沉默miR-8063促進結直腸癌細胞獲得多藥耐藥性及機制研究①

袁 濤 王 林 陳正權 文坤明（遵義醫科大學附屬醫院普通外科，遵義 563003）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大惡性腫瘤，也是導致癌癥相關死亡的第二大原因［1］。以化療為主的綜合治療是復發及轉移性結直腸癌的主要治療手段。隨著化療方案逐漸完善，越來越多化療藥物在臨床上被廣泛使用，而化療過程中對這些化療藥物產生的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）成為化療失敗的主要原因之一［2］。因此，深入研究產生耐藥性的潛在機制并尋求針對性治療靶點，對提高CRC生存率及改善預后具有重要意義。本課題組前期研究已證實Oct4B1作為一種癌基因能夠促進CRC細胞對奧沙利鉑的耐藥性［3］。為研究Oct4B1調控CRC耐藥性的分子機制，課題組采用miRNA芯片篩選出與Oct4B1表達趨勢相反的miRNA，并從中找到表達差異最為顯著的miR-8063，推測miR-8063可能作為一種抑癌基因在調節CRC耐藥性中發揮重要作用。本研究采用慢病毒介導的RNA干擾（RNAi）技術在CRC細胞SW480、HT29中沉默miRNA-8063基因，觀察沉默miRNA-8063是否能夠促進CRC細胞獲得MDR，并探討其分子機制是否與激活WNT/β-catenin信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 材料人結CRC細胞系SW480、HT29購自上海中科院細胞庫；沉默miR-8063慢病毒載體（miR-8063-inhibitor-GFP-PURO）及陰性對照病毒（NCGFP-PURO）委托上海漢恒生物科技有限公司構建；培養SW480細胞的L-15培養基、培養HT29細胞的5A培養基及胎牛血清（FBS）購自美國HyClone公司；2.5%胰酶、細胞全蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；RT-qPCR試劑盒和逆轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；CCK-8試劑購自美國MedChemexpress（MCE）公司；奧沙利鉑（OXA）和5-氟尿嘧啶（5-FU）購自美國Sigma公司；兔抗人P-gp、ABCG2、WNT3A、WNT5A、β-catenin一抗購自美國Proteintech公司；鼠抗人GAPDH和β-tubulin一抗和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔/鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒轉染SW480、HT29細胞分別轉染沉默miR-8063基因的慢病毒（miR-8063-inhibitor-GFP-PURO）和陰性對照病毒（NC-GFP-PURO）。沉默miR-8063基因慢病毒序列為：5"-UUCGGGGCUGAGGACUAAAACU-3"。轉染前1 d將兩種細胞用0.25%胰酶消化并按1×105個/孔接種于24孔板；采用陰性對照病毒確定各組細胞轉染條件，確定MOI值，根據MOI值計算每孔所需病毒量，病毒體積=（MOI×細胞數目）/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/ml，2.5μl/孔加入Polybrene（2 mg/ml），最后加入對應培養基補充體積至500μl/孔，48 h后更換新鮮培養基，72 h后倒置顯微鏡下觀察熒光并拍照，收集細胞，RT-qPCR鑒定轉染病毒后miR-8063基因的沉默效果。

1.2.2 miR-8063基因沉默效果檢測轉染72 h后，采用RT-qPCR檢測兩組細胞miR-8063相對表達（以U6為內參，具體步驟見1.2.4），引物由大連寶生物有限公司設計合成，引物序列見表1。

1.2.3 CCK-8檢測5-FU和OXA對細胞增殖的影響SW480和HT29細胞消化并計數，以每孔1×104個/100μl接種于96孔板培養24 h，加入0、2、4、8、16、32、64、128μg/ml梯度濃度的5-FU和OXA，室溫作用72 h，10μl/孔加入CCK-8溶液，37℃孵育3 h，酶標儀讀取每孔450 nm處吸光度（OD）值，計算出藥物作用72 h時半數抑制濃度（IC50）。將實驗組和對照組細胞按照上述方法接種于96孔板，加入5-FU和OXA（根據上述計算出的IC50加入），設置24 h、48 h和72 h 3個檢測點，檢測前3 h 10μl/孔加入CCK-8溶液在37℃培養箱內孵育，酶標儀測定450 nm處OD值，每組設3個復孔，實驗重復3次，細胞增殖抑制率（%）=（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值×100%。

1.2.4 RT-qPCR檢測耐藥基因P-gp、ABCG2 mRNA表達按照說明書采用Trizol試劑提取總RNA，酶標儀測量其濃度。取0.8μg總RNA按照PrimeScript RT reagent Kit試劑盒說明將RNA逆轉錄為cDNA，SYBR Green染料法進行實時PCR，總反應體積為20μl。反應條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40個循環；95℃15 s，60℃60 s，90℃15 s。每次檢測設3個復孔，實驗重復3次。以GAPDH為 內 參，2-ΔΔCt法確定目的基因mRNA表達（引物序列見表1）。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達收集細胞，按照蛋白提取試劑盒明書和BCA蛋白濃度測定試劑盒步驟提取蛋白，測定蛋白濃度；取待測樣品中40μg總蛋白，根據目的蛋白分子量在相應濃度的凝膠上分離目的蛋白，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將膜與對應一抗稀釋液（1∶2 000）4℃孵育過夜，第2天用1×TBST洗滌3次，加入對應的HRP標記羊抗兔/鼠IgG二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，1×TBST洗 滌 膜3次，將 膜 置 于ECL發光 液2 min，X射線膠片曝光顯現蛋白條帶，掃描，Quantity-One軟件分析，目的蛋白相對表達=目的蛋白灰度值/內參GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學分析采用SPSS17.0及GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析和制圖。數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒轉染SW480、HT29細胞效果SW480、HT29細胞分別感染miR-8063-inhibitor-GFP-PURO和NC-GFP-PURO，轉染72 h后熒光倒置相差顯微鏡下可見綠色熒光（圖1），表明病毒轉染成功。

2.2 RT-qPCR檢測兩組細胞miR-8063表達RTqPCR結果顯示，SW480-sh-NC和SW480-sh-miR-8063兩組細胞miR-8063表達分別為1.05±0.06和0.40±0.03；而HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063兩組miR-8063表達分別為1.04±0.08和0.23±0.03，與陰性對照組相比，實驗組miR-8063表達顯著降低（P＜0.01，圖2）。表明miR-8063在SW480和HT29中被成功沉默。

2.3 CCK-8法檢測兩組細胞對化療藥物5-FU和OXA的敏感性GraphPad Prism 5.0軟件計算出5-FU和OXA兩種化療藥物對SW480細胞72 h的IC50分別為52.09和16.20μg/ml，兩種藥物對HT29細胞72 h的IC50分別為57.59和22.63μg/ml（圖3）。24 h、48 h、72 h時5-FU對SW480-sh-NC、SW480-shmiR-8063、HT29-sh-NC、HT29-sh-miR-8063細胞的增殖抑制率分別為（15.86±1.15）%、（13.73±1.53）%、（13.54±0.88）%、（11.23±1.12）%；（29.52±1.79）%、（18.71±2.43）%、（23.44±2.73）%、（15.94±2.06）%；（71.93±5.22）%、（41.53±3.67）%、（50.38±3.91）%、（32.16±2.58）%。OXA在24 h、48 h、72 h對上述細胞的增殖抑制率分別為（11.24±1.77）%、（10.24±1.03）%、（10.75±0.98）%、（7.54±1.52）%；（26.49±3.54）%、（14.87±2.66）%、（27.58±2.32）%、（11.04±3.14）%；（80.76±4.02）%、（54.66±3.21）%、（64.38±3.31）%、（42.48±2.69）%。提示沉默miR-8063后SW480和HT29細胞對5-FU和OXA兩種化療藥物的敏感性均隨著藥物作用時間延長而降低，相較于對照組，實驗組48 h和72 h的增殖抑制率顯著降低（P＜0.01，圖4），表明48 h和72 h兩時間段實驗組細胞對5-FU和OXA均產生了耐藥性，提示實驗組細胞獲得MDR。

2.4 RT-qPCR檢測兩組細胞中耐藥基因P-gp、ABCG2 mRNA表達RT-qPCR結果顯示，SW480-sh-NC、SW480-sh-miR-8063、HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063細胞P-gp mRNA表達分別為1.05±0.05、1.81±0.05、1.02±0.11和2.50±0.09；ABCG2 mRNA在上述四組細胞相對表達分別為0.98±0.06、1.58±0.06、0.98±0.04和2.01±0.07。與對照組相比，實驗組中p-gp mRNA表達分別提高1.8倍和2.5倍；ABCG2 mRNA表達則分別提高1.6倍和2.0倍（P＜0.01，圖5）。

圖2 RT-qPCR檢測miR-8063表達Fig.2 Expression of miR-8063 detected by RT-qPCR

圖3 不同藥物濃度作用于SW480、HT29細胞的增殖抑制率（72 h）Fig.3 Cytotoxic effects of different drug concentration on SW480 and HT29 cells（72 h）

圖4 不同時間點（24 h、48 h、72 h）5-FU和OXA在兩組細胞中的增殖抑制率Fig.4 Cell proliferation inhibition rates of 5-FU and OXA at different time points（24 h，48 h and 72 h）in experimental group and control group

圖5 RT-qPCR檢測P-gp和ABCG2 mRNA表達Fig.5 mRNA levels of P-gp and ABCG2 detected by RTqPCR

2.5 Western blot檢測兩組細胞耐藥基因P-gp、ABCG2蛋白表達Western blot結果顯示，SW480-sh-NC、SW480-sh-miR-8063、HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063細胞P-gp蛋白表達分別為0.29±0.04、0.53±0.05、0.33±0.05和0.55±0.04；ABCG2蛋白上述四組細胞中相對表達分別為0.20±0.06、0.69±0.03、0.26±0.05和0.71±0.04。實驗組P-gp和ABCG2蛋白相對表達均顯著高于對照組（P＜0.01，圖6）。

2.6 Western blot檢測兩組細胞WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達Western blot結果顯示，SW480-sh-NC、SW480-sh-miR-8063、HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063組細胞WNT3A表達分別為0.08±0.01、0.18±0.01、0.12±0.02和0.23±0.03；WNT5A在以上四組細胞的相對表達分別為0.13±0.03、0.32±0.03、0.20±0.01和0.39±0.02；β-catenin在以上四組細胞的相對表達量分別為0.14±0.03、0.25±0.02、0.18±0.02和0.31±0.04。與對照組相比，實驗組WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達顯著升高（P＜0.01，圖7）。

圖6 Western blot檢測P-gp和ABCG2蛋白表達Fig.6 Protein levels of P-gp and ABCG2 detected by Western blot

圖7 Western blot檢測WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達Fig.7 Protein levels of WNT3A，WNT5A，β-catenin detected by Western blot

3 討論

CRC是發病率和病死率均較高的惡性腫瘤，對化療藥物MDR已成為CRC化療成功的主要障礙。MDR的產生是一個多因素共同參與的復雜過程，與減少藥物攝取并增強藥物外排、限制腫瘤細胞內藥物蓄積、阻斷細胞凋亡、DNA損傷修復及細胞周期和檢查點調節改變等密切相關［4］。盡管關于MDR的研究取得了一定進展，但對惡性腫瘤中MDR產生的具體分子機制仍知之甚少，因此，深入研究MDR的機制、尋求克服MDR的方法、提高化療藥物療效已成為目前腫瘤治療亟待解決的問題。microRNAs是一類長度約為18～25個核苷酸的內源性非編碼小分子單鏈RNA，通過結合不完全的3"UTR非翻譯區靶基因mRNA導致mRNA降解或翻譯抑制，從而在轉錄后對靶基因表達實施調控［5-6］。研究表明，microRNAs異常表達在多種惡性腫瘤MDR調控中發揮重要作用［7-9］。本研究利用前期基因芯片篩選結果，以CRC細胞SW480、HT29為研究對象，采用慢病毒介導的RNAi技術沉默其miR-8063基因，探究是否能夠促進SW480、HT29細胞獲得MDR，及其機制是否與激活WNT/β-catenin信號通路有關。

5-FU和OXA是目前轉移性CRC一線化療方案的常用藥物［10］。本研究中，實驗組在48 h和72 h的增殖抑制率較對照組明顯降低（P＜0.01），表明48 h和72 h兩個時間段實驗組細胞對5-FU和OXA均產生了耐藥，提示沉默miR-8063基因促進SW480、HT29細胞獲得了MDR。研究證實腫瘤細胞獲得MDR與細胞膜表面ATP結合盒轉運蛋白（ATPbinding cassette transporter，ABC轉運蛋白）介導的藥物轉運系統改變密切相關，其中P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和ATP結合盒式轉運蛋白亞家族成員G2（ATP binding cassette transporter，subfamily G member 2，ABCG2）在MDR中起關鍵作用［11-13］。這些蛋白能夠依賴ATP產生的能量將進入細胞內的藥物反泵出細胞，導致細胞內藥物濃度降低，從而保護細胞免受細胞毒性藥物損傷［14］。與對照組相比，實驗組P-gp mRNA相對表達分別提高了1.8倍和2.5倍，ABCG2 mRNA相對表達則分別提高了1.6倍和2.0倍（P＜0.01）。同時，實驗組P-gp和ABCG2蛋白表達也較對照組顯著增高（P＜0.01），提示沉默miR-8063基因后細胞獲得MDR，與其增強耐藥基因P-gp和ABCG2表達有關。

WNT/β-catenin信號通路（也稱為經典WNT通路）是由WNT家族分泌蛋白、包膜受體Frizzled家族、低密度脂蛋白受體相關蛋白（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）家族、Disheveled蛋白、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、腺瘤性息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）蛋白、支架蛋白（Axin）、酪蛋白激酶（CK1）、β-catenin及TCF/LEF家族轉錄調節因子等構成［15］。當WNT/β-catenin信號通路被激活時，WNT分泌蛋白與Frizzled受體和LRP5/6蛋白結合，活化Disheveled蛋白，從而使β-catenin降解復合體向質膜募集，導致β-catenin不能被磷酸化并在細胞質中積累，進而易位至細胞核結合轉錄因子TCF/LEF家族從而誘導靶基因轉錄［16］。大量研究已證實WNT/β-catenin信號通路異常激活與包括CRC在內多種惡性腫瘤復發、轉移、MDR等惡性生物學行為密切相關［17-21］。據報道WNT/β-catenin信號通路在約80%CRC患者中發生突變，提示其作為CRC治療靶點具有巨大潛力［22］。

microRNAs通過調節WNT/β-catenin信號通路相關蛋白表達在腫瘤中發揮促癌或抑癌作用：JIANG等［23］研究發現miR-30-5p抑制CRC CSCs干性和耐藥性，其機制為通過靶向泛素特異性肽酶22（Ubiquitin-specific peptidase 22，USP22）并通過WNT/β-catenin信號 通路實現的。YOU等［24］研究 發 現miR-766-3p在肝細胞癌（HCC）組織中表達下調，且miR-766-3p低表達與HCC TNM分期、轉移和不良預后顯著相關，過表達miR-766-3p促進了HCC增殖、遷移和侵襲，其機制與miR-766-3p靶向WNT3A并抑制其表達有關。LI等［25］研究也證實miR-26a-5p可通過靶向WNT5A抑制胃癌細胞增殖和侵襲。本研究通過Western blot檢測了兩組細胞WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達，結果顯示，實驗組WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達較對照組顯著升高（P＜0.01），提示沉默miR-8063基因導致了WNT/β-catenin信號通路激活，從而促進SW480、HT29細胞獲得MDR。

綜上，本研究顯示沉默miR-8063基因可促進CRC細胞耐藥基因P-gp、ABCG2表達，使CRC細胞SW480和HT29獲得MDR，其分子機制可能與激活WNT/β-catenin信號通路有關，為miR-8063在臨床上用于CRC分子靶向治療提供了依據。但本研究僅在體外細胞水平證實miR-8063對CRC細胞MDR的影響，體內功能驗證及MDR和WNT/β-catenin信號通路的具體調控機制還需進一步研究。