B細胞轉錄激活因子對實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎的調控機制研究①

傅增輝 林再紅 金 艷 姜 巖 劉 晶 于繪麗 張廣萍

（齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院神經內科，齊齊哈爾 161002）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是中樞神經 系統的慢性炎癥性脫髓鞘性自身免疫病。MS的臨床癥狀不僅包括運動障礙，還包括認知缺陷［1-2］。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是已建立的MS模型，其特征在于中樞神經系統中的炎癥和神經退行性變，并表現出與人類MS在臨床和組織病理學上的相似性［3-5］。課題組前期研究發現，急性發作期的復發-緩解型MS患者維甲酸相關核孤兒受體γt（retinoicr acid-related orphanreceptorγt，RORγt）、B細胞轉錄激 活 因 子（B cell activating transcription factor，BATF）可能通過共同調控輔助性T細胞17（helper T cell 17，Th17）的分化，從而促進Th17及其細胞因子IL-17高表達，促使MS的發生與進展［6］。研究發現，RORγt在MS和EAE的發生發展中扮演重要角色，BATF與RORγt在多種自身免疫病中具有關聯性［7-8］。本研究將通過髓鞘少突細胞糖蛋白多肽35-55（myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55，MOG35-55）、完全弗氏佐劑（complete Freund"s adjuvant，CFA）和百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）誘導EAE模型，檢測小鼠Th17水平，觀察脊髓組織BATF、RORγt、IL-17的表達及病理表現，旨在探討BATF與EAE發病關鍵轉錄因子RORγt的關系，為進一步研究及臨床治療提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級雌性C57BL/6小鼠30只，8～10周齡，體質量18～20g，由齊齊哈爾醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（黑）2016-001。本實驗遵循實驗室的實驗動物使用管理規定，并通過齊齊哈爾醫學院學校倫理委員會批準。建模前將實驗動物在SPF級環境中飼養1周。將小鼠隨機分為正常對照組、EAE組、EAE+甲潑尼龍（methylprednisolone，MP）組，每組10只。

1.1.2 主要試劑MOG35-55（批號：20190415020）購自英國Biorbyt公司；CFA（批號：201907143）購自美國Invivogen公司；將10 mg MOG35-55溶于2 ml生理鹽水，并與含2.5 mg/ml結核桿菌的CFA等體積混合，使用玻璃注射器反復抽打至完全融合，制成油包水樣乳劑。PTX（批號：19024392）購自英國Abnova公司；IL-17 ELISA試劑盒（批號：EF19014060）購自美國LSM公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號：1902250101）購自上海生工生物工程有限公司；勒克斯固藍（Luxol Fast Blue，LFB，批號：19066032）購自上海歌凡生物科技有限公司；淋巴細胞分離液（批號：1906460143）購自美國Sigma公司；FITC標記的大鼠抗小鼠CD4抗體（批號：6110899）、Alexa Fluor 647標記的大鼠抗小鼠IL-17抗體（批號：201907140214）均購自美國BD Pharmingen公司；臺盼藍染色液（批號：19036326）購自上海碧云天生物技術公司；BATF、RORγt和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成；Trizol試劑（批號：19013621）購自Ambion公司；反轉錄試劑盒（批號：RP1105）購自美國Solarbio公司；熒光定量PCR試劑盒（批號：190500310）購自美國Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 EAE小鼠模型建立和干預措施［9］以2%（質量濃度）戊巴比妥麻醉小鼠，按3 ml/kg給予小鼠背部沿脊柱中線兩側分四點皮下注射抗原乳劑0.2 ml，分別于0 h、48 h腹腔注射給予小鼠PTX 200 ng建立EAE模型。正常對照組小鼠以同法背部皮下注射不含MOG35-55和結核桿菌的乳劑。EAE+MP組在EAE組的基礎上，造模后第12天，小鼠發病達高峰時開始給予MP（100 mg/kg），每日以生理鹽水稀釋后自尾靜脈緩慢注入，1次/d，連續3 d后均減半藥量再給藥2 d，共給藥5次。自免疫當天起，隔天觀察并記錄小鼠行為特征，采用五分法對小鼠進行Kono"s評分［10］。0分：活動正常，無明顯臨床癥狀；1分：尾部無力；2分：后肢無力，翻轉后可自行恢復；3分：尾部及雙后肢癱瘓，翻轉后不能自行恢復；4分：四肢癱瘓；5分：瀕臨死亡或死亡。神經功能評分≥1分即認為發病。共觀察26 d。

1.2.2 血清IL-17水平檢測免疫后第26天，取小鼠眼眶血至EP管，室溫靜置2 h，4℃、3 000 r/min離心20 min，離心半徑8 cm，收集上清，-80℃冰箱保存備用。檢測時取適量血清，按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.3 組織標本采集免疫后第26天，以2%（質量濃度）戊巴比妥麻醉小鼠，預冷生理鹽水進行心臟灌注，打開腹腔暴露脾臟，用鑷子輕輕取出脾臟，采集脊髓組織，部分以4%（質量濃度）多聚甲醛固定后制成石蠟切片，剩余組織置于-80℃冷凍保存備用。

1.2.4 脾臟淋巴細胞中Th17表達將脾臟置于200目無菌篩網，剪碎后碾磨，PBS（pH=7.4）沖洗，收集細胞懸液添加至淋巴細胞分離液。密度梯度離心，比重1.088±0.001，450 g、10 min，臺盼藍染色確保細胞存活率＞95%。調整細胞濃度至1×107個/ml，接種于24孔細胞培養板，加入2μl PMA/離子霉素混合物或BFA/莫能霉素混合物，于37℃、5%CO2培養箱中培養5 h。Th17染色：加入4μl FITC標記的淋巴細胞，4℃避光孵育30 min，洗滌，加入100μl破膜劑A液，室溫避光孵育5 min，鞘液洗滌1次后，加入50μl破膜劑B液，再加入2μl Alexa Fluor 647標記的IL-17抗體，室溫避光孵育30 min。鞘液洗滌2次后，流式細胞儀檢測，并應用CytExpert2.0.0.153軟件分析。實驗過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 病理染色染色前，將切片在二甲苯中脫蠟，并在梯度乙醇中水化（100% 5 min，85% 5 min，70%5 min），PBS沖洗。按照說明書要求，對脊髓切片進行HE和LFB染色［11-12］。分別評估炎癥細胞浸潤和脫髓鞘。HE染色在光學顯微鏡下（×400）分析每只小鼠5個不同的切片。LFB染色觀察每個切片的脊髓白質內至少10個（×40）隨機分布的視野。使用Image-Pro Plus軟件對被LFB藍色覆蓋的面積進行定量，并表示為所檢查白質總面積的百分比（LFB藍色占比）。計算每只小鼠LFB藍色占比的平均值。

1.2.6 RT-PCR檢測脊髓組織BATF、RORγt mRNA表達將凍存組織在液氮中研磨，加Trizol提取總RNA，行逆轉錄反應，逆轉錄反應程序：37℃孵育60 min，85℃溫育5 min，逆轉錄后5倍稀釋cDNA，取2μl cDNA進行PCR擴增。β-actin正向引物：3"-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-5"，反向引物：3"-AGGGACTTCCTGTAACAATGCA-5"；BATF mRNA正向引 物：3"-AGCGAAGAACCTGGAGAAACA-5"，反 向引 物：3"-TTCAGCACCGACGTGAAGTA-5"；RORγt mRNA正 向 引 物：3"-GGCTCCCTGGATGAATAGAATG-5"，反向引物：3"-AGGCAGAGGCAGAAAATGTAAAG-5"。擴增條件：95℃預變性2 min，1個循環；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環；72℃總延伸6 min。按照2-ΔΔCt相對定量計算公式計算各樣品的目的基因相對定量結果，分析目的基因mRNA轉錄水平差異。

1.3 統計學處理采用SPSS19.0軟件進行統計分析，對數據進行正態性和方差齊性檢驗，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組均數間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，相關性分析采用Pearson分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EAE小鼠臨床癥狀評分自免疫后第10天開始，EAE小鼠陸續出現臨床癥狀，EAE模型組小鼠神經功能評分于第24天達高峰，隨后有所緩解；EAE+MP組小鼠于治療第6天（免疫后第18天）開始，其神經功能評分明顯低于EAE組（均P＜0.05），見圖1。

2.2 EAE小鼠血清IL-17蛋白表達水平與對照組相比，EAE組小鼠血清IL-17蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；給予MP治療的EAE+MP組較EAE組顯著降低（P＜0.05），見圖2。

2.3 各組小鼠脾臟組織Th17/CD4+水平與對照相比，EAE組Th17/CD4+升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；給予MP治療的EAE+MP組較EAE組顯著降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 各組小鼠脊髓組織BATF、RORγt mRNA表達水平與對照相比，EAE組小鼠脊髓組織BATF、RORγt mRNA表達水平升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；給予MP治療的EAE+MP組較EAE組均顯著降低（均P＜0.05），見圖4。

圖1 各組小鼠臨床癥狀評分比較Fig.1 Comparison of clinical symptom scores of mice in each group

圖2 各組小鼠血清IL-17蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison of serum IL-17 protein expression level of mice in each group

圖3 各組小鼠脾臟組織Th17/CD4+比較Fig.3 Comparison of Th17/CD4+in spleen of mice in each group

圖4 各組小鼠脊髓組織BATF、RORγt mRNA表達水平比較Fig.4 Comparison of expression levels of BATF and RORγt mRNA in spinal cord of mice in each group

圖5 各組小鼠HE和LFB病理染色結果Fig.5 Pathological staining results of HE and LFB in mice of each group

2.5 各組小鼠HE和LFB病理染色結果 如圖5所示，HE染色檢查每只小鼠的脊髓切片中單核細胞的浸潤情況，EAE小鼠的脊髓切片中有許多血管周圍的單核浸潤細胞簇，而對照組小鼠的脊髓中沒有這些炎癥細胞浸潤。給予MP治療的EAE+MP組較EAE組小鼠脊髓中觀察到較少的細胞浸潤。EAE組LFB藍色占比較對照組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05），表明EAE小鼠有明顯的神經髓鞘脫失；而MP治療的EAE+MP組LFB藍色占比較EAE組小鼠明顯增多，代表MP治療可減輕神經髓鞘的脫失。

2.6 相關性分析采用Pearson相關性分析，EAE組（n=10）小鼠脊髓BATF mRNA與血清IL-17表達、脾臟組織Th17/CD4+水平、脊髓RORγt mRNA表達呈正相關（r=0.833、r=0.716、r=0.514，均P＜0.05）；EAE組小鼠脊髓BATF mRNA與LFB染色藍色占比呈負相關（r=-0.801，P＜0.05）。

3 討論

糖皮質激素是目前臨床用于控制MS急性加重期最重要的藥物之一。糖皮質激素可通過誘導T細胞凋亡及細胞因子等機制達到治療EAE的作用［13］。構建EAE小鼠模型，并予MP治療，其神經損害表現得到明顯改善，Kono"s評分降低；而模型組病情無改善，Kono"s評分升高。說明MP可使EAE的癥狀緩解、縮短病程。Th17作為CD4+T細胞的一種亞群，其不同于Th1、Th2和Treg，已被證實在神經免疫疾病中扮演重要角色。IL-17是一類由Th17分泌的具有多重功效的細胞因子，在Th17中高表達，可通過誘導各種促炎因子和趨化因子等參與局部組織的炎癥反應，在炎癥和自身免疫病，特別MS中發揮重要作用。EAE小鼠將產生IL-17的CD4+T細胞轉繼給健康小鼠可誘導產生嚴重的EAE，并且發現IL-17的受體受阻或IL-17缺陷的小鼠抵抗EAE［14-15］。本實驗結果表明，EAE小鼠IL-17表達較對照組明顯增多，而給予MP可降低IL-17水平。

BATF為AP-1超家族成員，激活蛋白酶1（AP-1）可通過調節細胞因子表達調節系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎等自身免疫病的發生發展，AP-1與細胞核內轉錄因子進入細胞核誘導特定基因的轉錄引起的細胞增殖、分化有關［16］。SCHRAML等［17］發現，體外培養的BATF-/-的CD4+和CD8+T細胞IL-17水平下降，上調BATF后IL-17水平上升；同時發現，BATF-/-的小鼠T細胞不能誘導Th17相關細胞因子如RORγt等的表達分化。RORγt是控制Th17分化的特異因子，CD4+T細胞在某些細胞因子的協同刺激中，激活Stat3途徑誘導RORγt表達，進而促進未致敏的CD4+T細胞向Th17分化。RORγt在Th17高表達，可誘導IL-17基因表達，參與多種炎癥反應和自身免疫病的病理變化，阻斷RORγt基因，則Th17分化受到抑制，IL-17表達下調［18-19］。

本研究利用MOG35-55、CFA和PTX建立EAE小鼠模型，結果顯示，BATF與RORγt的表達顯著高于對照組，病理切片脊髓中血管周圍有大量單核細胞浸潤，IL-17及炎癥細胞的表達同樣顯著升高，表明BATF和RORγt在EAE的炎癥中發揮重要作用，與既往結論相一致，而將MP給予EAE小鼠后則與之相反。同時，本研究還發現，EAE小鼠脊髓BATF、RORγt的表達與IL-17蛋白表達及脊髓神經髓鞘脫失程度呈正相關。提示BATF和RORγt可能通過調控Th17的分化發育，進而影響其關鍵炎癥細胞和因子，從而調控中樞神經的炎癥。SCHRAML等［17］在敲除BATF基因時，IL-17表達下降，此時即使用慢病毒轉染上調RORγt，也并不能增加IL-17的表達。在RORγt缺乏時，過表達BATF可引起IL-17水平上調。由于RORγt是調控Th17分化發育的特異性轉錄因子，課題組推測，缺乏RORγt可能會引起Th17分化過程受阻，從而一定程度上減少EAE等自免疾病的發病，這與SCHRAML等［17］的結論相反，提示在BATF缺乏的條件下，RORγt不能通過誘導BATF的產生而促進Th17分化，但BATF可以誘導RORγt的產生。由于BATF和RORγt在IL-17的表達中均扮演必要角色，因此，BATF和RORγt在Th17的分化發育及表達中可能有協同作用。且本實驗中EAE小鼠模型脊髓組織中BATF與RORγt的表達及其與EAE小鼠脊髓髓鞘脫失、細胞因子的表達具有相關性，BATF在EAE炎癥中的重要作用可能是通過調控RORγt表達實現的，與研究組前期的臨床研究結果相符，但BATF與RORγt間的具體作用機制尚需進一步深入研究。