc290/STnc290回補(bǔ)株片段；9：pBR322-STnc290雙酶切驗(yàn)證M1, M2, M3: DNA molecular quality standard; 1: Negative control; 2: Primer P1/2 amplifies STnc290 gene fragment; 3: Primer P3/4 amplifies ΔSTnc290::cat recombinant strain; 4: Negative control; 5: Primer P7/8 amplifies the STnc290 gene fragment; 6: Primer P7/8 amplifies the ΔSTnc290::cat recombinant strain fragment; 7: Primer P7/8 amplifies the ΔSTnc290 deletion strain fragment; 8: Primer P7/8 amplifies the fragment of the ΔSTnc290 deletion strain add ΔSTnc290/STnc290 complement strain fragment; 9: pBR322-STnc290 double digestion verification圖2 STnc290基因缺失和回補(bǔ)株的構(gòu)建與鑒定Fig.2 Construction and identification of STnc290 gene deletion and complementary strains

2.3 STnc290基因缺失對(duì)STM生長(zhǎng)特性影響

生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290在37 ℃的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD600nm均為0.20～0.75，各菌株的生長(zhǎng)差異不顯著(P>0.05)，表明STnc290基因缺失不影響STM的生長(zhǎng)特性(圖3)。

圖3 STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株37 ℃生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of STM-SL1344, STM-ΔSTnc290 and ΔSTnc290/STnc290 strains at 37 ℃

2.4 STnc290基因缺失對(duì)STM的黏附和侵襲細(xì)胞的影響

STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290的黏附率分別為59%、42.3%、51.6%，結(jié)果表明，STnc290基因缺失株黏附小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的能力顯著低于野毒株STM與回補(bǔ)株ΔSTnc290/STnc290(圖4-A)。STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290的侵襲率分別為47.3%、35%、42.3%，結(jié)果表明，STnc290基因缺失株侵襲小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的能力顯著低于STM(圖4-B)。推測(cè)sRNASTnc290基因在黏附、侵襲細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮了調(diào)控作用。

圖4 STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7黏附率和侵襲率Fig.4 Adhesion rate and invasion rate of STM-SL1344, STM-ΔSTnc290 and ΔSTnc290/STnc290 strains to mouse macrophages RAW264.7

2.5 STnc290基因缺失對(duì)STM致病力的影響

STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株感染小鼠LD50分別是4.2×104、1.3×105、6.2×104CFU/mL(圖5-A)，缺失株對(duì)小鼠毒力顯著低于親本株和回補(bǔ)株。小鼠生存曲線顯示，STnc290基因缺失株組小鼠出現(xiàn)死亡明顯延長(zhǎng)(圖5-B)。與STM-SL1344和ΔSTnc290/STnc290相比，STM-ΔSTnc290感染小鼠肝臟和脾臟載菌量在感染第7、9天顯著低于野毒株STM(圖5-C，5-D)。病理組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290組與PBS組比較，感染小鼠肝臟均出現(xiàn)局部肝細(xì)胞壞死，出現(xiàn)細(xì)胞核溶解，炎性細(xì)胞侵潤(rùn)；脾臟紅髓白髓界限不明顯，間質(zhì)出血，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。與STM-SL1344和ΔSTnc290/STnc290組相比，STM-ΔSTnc290組病理變化明顯減弱(圖6)。表明sRNASTnc290基因?qū)TM在宿主體內(nèi)增殖具有重要的調(diào)控作用。

A：STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株感染小鼠LD50；B：STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株感染小鼠生存曲線;C：STM-SL1344與STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株感染小鼠肝臟載菌量；D：STM-SL1344與STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株感染小鼠脾臟載菌量A: STM-SL1344, STM-ΔSTnc290 and ΔSTnc290/STnc290 strains infected LD50 mice; B: STM-SL1344, STM-ΔSTnc290 and ΔSTnc290/STnc290 strains infected mice survival curve;C: STM-SL1344 and STM-ΔSTnc290 and ΔSTnc290/STnc290 strains infected with the bacterial load in the liver of mice; D: STM-SL1344 and STM-ΔSTnc290 and ΔSTnc290/STnc290 strains infected the bacterial load in the spleen of mice圖5 STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株感染小鼠LD50、生存曲線及肝臟、脾臟載菌量Fig.5 LD50, survival curve and bacterial loading in liver and spleen bacterial load of STM-SL1344, STM-ΔSTnc290 and ΔSTnc290/STnc290 strains in infected mice

圖6 STMSL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株感染小鼠肝臟和脾臟病理組織觀察Fig.6 Histopothological observation of liver and spleen of STMSL1344, STM-ΔSTnc290 and ΔSTnc290/STnc290 strains in infected mice(liver and spleen, × 200; HE staining)

2.6 STnc290基因缺失對(duì)毒力相關(guān)基因表達(dá)的影響

預(yù)測(cè)靶基因轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果(圖7)顯示，STnc290基因缺失株中pqaA和narX基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低(P<0.05)，推測(cè)STnc290基因可正調(diào)控pqaA和narX基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控了STM毒力。

圖7 STM-SL1344、STM-ΔSTnc290和ΔSTnc290/STnc290菌株毒力相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.7 Transcription levels of virulence-related genes in STM-SL1344, STM-ΔSTnc290 and ΔSTnc290/STnc290 strains

3 討 論

STM作為一種重要的食源性胞內(nèi)寄生菌，可利用其表達(dá)的多種毒力因子感染多種宿主，并在宿主細(xì)胞中增殖。為了應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激環(huán)境[13]，STM可利用多種表達(dá)調(diào)控模式精準(zhǔn)調(diào)節(jié)毒力因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，來(lái)迅速應(yīng)對(duì)各種環(huán)境應(yīng)激脅迫[14]。作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的重要分子，sRNA可利用其部分堿基與mRNA互補(bǔ)配對(duì)參與了細(xì)菌生物被膜、密度感應(yīng)系統(tǒng)、III型分泌系統(tǒng)、抗生素耐受、毒力等多個(gè)生命過(guò)程的調(diào)控。目前，在STM中發(fā)現(xiàn)并鑒定了280個(gè)sRNA分子，然而sRNASTnc290的生物學(xué)功能至今尚未研究。

sRNA通常分為順式和反式編碼sRNA。sRNA通過(guò)部分堿基與mRNA互補(bǔ)配對(duì)來(lái)穩(wěn)定或降解mRNA，從而促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，sRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)暴露的堿基，能夠更容易與靶基因結(jié)合[18]。分子特征分析發(fā)現(xiàn)，sRNASTnc290基因?yàn)榉词骄幋a的sRNA，該基因轉(zhuǎn)錄本二級(jí)結(jié)構(gòu)含有由3個(gè)典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，推測(cè)STnc290基因通過(guò)莖環(huán)區(qū)域與靶基因部分堿基互補(bǔ)，從而對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控。

STM具有非常廣泛的宿主適應(yīng)性，可感染人和多種動(dòng)物，引起人和多種動(dòng)物的多種疾病[2]。在STM感染宿主細(xì)胞時(shí)，STM可利用多種毒力因子(鞭毛、脂多糖、粘附素和III型分泌系統(tǒng))來(lái)實(shí)施入侵和胞內(nèi)寄生等過(guò)程。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，STM毒力島(已發(fā)現(xiàn)17個(gè)毒力島)可編碼上百種毒力因子，然而這些毒力因子的表達(dá)又受到轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后等多水平的精細(xì)調(diào)控[19]。sRNA作為STM重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在STM毒力中發(fā)揮了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PinT是一種依賴PhoP的非編碼sRNA，sRNAPinT能夠同時(shí)激活SPI-1和SPI-2毒力基因，形成從入侵細(xì)胞到胞內(nèi)增殖的轉(zhuǎn)變。PinT在起始密碼子附近與SPI-1效應(yīng)器SopE和SopE2的mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)引起翻譯抑制。同時(shí)，PinT直接抑制RNA 編碼的蛋白質(zhì)CRP激活SPI-2，使STM能夠在胞內(nèi)增殖[20]。IsrM是STM毒力島編碼的非編碼小RNA，通過(guò)與mRNAHilE的核糖體位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控毒力因子的表達(dá)，對(duì)入侵上皮細(xì)胞、胞內(nèi)增殖和小鼠毒力等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[21]。Shabarinath等[10]研究STM侵染小鼠巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)sRNASTnc290基因在感染巨噬細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)，然而對(duì)sRNASTnc290基因的侵染細(xì)胞及其致病性至今尚未進(jìn)行研究。本研究證實(shí)，STnc290基因缺失株侵染細(xì)胞及小鼠致病性能力均顯著低于野毒株STM和回補(bǔ)株ΔSTnc290/STnc290，并且回補(bǔ)株生物特性明顯恢復(fù)，推測(cè)STnc290基因可能對(duì)STM毒力具有重要的影響。

目前，sRNA的研究主要通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合基因缺失株進(jìn)行表型試驗(yàn)，驗(yàn)證sRNA對(duì)靶基因mRNA的調(diào)控作用[22]。通過(guò)TargetRNA2軟件預(yù)測(cè)STnc290的靶基因，發(fā)現(xiàn)2個(gè)潛在的靶基因，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示STnc290基因能夠與編碼PhoP/PhoQ激活蛋白的pqaA基因上游-49～-34區(qū)域堿基互補(bǔ)配對(duì)，以及編碼硝酸鹽、亞硝酸鹽傳感器蛋白的narX基因上游-58～-43區(qū)域堿基互補(bǔ)配對(duì)，推測(cè)STnc290基因可能參與STM胞內(nèi)厭氧環(huán)境下調(diào)控硝酸鹽、亞硝酸鹽傳感器蛋白 NarX代謝分解硝酸鹽、亞硝酸鹽合成氮源[23-25]，以及PhoP/PhoQ系統(tǒng)參與的巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖調(diào)控[26]，因此STnc290基因的缺失降低了STM的毒力。同時(shí)，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，STnc290基因缺失株毒力相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了STnc290基因?qū)TM毒力發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)構(gòu)建STnc290基因缺失株，證實(shí)STM-ΔSTnc290對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)的黏附、侵襲能力及小鼠致病性均低于STM-SL1344。同時(shí)，sRNASTnc290基因的潛在靶基因pqaA和narX基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量均降低，推測(cè)sRNASTnc290在毒力及侵入細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，為進(jìn)一步揭示STnc290對(duì)STM毒力調(diào)控的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。