Clara細胞10 kD蛋白通過調控T細胞反應治療小鼠變應性鼻炎研究①

余海靜 汪 琳 王志斌 劉 陽

（華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，武漢 430030）

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是最常見的、由環境變應原（主要包括草花粉和塵螨）誘導的IgE介導的Ⅰ型變態反應，影響全球10.5%～25%人口［1］。盡管患者可接受口服抗組胺藥、鼻內類固醇皮質激素和過敏原免疫治療，但效果欠佳［2］。因此，迫切需要尋找更有效的治療方法。

調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）在炎癥性疾病中控制免疫平衡［3］。Tregs通過分泌抑制性細胞因子（如IL-10和TGF-β1）發揮作用［4］。此外，Tregs通過細胞毒性T淋巴細胞抗原-4和組胺受體2等膜結合分子發揮生物學功能［5］。Tregs功能失衡參與類風濕關節炎、自身免疫性肝炎、癌癥、氣道疾病等發病過程［6］。Tregs對疾病免疫應答的調節作用已被廣泛研究，因此尋求增強T調節反應的治療方法越來越受到重視［7］。

Clara細胞10 kD蛋白（CC10）是分泌珠蛋白家族成員，課題組前期結果表明其具有免疫調節作用［8］。此外，課題組最近數據還表明CC10可抑制AR模型局部Th17反應［9］。但其對T調節細胞應答的調節作用尚未研究。因此，本研究擬探討CC10對AR小鼠T細胞反應及T調節細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物8周齡C57BL/6J小鼠取自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，置于SPF級環境飼養。

1.1.2 主要試劑OVA（Ⅴ級，Sigma）；ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 AR小鼠建模及CC10給藥參考課題組前期方法建立AR小鼠模型［10］，將小鼠分為4組：對照組（Control）、AR組、AR+CC10組和AR+PBS組，每組5只。AR組小鼠第0、7天皮下注射10μg OVA和1.6 mg氫氧化鋁，第14～18天每天用10μg OVA加至40μl PBS進行鼻內激發（20μl/鼻孔）。對照組用PBS致敏，OVA激發。最后1次激發24 h后處死小鼠。AR+CC10組小鼠每次OVA激發前2 h在40μl PBS中加入1.4μg CC10進行鼻腔滴入（20μl/鼻孔）。AR+PBS組小鼠僅給予等量PBS。

1.2.2 小鼠搔鼻次數計數統計最后1次經鼻PBS或OVA激發24 h后，兩名觀察者記錄10 min內搔鼻次數。

1.2.3 鼻腔灌洗液（nasal lavage fluid，NLF）獲取按課題組前期方法收集NLF［10］。離心NLF，取上清，-80℃保存，ELISA測定細胞因子水平。NLF細胞沉淀物稀釋于1 ml PBS用于HE染色。

1.2.4 ELISA檢測NLF中IFN-γ、TGF-β1、IL-10、IL-17、IL-5水平按照ELISA試劑盒說明檢測IFN-γ、TGF-β1、IL-10、IL-17、IL-5水平，IFN-γ檢測靈敏度為5 pg/ml，TGF-β1和IL-5檢 測靈敏 度 為2 pg/ml，IL-10和IL-17檢測靈敏度為1 pg/ml。

1.2.5 組織病理學按課題組前期方法制備鼻腔黏膜載玻片［9］。對杯狀細胞進行Schiff染色。在4個隨機選擇的區域中對上皮杯狀細胞進行計數，杯狀細胞以上皮包含個數/mm表示。將稀釋后的NLF細胞置于載玻片上風干，用于HE染色。隨機選取4個視野進行嗜酸性粒細胞計數分析。NLF嗜酸性粒細胞表達為：個/ml。

1.2.6 定量PCR參照課題組前期方法進行定量PCR［9］。PCR法檢測基因mRNA表達。引物序列：FOXP3正向引物5′-GCCAAGCAGAAAGATGACAG-3′，反向引物5′-TTCCAGATGTTGTGGGTGAG-3′；β-actin正向引物5′-GCAGAAGGAGATTACTGCTCT-3′；反向引物5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。

1.3 統計學分析采用SPSS23.0軟件分析數據，結果以±s表示。采用單因素方差檢驗比較不同組結果，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CC10改善AR小鼠鼻部搔鼻癥狀AR小鼠經鼻OVA激發后出現搔鼻癥狀，搔鼻次數顯著多于對照組（P＜0.01）。CC10治療明顯減輕了AR小鼠搔鼻癥狀，與PBS處理組相比差異有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

2.2 CC10降低AR小鼠NLF中嗜酸性粒細胞及上皮杯狀細胞數細胞滴片HE染色結果顯示，AR組小鼠嗜酸性粒細胞明顯多于對照組（P＜0.01），CC10處理明顯抑制嗜酸性粒細胞增加（P＜0.05）。杯狀細胞計數顯示AR組小鼠上皮杯狀細胞明顯多于對照組（P＜0.01），CC10處理明顯抑制杯狀細胞增加（P＜0.05，圖2）。

2.3 CC10降低IL-5和IL-17細胞因子水平AR組小鼠NLF中IL-5、IL-17水平較對照組顯著升高（P＜0.05），IFN-γ水平差異無統計學意義，CC10處理后，IL-5、IL-17水平明顯降低（P＜0.05，圖3）。

圖1 各組小鼠搔鼻次數比較Fig.1 Comparison of nasal rubs among different groups

圖2 各組小鼠NLF中嗜酸性粒細胞及上皮中杯狀細胞比較（×200）Fig.2 Comparison of eosinophils and goblet cells in NLF of mice in different groups（×200）

圖3 各組小鼠NLF中IL-5、IL-17及IFN-γ表達比較Fig.3 Comparison of levels of IL-5，IL-17 and IFN-γin NLF of mice in different groups

圖4 各組小鼠鼻黏膜FOXP3及NLF中TGF-β1及IL-10表達比較Fig.4 Comparison of levels of FOXP3 in nasal mucosa and TGF-β1，IL-10 in NLF of mice in different groups

2.4 CC10促進小鼠鼻黏膜FOXP3表達及NLF中TGF-β1、IL-10表達與對照組相比，AR組小鼠FOXP3 mRNA表達增強（P＜0.05），CC10處理顯著增強其表達。對照組和AR組小鼠IL-10和TGF-β1水平差異無統計學意義，而CC10治療組小鼠IL-10和TGF-β1水平顯著升高（P＜0.05，圖4）。

3 討論

本研究首次發現CC10可減輕AR小鼠臨床癥狀，同時減輕鼻黏膜局部嗜酸性粒細胞浸潤，減少杯狀細胞增生，降低Th2和Th17反應，但增加Tregs反應。

CC10是一種抗炎蛋白，參與調節氣道疾病發展［9］。最近研究表明，CC10可抑制AR模型中Th17反應［10］。本研究發現OVA激發導致AR小鼠氣道嗜酸性粒細胞浸潤和杯狀細胞增生，CC10可顯著改善AR小鼠以上病理學特征，與課題組前期研究結果一致。CC10可顯著降低IL-5和IL-17水平，而對IFN-γ無影響，提示CC10對Th2和Th17細胞具有抑制作用。課題組前期研究發現，CC10在致敏階段可通過降低樹突狀細胞OX40配體、IL-6和IL-23表達而抑制Th17反應，但同時促進樹突狀細胞TGF-β1和CD86表達［10］。而在激發階段，CC10可降低鼻黏膜局部CCL20和IL-23表達。因此，CC10的作用機制尚不清楚，有待進一步研究。

迄今為止，不同過敏原特異性T細胞亞型（Th1、Th2、Th17和Tregs）已被證實與過敏性氣道疾病有關［11］。T輔助細胞和Tregs失調可導致過敏性疾病發展［11］。研究表明，外周Tregs在控制T細胞反應方面起關鍵作用［12］。人類和動物模型中，Tregs缺失或功能缺陷與過敏性氣道疾病、自身免疫性疾病和癌癥相關［12］。已知的Tregs亞群中，有兩個Tregs亞群受到了特別關注，即胸腺中自然產生的Tregs和外周產 生 的Tregs［13］。外 周 產 生 的Tregs還 包 括Tr1和Th3兩個細胞亞群，其特征分別為分泌IL-10和TGF-β1［14］。本研究表明，CC10可顯著增加AR小鼠鼻黏膜局部FOXP3表達，CC10治療后IL-10和TGFβ1水平顯著升高。本研究表明Tregs在CC10的免疫調節和抗炎作用中發揮重要作用。

研究表明吲哚胺-2，3-雙加氧酶（IDO）、TGF-β1、IL-10和前列腺素E2（PGE2）等分子決定了Tregs分化［15-16］。本研究觀察到CC10顯著增加AR小鼠鼻黏膜中TGF-β1和IL-10表達，提示TGF-β1和IL-10可能是CC10影響AR小鼠Tregs擴增的主要因素。由于CC10在氣道疾病中具有較強抗炎作用，課題組推測其可能通過增強IDO和PGE2表達促進T調節反應，但還需進一步闡明。

總之，CC10可能通過調控T細胞反應改善AR小鼠鼻腔炎癥狀態，具體機制還需進一步研究。