草魚粉中4種磺胺類藥物殘留基體標準物質的研制

王新新，封騰望，王慧姣，李晉成，孫慧武，劉 歡

(1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院，農業農村部水產品質量安全控制重點實驗室，北京100141)

磺胺類藥物(sulfonamides，SAs)是一類以對位氨基苯磺酰胺為基本結構的衍生物，磺酰胺基上的氫，可被不同雜環取代，形成不同種類的磺胺類藥物。磺胺類藥物因具有抗菌譜廣、化學性質穩定、低毒性等優點被廣泛應用于水產養殖業，主要用于預防和治療細菌感染性疾病。我國發布《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中規定磺胺類藥物最大殘留限量總量為100 μg/kg。不按規定使用、不遵守養殖使用休藥期規定則會導致其在水產品中殘留，進而影響人類健康。根據農業農村部、國家市場監管總局等發布的關于水產品監督抽檢情況的通告，水產品中磺胺類藥物殘留共檢出19批次殘留超標樣品，其中，磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole，SMZ)、磺胺二甲異噁唑(Sulfaisoxazole，SFZ)、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine，SM)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine，SM)是超標的主要參數。

基體標準物質(matrix reference material，MRM)是具備實際樣品特性的標準物質，目標物與基體相結合，并且與待測樣品具有相同的特性，在分析過程中可有效避免基質效應對目標物造成的干擾。水產品因基質復雜，在藥物殘留檢測分析中基質效應對檢測結果的準確性影響較大。因此，如在檢測分析中，使用基體標準物質進行校準及質量控制，將可以有效提高檢測的準確度。歐盟明確要求對動物源食品進行獸藥殘留檢測必須采用基體標準物質進行校準及過程質量控制。

目前，我國以水產品為基質的磺胺類藥物殘留分析所用基體標準物質研究成果有限。顏顯輝等曾研制了鯉()肌肉中SMZ殘留凍干粉標準樣品，尹太坤等以鰻鱺()肌肉為基質研制了包含兩種磺胺類藥物殘留的基體標準物質，但尚未有報道以草魚()為基質研制的包含SMZ、SFZ、SM、SM4種磺胺類藥物殘留的基體標準物質。本研究以草魚為基質，研究建立了草魚粉中SMZ、SFZ、SM、SM藥物殘留基體標準物質制備方法，以期為水產品基質中磺胺類藥物殘留基體標準物質的制備提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活草魚購自北京市房山區琉璃河鎮趙德旺養魚場(約1 kg/尾)，于北京市房山區中國水產科學研究院鱘魚繁育技術與工程中心養殖池中暫養備用。

SMZ(Sulfamethoxazole，CAS：723-46-6，純度≥99.8%)、SFZ(Sulfaisoxazole，CAS：127-69-5，純度≥99.74%)、SM(sulfamethazine，CAS：57-68-1，純度≥99.8%)、SM(sulfamerazine，CAS：127-79-7，純度≥99.72%)標準物質均購于德國Dr.Ehrenstorfer 公司；磺胺鄰二甲氧嘧啶(sulfadoxine，CAS：2447-57-6，純度≥99.8%)、磺胺間二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine，CAS：122-11-2，純度≥99.8%)均購于德國Witega公司；SMZ原料藥(上海阿達瑪斯試劑有限公司，純度>98%)、SFZ原料藥[梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，純度>98%]、SM原料藥(上海阿達瑪斯試劑有限公司，純度>99%)、SM原料藥[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，純度>98%]；乙腈、甲醇、正己烷(色譜純，美國J.T.Baker公司)；乙酸銨、甲酸(質譜級，美國Fisher公司)；無水硫酸鎂(上海麥克林生化科技有限公司)。

1.2 儀器與設備

QTRAP?5500超高效液相色譜-三重四級桿/復合線性離子阱質譜儀(美國SCIEX公司)；MVM-2500多管渦流混合器(上海泰坦科技股份有限公司)；MS3 Basic基本型旋渦混勻器(德國IKA公司)；SB-5200DTN超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；PL2002電子天平[Mettler Toledo儀器(上海)有限公司]；H-2050R臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；Buchi R210旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司)；冷凍干燥機(德國 ZIRBUS公司)；藥浴池為圓形，規格為直徑150 cm，水深25.5 cm。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配置

(1)標準溶液配制：分別準確稱取10.02 mg SMZ、10.03 mg SFZ、10.02 mg SM、10.03 mg SM、10.02 mg磺胺鄰二甲氧嘧啶及10.02 mg磺胺間二甲氧嘧啶標準品，用甲醇配制成1.0 mg/mL標準儲備液；分別移取適量標準儲備液置于棕色容量瓶中，用甲醇逐級稀釋成濃度為100.0 μg/mL、10.0 μg/mL的SMZ、SFZ、SM、SM外標混合標準中間液和磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶內標混合標準中間液；以甲醇為溶劑，移取適量混合標準中間液，配制成1.0 μg/mL、100.0 ng/mL SMZ、SFZ、SM、SM外標混合標準工作液和1.0 μg/mL磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶內標混合標準工作液，-20 ℃保存。

(2)藥浴液配制：準確稱取0.700 g SMZ于100 mL容量瓶，用乙腈配制成7.0 mg/mL藥浴液；準確稱取0.750 g SFZ于250 mL容量瓶，用乙腈配制成3.0 mg/mL藥浴液，超聲30 min；準確稱取0.250 g SM于100 mL容量瓶，用乙腈配制成2.5 mg/mL藥浴液；準確稱取0.375 g SM于250 mL容量瓶，用乙腈配制成1.5 mg/mL藥浴液，超聲10 min。

(3)酸化乙腈配制：99 mL乙腈中加入1 mL甲酸。

1.3.2 4種磺胺類藥物殘留分析方法

參照農業部1077號公告-1-2008《水產品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-質譜法》，并進行優化改進，具體方法如下：

(1)樣品前處理方法

準確稱取1.0 g草魚粉樣品(±0.01 g)于50 mL離心管中，加入4 mL超純水使其復原，振搖、充分混勻。準確加入0.05 mL內標混合標準工作液，渦旋混合30 s，依次加入15 mL酸化乙腈、4 g無水硫酸鎂，渦旋混勻，超聲提取10 min，4 500 r/min離心10 min，取上清液于50 mL梨形瓶中。向殘渣中加入15 mL酸化乙腈，重復提取一次，合并兩次提取液，于40 ℃水浴條件下旋轉蒸發至干。加入1.0 mL 20%甲醇水溶液，渦旋溶解殘留物，繼續加入3.0 mL正己烷渦旋混合30 s，12 000 r/min離心5 min，取下層清液，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

(2)標準工作曲線的制作

分別準確吸取SMZ、SFZ、SM、SM的混合標準工作液和0.05 mL磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶的內標混合標準工作液，加入陰性草魚肌肉粉基質中，配制成10、20、50、100、200 μg/L系列混合標準工作曲線，按1.3.2樣品前處理步驟進行操作后上機檢測。以濃度為橫坐標，目標物與內標物峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。

(3)液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm，賽默飛世爾科技有限公司)；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相A相為 0.1 %甲酸溶液(含5.0 mmol/L醋酸銨)，流動相B相為甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Conditions of gradient elution

(4)質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下采用多反應監測(MRM)模式采集數據。離子源的詳細參數如下：噴霧電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度(TEM)：550 ℃；氣簾氣(CUR)：206.85 kPa；霧化氣(GS1)：310.28 kPa；輔助加熱氣(GS2)：55 379.23 kPa；4種磺胺類化合物MRM質譜參數見表2。

表2 4種化合物的主要質譜參數Tab.2 MS/MS parameters of 4 compounds

1.3.3 藥浴時間的確定

藥浴實驗組池中SMZ、SFZ、SM、SM藥浴初始濃度分別為2.72、3.75、1.05、2.49 mg/L，水溫(23±2) ℃，選擇暫養池中經檢測后均無SMZ、SFZ、SM、SM藥物殘留的健康、活潑草魚，一次放入37尾，每尾規格在900～1 100 g，連續藥浴24 h后全量換水。給藥后分別在 0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、15、24、28、32、48 h采集樣品，每個時間點隨機撈出草魚3尾，取其背部肌肉并混勻，于-20 ℃保存用于測定4種磺胺類藥物殘留量。

1.3.4 樣品的制備

根據優化后的藥浴時間對草魚進行藥浴，并制備成魚糜樣品。將樣品放置于冷凍干燥機中進行干燥處理；隨后對冷凍干燥樣品進行粉碎、過120目篩后充分混勻。按照每瓶(5.0±0.1) g分裝到帶有密封內蓋的棕色玻璃瓶中，放入-20 ℃冰箱中保存，以考察樣品的均勻性和穩定性。

1.3.5 樣品的均勻性檢驗

根據JJF 1343-2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》，對樣品進行均勻性檢驗。本研究按照編號順序隨機抽取11 個包裝單元，每個單元取3個平行樣品，采用1.3.2確定的分析方法進行樣品測定。檢測結果采用單因素方差分析法進行統計分析，通過比較檢驗值與臨界值的大小來判斷樣品的均勻性。

1.3.6 樣品的穩定性檢驗

根據JJF 1343-2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》，對樣品進行長期和短期穩定性檢驗。樣品在-20 ℃儲存條件下進行長期穩定性考察，考察的時間間隔為1、2、3、4、6個月；短期穩定性檢測模擬樣品運輸條件和極端條件，考察樣品在-40、-20、4、25、50 ℃保存條件下在 0、3、7、11、15 d的短期穩定性。每次隨機取3個包裝單元，平行測定兩次，測量方法與均勻性檢驗方法相同。取三個包裝單元測量結果的平均值作為該次穩定性檢測結果，采用檢驗法評定樣品的穩定性，判斷樣品的長期穩定性與短期穩定性。

1.3.7 樣品的定值

采用多個實驗室合作定值法對樣品進行定值測試。由6家通過資質認定的實驗室使用1.3.2檢測方法對樣品進行測定，合作定值實驗室進行嚴格的質量控制，并制定統一的作業指導書。每個實驗室隨機發放三個樣品，測定三個平行。所有檢測數據經狄克遜準則與科克倫檢驗后，數據等精度、無界外值，取平均值定值。

1.3.8 不確定度評定

草魚粉中4種磺胺類藥物殘留基體標準物質樣品定值結果的不確定度由三部分組成：即標準物質定值引入的不確定度u；標準物質的均勻性引入的不確定度u、標準物質長期穩定性和短期穩定性引入的不確定度u和u。

1.4 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2010軟件對數據進行統計，結果以平均值的形式表示，并利用origin8.0軟件進行分析及繪圖。

2 結果

2.1 標準曲線及回收率

4種磺胺類藥物的線性回歸方程、相關系數見表 3，由表3可知，4種磺胺類藥物的相關系數均大于0.998，線性關系良好。SMZ、SFZ、SM、SM回收率和相對標準偏差見表4，由表4可知，4種磺胺類藥物的回收率在92.90%～102.84%，批內和批間的相對標準偏差均小于10%。說明該方法的準確度高，重復性好，精密度良好，可滿足草魚粉中SMZ、SFZ、SM、SM殘留量的檢測要求。

表3 4種磺胺類藥物的標準曲線和相關系數Tab.3 Standard curves and correlation coefficients of four sulfonamides

表4 4種磺胺類藥物的回收率和精密度(n=6)Tab.4 Recovery and precision of four sulfonamides(n=6)

2.2 藥浴時間的確定

草魚肌肉中4種磺胺類藥物的殘留量隨給藥后時間的變化趨勢如圖1所示。由圖1可知，在給藥后0～24 h，是草魚對SMZ、SFZ、SM、SM的藥物吸收過程，從總體趨勢來看，給藥后6～12 h草魚肌肉中藥物殘留量變化趨勢相對平緩，10 h后藥物殘留量迅速上升，24 h時草魚肌肉中藥物殘留量達到峰值，24 h后藥浴池全量換水后，草魚肌肉中藥物殘留量隨著時間的推移逐漸降低。因此，陽性樣本的采集時間范圍在用藥后的6～12 h，考慮到預期的濃度水平且保證草魚肌肉中的SMZ、SFZ、SM、SM殘留量相對穩定，最終選擇藥浴后10 h采集陽性樣品。

圖1 不同藥浴時間下草魚肌肉中SMZ、SFZ、SM2、SM1殘留量的變化Fig.1 Changes of SMZ，SFZ，SM2，SM1 residues in muscle of grass carp under different bath time

2.3 均勻性研究

樣品的均勻性統計結果見表5。其中，組間自由度為10，組內自由度為22，(10，22)=2.3。由表中數據可知，草魚粉中的4種磺胺類藥物的統計量值均小于(10，22)，表明樣品間不存在顯著性差異，即樣品中SMZ、SFZ、SM、SM的含量是均勻的。

表5 均勻性統計結果Tab.5 Statistical analysis results of homogeneity testing

2.4 穩定性研究

2.4.1 短期穩定性

樣品短期穩定性統計結果見表 6。采用檢驗法評定樣品的穩定性，其中，自由度為3，置信水平0.95，t=3.18。由表中數據可知，||

表6 短期穩定性統計結果Tab.6 Statistical results of short-term stability

2.4.2 長期穩定性

樣品在棕色玻璃瓶包裝儲存條件下，進行了6個月的長期穩定性考察，統計結果見表7。其中，自由度為3，置信水平0.95，=3.18。由表中數據可知，||<×s()，表明樣品在-20 ℃下儲存6個月是穩定的。

表7 長期穩定性統計結果Tab.7 Statistical analysis results of long-term stability testing

2.5 定值

6家實驗室的定值數據經過狄克遜和科克倫檢驗，數據等精度、無界外值，均符合定值要求，數據都可以保留，統計結果見表8。草魚粉中SMZ、SFZ、SM、SM藥物殘留基體標準物質的特性量的多家聯合定值結果平均值分別為(22.22±1.90)、(24.04±3.65)、(31.11±3.95)、(28.55±2.26) μg/kg。

表8 定值數據狄克遜與科克倫檢驗統計檢驗Tab.8 Fixed value data Dixon and Cochran test statistical test

2.6 不確定度評估

通過評估協作定值、均勻性和穩定性的不確定度分量，合成得出基體標準物質特性值的標準不確定度，在95%置信水平下，取包含因子=2，得出相對擴展不確定度，不確定度評估結果見表9。草魚粉中SMZ、SFZ、SM、SM藥物殘留基體標準物質的特性量由定值的總平均值與合成擴展不確定度組成，詳見表10。

表9 不確定度評估結果Tab.9 Evaluation results of uncertainty

表10 基體標準物質定值結果Tab.10 Characterization results of matrix reference materials

3 討論

3.1 藥浴時間對草魚肌肉中SMZ、SFZ、SM2、SM1殘留的影響

通過對草魚肌肉中的 SMZ、SFZ、SM、SM殘留量檢測，由消除曲線圖可以看出，SMZ、SFZ、SM、SM在肌肉中隨著藥浴時間的延長而逐漸升高，隨后進入緩慢上升階段，24 h 換水前殘留量達到峰值，考慮到預期的濃度水平且保證草魚肌肉中的藥物殘留量相對穩定，最終確定藥浴時間為10 h。與余孔捷等研究結果較相似，24 h 換水前藥物殘留都出現峰值，但與本實驗有所不同的是，余孔捷實驗中換水后第28 h 殘留變化相對平緩，而本實驗中，換水后4種磺胺類藥物都呈現快速下降的現象，結果的差異性可能與實驗環境的溫度、魚類品種不同有關，本實驗中的藥浴水體使用加熱棒控制藥浴水溫為(23±2) ℃，溫度越高藥物消除速率越快。ZHAO等研究了磺胺嘧啶和磺胺甲噁唑在鯉魚體內的吸收與殘留消除，結果顯示，0.006、0.6、6 μg/L三個給藥濃度水平下，鯉魚組織中的2種磺胺類藥物濃度隨時間而增加，所有劑量組均觀察到魚體快速吸收現象，這與本實驗中在換水前草魚對SMZ、SFZ、SM、SM的吸收情況是一致的。

3.2 基體標準物質的均勻性與穩定性檢驗設計

根據JJF1343-2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》中對標準物質樣品均勻性檢驗的要求，記總體單元數為N，當N≤200時，抽樣單元數不少于11個。本研究共研制187個單元，按照編號順序，使用Microsoft Excel 2010 軟件隨機抽取11個包裝單元，每個單元獨立測量3次，結果采用單因素方差分析法進行統計分析。結果顯示草魚粉中的4種磺胺類藥物的統計量值均小于(10,22)，表明通過本研究中的制備方法所制得的樣品含量是均勻的，可以滿足基體標準物質制備的均勻性要求。

穩定性檢驗在均勻性檢驗之后進行。標準物質的穩定性檢驗分為兩種情況，一是在規定保存條件下，較長周期內定期地進行標準物質特性值的長期穩定性檢驗；二是不同溫度的運輸條件下或極限條件下對標準物質特性值的短期穩定性檢驗，依據樣品包裝和運輸形式，確定短期穩定性評估的溫度。在本研究中制備的樣品為凍干粉狀態，包裝形式為棕色玻璃瓶，運輸方式為郵政網絡運輸傳遞。由2.4分析結果可知，樣品在6個月內是穩定的并且樣品可采用常溫運輸，該結論與尹太坤等研制的兩種磺胺類基體標準物質的穩定性評估結論是一致的。

3.3 基體標準物質的定值方法選擇與不確定性影響分析

標準物質的定值分為以下幾種方式：(1)由單一實驗室進行單一基準方法測量；(2)由一個或多個實驗室用2種或多種獨立的標準方法測量；(3)多個實驗室使用一種或多種已證明其準確性的方法協作定值；(4)用特定方法測量；(5)利用一級標準物質進行比較定值。在本研究中選擇第三種方法進行定值，邀請國內6家具有相關檢驗資質的權威檢驗機構合作定值，合作實驗室均采用1.3.1中已確定的檢測方法進行樣品測定。參加聯合定值的6家實驗室，長期參加全國農產品質量安全例行監測、專項監測等工作，均為國家級或省部級權威實驗室，為本研究中草魚粉中SMZ、SFZ、SM、SM藥物殘留基體標準物質準確定值提供了可靠保證。

由不確定度評估結果可知，樣品由均勻性引入的不確定度分量最小，說明本研究中制備的樣品均勻性良好；對4種磺胺類藥物的不確定度貢獻較大的因素主要為長期穩定性引入的不確定度分量，這表明盡管標準物質的長期穩定性已監測合格，但仍有必要在標準物質長期穩定性方面進一步開展研究，探索更加有效的標準物質儲存條件，同時在實際實驗操作過程中，盡量規范操作，減少因測量引入的不確定度，從而降低不確定度，提升標準物質品質與檢測結果的準確性。

4 結論

本研究通過藥浴養殖的給藥方式獲得了適合濃度的草魚自然污染的陽性樣品。采用液相色譜-串聯質譜法和多家實驗室合作定值的方式，制備了一批草魚粉中SMZ、SFZ、SM、SM藥物殘留基體標準物質樣品。所獲得的4種磺胺類藥物殘留基體標準物質樣品，已完成6個月長期穩定性監測，樣品性質穩定，特性量值準確可靠，為充分保證標準物質量值的準確可靠，將繼續跟蹤監測標準物質的穩定性以延長有效期。研制成果可用于質量控制、儀器校準等領域，對完善我國水產品藥物殘留檢測工作具有很大的實用價值。本研究中制備的基體標準物質均勻性良好，穩定性符合標準物質技術要求，定值結果可靠，該方法對進一步開展水產品中磺胺類藥物殘留基體標準物質的制備提供了技術參考。