蟬棒束孢交配型基因MAT的群體分布特征

滿海喬，王 嬌，唐光甫，桂艷玲，韓 潔，趙杰宏

(貴州中醫藥大學 藥學院，貴州省中藥生藥學重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】 蟬花(Cordycepscicadae)為我國傳統名貴中藥材，是由蟲生真菌蟬棒束孢〔IsariacicadaeMiquel；同物異名：蟬擬青霉Paecilomycescicadae(Miquel) Samson〕寄生蟬若蟲后形成的菌蟲復合體[1]。早在南北朝的《雷公炮炙論》中已有記載，歷代醫藥典籍對蟬花有大量描述，其具疏散風熱、透疹、明目退翳的功效[2]。近代研究表明，蟬花有改善腎功能、抗腫瘤、降血糖等藥理作用[3-4]，臨床上有望成為冬蟲夏草的替代藥。蟬花主要生長環境為竹林以及熱帶和亞熱帶的闊葉林等，遍布在中國秦嶺至淮河以南的省份[5-6]，因為其味道鮮美，營養豐富，民間有長期食用的習慣，已成為藥食兩用的重要蟲草資源。蟲草往往有無性型和有性型兩種形態，自然界常見的是有性型，如蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)和冬蟲夏草(C.sinensis)，但蟬花卻主要是無性型(即蟬棒束孢)，其有性型極其稀缺，也無法通過人工培養獲得，導致蟬花有性型的藥材基原混亂，至今也未知蟬花有性型稀缺的原因。因此，解析蟬花有性生殖的遺傳調控機制對其深入研發具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，劉愛英等[7]從廣西樂業天坑采集1株有性型和無性型共存的復型蟬花標本，并將其命名為神木蟬蟲草(C.cicadae-SM sp.Nov.Liu Ai-Ying&Zou Xiao)；李增智等[8]從江西井岡山采挖到蟬花有性型標本，命名為C.chanhuaZ.Z.Li,F.G.Luan,Hywel-Jones,C.R.Li &S.L.Zhang,sp.nov.，并指出與劉愛英等[7]報道的標本在顯微結構上存在區別，因此蟬花有性型仍存在爭議。有性生殖能去除真菌有害基因突變，還可以產生基因型多樣性，增強環境適應性[9-10]。蟲草屬真菌的有性生殖主要由交配型基因MAT參與調控。MAT基因及其編碼蛋白具有調控生殖器官分化、營養繁殖和子囊殼形成等作用[11-12]。根據MAT基因在單倍體細胞中的分布情況，有性生殖可分為同宗配合和異宗配合[13-14]。同宗配合是同時含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因[15]，1株即可完成有性生殖；而異宗配合含有不同交配型基因，需不同交配型的菌株共同完成有性生殖[16-18]。MAT1-1含MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-1-3交配型基因，其中，MAT1-1-1研究較多，編碼含HMG α-box保守域的轉錄因子[19-20]；MAT1-2僅含交配型基因MAT1-2-1，編碼含HMG box保守域的轉錄因子[21-22]。【研究切入點】蟬花有性型稀缺，其是否與蟬棒束孢交配型基因MAT的序列結構、基因變異及基因分布特征有關，尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過研究7省12市100份蟬花標本中蟲生真菌蟬棒束孢的MAT基因，初步揭示蟬棒束孢MAT基因的分布特征和多樣性，為提高蟬花的生殖率提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

新鮮蟬花標本共100個，采自全國7省12市(表1)。用酒精棉球擦拭蟲體表面，無菌鑷子輕輕將其掰開，接種針挑取少許內菌核，接種于常規沙氏固體培養基上，培養7 d和14 d時觀察記錄各菌株的菌落形態及微觀結構。

表1 蟬花標本的來源Table 1 Source of Cordyceps cicadae samples

1.2 ITS和MAT序列擴增

用基因組提取試劑盒(購自北京天根生化)提取各菌株的基因組DNA，采用引物ITS1/4、1MAT1-1F/R、2MAT1-1F/R、gaoMAT1-1F/R和gaoMAT1-2F/R(表2)分別擴增目標序列，反應體系：上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Taq PCR Mix 10 μL，模板2 μL，最后用ddH2O補足20 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物送華大基因測序。

表2 ITS和MAT序列的擴增引物Table 2 Amplification primers of ITS and MAT sequences

1.3 聚類分析

獲得的ITS或MAT序列在NCBI進行 Blastn(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)比對，選取覆蓋率和相似性最高的菌種作為分子鑒定結果。在MEGA 7中，將獲得的不同ITS序列進行Align對齊，截去兩端不齊序列后，選擇Phylogenetic Analysis，點擊Phylogeny，選擇Construct/Test Neighbor-Joining Tree，更改No.of Bootstrap Replications為1 000，其余參數為默認值點擊Compute，最后查看和下載聚類樹。

2 結果與分析

2.1 不同蟬花的形態多樣性

不同來源的蟬花標本均在蟲體上具有典型的無性型孢梗束結構，但未發現有性型子座。不同產地蟬花的孢梗束長短、色澤和產孢量差異較大，其中，福建產蟬花的孢梗束較細長；廣州的較短，產孢量也較??；安徽宣城、安徽霍山、安徽新華、廣州和平蟬花的孢梗束金黃色，福建德化的淡黃色，四川雅安的棕色。蟬花菌種在沙氏培養基上的菌落呈多層輪狀。顯微鏡下各菌株產孢結構的瓶?；颗虼?，頂端驟尖，孢子為長橢圓形，串生，孢子大小(5.0～7.5) μm ×(2.5～5.0) μm，產孢結構無明顯差異，具有典型的蟬棒束孢顯微特征(圖1)。

2.2 ITS序列聚類

對從蟬花分離的100份菌株進行ITS序列擴增和測序，經NCBI blastn比對，100份

注：A為廣州和平3，B為福建德化1，C為四川天主4，D為安徽霍山5，E為安徽宣城3，F為安徽宣城9，G為安徽新華2；測微尺為2.5 μm/小格。

菌株與NCBI上蟬花C.cicadae(GenBank：MN128643.1)的序列相似性最高。隨機選擇從不同產地蟬花分離的13份菌株與NCBI上蟬擬青霉P.cicadae(GenBank：HQ874633.1)、環鏈棒束孢I.cateniannulata(GenBank：KT944289.1)、玫煙色棒束孢I.fumosorosea(GenBank：KR184828.1)、斜鏈棒束孢I.cateniobliqua(GenBank：KP743151.1)、爪哇棒束孢I.javanica(GenBank：MF416455.1)、日本棒束孢I.japonica(GenBank：AT001673.1)以及蟬花C.cicadae(MF460361.2，KY924492.1，MZ373136.1，MN128643.1)的ITS序列聚類分析，以產黃青霉Penicilliumchrysogenum(GenBank：U57323.1)為外群，由MEGA 7構建系統發育樹(圖2)顯示，13份菌株與蟬擬青霉和蟬花聚為一類，支持率為100%，與其他棒束孢屬菌種的親緣關系較遠，進一步證明該試驗的菌株是從蟬花分離的蟬棒束孢。

注：?為研究分離菌株。Note:? indicates studied isolated plant.圖2 部分不同來源蟬棒束孢ITS序列進化樹Fig.2 ITS sequence cladogram of different I. cicadae strains from different sources

2.3 MAT序列的克隆

用引物分別克隆各菌株的1MAT1-1-1、2MAT1-1-1、gaoMAT1-1-1和gaoMAT1-2-1靶標序列，獲得的片段分別是1 150 bp、1 850 bp、480 bp和362 bp(圖3)，符合預期大小。測序表明，1MAT1-1-1有HMG α-box功能域，2MAT1-1-1缺失HMG α-box，gaoMAT1-1-1為1MAT1-1-1的部分序列，gaoMAT1-2-1具有HMG box。以FJDH7和AHLJ1菌株為例，1MAT1-1-1、2MAT1-1-1分別與NCBI上蟬花MAT1-1-1(GenBank：KP749925.1)的堿基序列相似性為99.80%(覆蓋率100%)和99.81%(覆蓋率48%)，氨基酸序列相似性為100%和42.02%；gaoMAT1-2-1與NCBI上蟬花MAT1-2-1(GenBank：KP749926.1)的堿基序列相似性為99.73%(覆蓋率99%)，氨基酸序列相似性為90.18%。可見，1MAT1-1-1和gaoMAT1-2-1指向的基因具有功能，2MAT1-1-1的基因可能序列和功能不全。

2.4 MAT序列的分布

PCR檢測結果顯示，100個菌株中13個菌株僅有1MAT1-1-1，79個菌株僅有gaoMAT1-2-1，其中，兼有1MAT1-1-1和gaoMAT1-2-1交配型基因的菌株有8個(表3)，兼有菌株分布在安徽新華、安徽宣城、江西湖口、四川天主和福建德化。2MAT1-1-1與gaoMAT1-2-1同時存在，有1MAT1-1-1(包括兼有gaoMAT1-2-1)的菌株未檢測到2MAT1-1-1，但福建產FJDH7和FJDH9菌株同時存在1MAT1-1-1、2MAT1-1-1和gaoMAT1-2-1序列(圖3D)。多數地區的菌株以gaoMAT1-2-1占優勢，而四川天主和廣西樂業菌株以1MAT1-1-1占優勢。安徽廬江、安徽霍山、江蘇宜興和廣州和平的菌株未檢測到1MAT1-1-1。從數據上看，蟬花有同宗配合的潛力，也存在異宗配合的可能，有性生殖的概率較高，但與蟬花有性型稀缺的實際情況不符。

Note:A,gaoMAT1-2-1;B,gaoMAT1-1-1(1～6：GZHP2，AHWH7，AHCZ2，AHXC5，AHXC6 and AHXC7);C,1MAT1-1-1(7～13：AHXC7，AHXC8，AHXC9，AHXH2，AHWH3，AHWH6 and AHCZ4)；D,2MAT1-1-1(14～35：AHWH8，JSYX3，JXHK3，JXHK4，JXHK8，JXHK9，SCTZ2，SCTZ6，AHLJ1，AHLJ2，AHXC3，AHXC9，AHXC11，AHXH1，AHXH2，AHCZ1，GZHP1，AHHS12，AHHS13，FJDH6，GXTK1 and ddH2O)；E：1MAT1-1-1/2MAT1-1-1(36～37：FJDH7 and FJDH9).M1:DL1 000 DNA marker.M2:DL2 000 DNA marker.圖3 部分菌株MAT基因的電泳圖譜Fig.3 Electrophoretogram of MAT gene of part strains

表3 不同蟬棒束孢MAT序列存在類型Table 3 Types of MAT sequence in different I.cicadae strains

2.5 MAT序列聚類和結構特性

對21個菌株的1MAT1-1-1序列、87個菌株的gaoMAT1-2-1序列分別進行聚類分析(圖4)，21個1MAT1-1-1與蟬花已知序列(GenBank：KP749925.1)聚為一枝，支持率99%；87個gaoMAT1-2-1與蟬花已知序列(GenBank：KP749926.1)聚為一枝，支持率98%。安徽來源的多株蟬棒束孢未單獨聚類成群，可見相同來源蟬棒束孢菌株間無明顯地域居群分布相關性，與參比菌種的親緣關系較遠，其中親緣關系較近的參考菌種是細腳棒束孢(Isariatenuipes)。

序列比對結果(圖4C)顯示，1MAT1-1-1為蟬花MAT1-1-1(KP749925.1)的一部分外顯子序列，2MAT1-1-1為NCBI 上現有3個獨立蟬花基因組(GenBank：ASM296887v1、ASM1021170v1和ASM164478v1)的部分基因序列，在3個蟬花基因組僅有2MAT1-1-1和gaoMAT1-2-1序列，未發現1MAT1-1-1。2MAT1-1-1與1MAT1-1-1僅有30%序列覆蓋(覆蓋區域相似性99.69%)，推測缺失HMG ɑ-box的2MAT1-1-1無功能。

注：A為MAT1-1-1序列聚類分析，B為gaoMAT1-2-1序列聚類分析，C為MAT 1-1-1序列結構示意圖；方框為外顯子，橫線為內含子或居間序列。Note:A:Cluster analysis of MAT1-1-1;B:Cluster analysis of gaoMAT1-2-1;C:Structure diagram of MAT1-1-1;Box:Exon;Horizontal line:Intron or intermediate sequence.圖4 蟬棒束孢MAT序列進化樹和MAT1-1-1序列結構Fig.4 MAT sequence cladogram of I. cicadae.and MAT1-1-1 sequence structure

3 討論

蟬花在食品和臨床等領域有較廣泛的應用，但至今其有性型仍存爭議[7-8]，現有中醫藥典籍《中藥大辭典》和《中華本草》等著作中記載的蟬花有性型更是被上述報道推翻。出現以上現狀的主要原因是蟬花有性型非常稀缺，難以采集也無法人工培養，至今對蟬花的有性生殖知之甚少。

圍繞蟬花的交配型基因研究，高揚等[18]將采自安徽各地的40株蟬棒束孢分成了2組，分別含有交配型MAT1-1-1和MAT1-2-1序列，比例接近1∶2，且未發現同時含有2種交配型基因或缺少2種基因的菌株。本研究的靶標序列1MAT1-1-1是根據高揚等[18]發表的蟬花MAT1-1-1序列(GenBank：KP749925.1)設計引物擴增的部分序列(163～1 334 bp)，靶標序列2MAT1-1-1是利用MAT1-1-1在NCBI 與蟬花基因組blastn〔database：whole-genome shotgun contigs(wgs)；organism：cordyceps cicadae〕，根據獲得的最高相似序列及其上下游序列(GenBank：WJIA01000209)設計引物進行擴增分析。

通過檢測安徽省6地市59個蟬花標本分離的蟬棒束孢菌株發現，AHXH2、AHXC3和AHXC9同時含有MAT1-1-1(即1MAT1-1-1)和MAT1-2-1(即gaoMAT1-2-1)序列；來自其他6省市的41個蟬花標本分離的菌株中檢測到5個菌株同時含有以上2個交配型基因序列，檢出率為8%；其他菌株僅含其中1個交配型基因，也未發現完全缺失的菌株。全部1MAT1-1-1與gaoMAT1-2-1的比例為24.14%(接近1∶4)，兼有菌株、單1MAT1-1-1菌株、單gaoMAT1-2-1菌株的比例為1∶1.625∶9.875(接近1∶1.5∶10)，可見不同交配型分布的比例不對等，對稀少的蟲草來說，其有性生殖變得更加困難。

LU等[23]對蟬花BA-001菌株的基因組(GenBank:AEIW00000000)分析發現，蟬棒束孢MAT1-2和1個缺少HMG ɑ-box截短的MAT1-1-1同時存在，在各時期轉錄組中該截短基因不表達，并且通過單基因或雙基因敲除MAT1-2和MAT1-1-1對無性型孢梗束的形成無影響。另外，這種截短現象也發生在植物病原Grosmanniaspp.[24]、甲蟲相關真菌Leptographiumprocerum和L.profanum[25]中。本研究從100份蟬棒束孢I.cicadae菌株中也檢測到此段截短的MAT1-1-1(即2MAT1-1-1)，發現有1MAT1-1-1(包括兼有gaoMAT1-2-1)的菌株卻無2MAT1-1-1，2MAT1-1-1常與gaoMAT1-2-1共存，這與上述報道以及NCBI 上現有3個獨立的蟬花基因組(GenBank：ASM296887v1、ASM1021170v1和ASM164478v1)序列一致，但福建產FJDH7和FJDH9菌株含有1MAT1-1-1、2MAT1-1-1和gaoMAT1-2-1序列，暗示蟬花交配型基因在進化過程中有著復雜的表現形態，似乎蟬棒束孢同時存在同宗配合和異宗配合的潛力，處于特殊的進化階段。對于同宗配合和異宗配合的進化，早期認為兩者為共同起源，即MAT基因為染色體上同一DNA保守區，該區發生突變，導致不同交配方式產生，后又有研究支持子囊菌中的異宗配合起源于同宗配合[26-27]。因此，蟬花可能成為研究交配型基因進化的重要樣本。

通過聚類分析未發現MAT基因的地域分布相關性特征，這可能與各菌株間缺乏基因交流，主要采用無性生殖有關。推測蟬花為了充分適應生存環境，可能通過某種未知的機理，抑制或中斷了有性生殖途徑，逐漸將無性生殖方式保留。

4 結論

從7省12市100份蟬花標本中分離出蟬棒束孢菌株，對各菌株的MAT基因分析發現，有的菌株僅有1MAT1-1-1或MAT1-2-1，兼有菌株占8%。此外還發現，截短的MAT1-1-1(即2MAT1-1-1)普遍不與1MAT1-1-1共存，常與MAT1-2-1伴存，但FJDH7和FJDH9菌株卻同時存在1MAT1-1-1、2MAT1-1-1和MAT1-2-1序列，可見群體中不同蟬棒束孢菌株的MAT基因有4種可能：單1MAT1-1-1、兼有MAT1-2-1和1MAT1-1-1、兼有MAT1-2-1和2MAT1-1-1、共有1MAT1-1-1/MAT1-2-1/2MAT1-1-1序列，給蟬花有性生殖帶來不確定性。推測蟬花有性型稀缺與MAT基因的分布模式多樣及比例失衡有密切關系。