趨化因子CXCL12及其配體CXCR4、CXCR7對HER2陽性乳腺癌細胞生物學功能的影響①

蔣雅玲 胡學麗 陳 輝 段 智 劉 景 范先成（長沙市第一醫院乳甲外科，長沙 410005）

乳腺癌不僅是威脅女性健康最常見的惡性腫瘤，同樣也是女性癌癥死亡的最主要原因［1-2］。流行病學調查顯示，在過去的30年間，乳腺癌在我國的發病率以每年3%～5%的速度快速增長，且日趨年輕化，據預測，截至2021年，我國30～49歲的女性乳腺癌患者將達到220萬，相當于每10萬名女性中將新增100多例患者［3］。而在乳腺癌中，人類表皮生長因子2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性乳腺癌亞型雖然僅占乳腺癌的15%～20%，但臨床數據表明，與HER2陰性乳腺癌相比，HER2陽性乳腺癌患者具有更差的預后及更高的病死率，但造成這一現象的具體分子機制尚未完全闡明［4-5］。近年來大量研究顯示，趨化因子及其受體網絡在乳腺癌的發生發展中具有重要作用，其中趨化因子CXCL12及其受體CXCR4與CXCR7受到研究者的廣泛關注［6］。國內外大量研究報道，CXCL12、CXCR4和CXCR7在乳腺癌患者腫瘤組織中表達顯著增加，進一步研究提示，較其他類型的乳腺癌亞型相比，CXCL12、CXCR4和CXCR7蛋白在HER2陽性乳腺癌中的表達異常增加，這可能與該類型乳腺癌較差的預后相關［7-8］。然而，關于趨化因子CXCL12及其受體CXCR4和CXCR7對HER2陽性乳腺癌細胞的增殖、侵襲、遷移及上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等生物學行為尚無相關研究報道，因此，為進一步闡明CXCL12、CXCR4和CXCR7在HER2陽性乳腺癌發生發展中的作用，本實驗通過體外培養HER2陽性乳腺癌細胞BT474，并采用siRNA轉染技術單個及聯合沉默CXCR4與CXCR7，探究CXCL12-CXCR4/CXCR7網絡對乳腺癌細胞生物學行為的調控，以期為治療HER2陽性乳腺癌提供有效的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料人HRE2陽性乳腺癌細胞系BT474購自美國ATCC細胞庫；RPMI1640、含EDTA的0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、Opti-MEM（美國Gibco公司）；胰島素、CXCL12（美國Sigma公司）；CCK-8試劑（日本東仁科技公司）；TRIzol、逆轉錄試劑盒（美國Thermo公司）；SYBR Green Real-time PCR（上海索萊寶生物公司）；轉染試劑脂質體Lipofectamine3000（美國Invitrogen公司）；沉默CXCR4、CXCR7的siRNA（即si-CXCR4、si-CXCR7，廣州銳博生物科技公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術公司）；PI/RNase試劑、基質膠（美國BD Biosciences公司）；Transwell小室（8μm，美國Corning公司）；RIPA細胞裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF（南京凱基生物）；兔抗CXCR4、CXCR7（美國Santa Cruz公司）；兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-actin（美國Cell Signaling Technologies公司）；HRP標記的山羊抗兔IgG（上海碧云天生物公司）；PRPCR引物由上海生工構建；Bio Tek ELx800酶標儀（美國Bio Tek公司）；BD FACS流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染及分組

1.2.1.1 細胞培養BT474細胞培養于含15%0.1 U/ml胰島素的RPMI1640培養液中，并置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，待細胞生長至70%～80%融合時用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.1.2 siRNA轉染轉染前常規消化細胞，調整密度至5×104個/ml，培養過夜后，更換培養液為Opti-MEM，并按Lipofectamine3000說明書轉染，將si-CXCR4、si-CXCR7分別及聯合轉染至BT474細胞，并 記 為si-CXCR4、si-CXCR7和si-CXCR4+7細 胞。轉染6 h后將培養基更換為原培養液，置于上述條件的細胞培養箱中培養。取轉染12 h后的細胞進行后續相關實驗。

1.2.1.3 細胞分組按實驗目的將細胞分為5組，A組：正常培養 的BT474細 胞；B組：100 ng/ml CXCL12處理的BT474細胞；C組：100 ng/ml CXCL12處理的轉染si-CXCR4細胞；D組：100 ng/ml CXCL12處理的轉染si-CXCR7細胞；E組：100 ng/ml CXCL12處理的聯合轉染si-CXCR4與si-CXCR7細胞。上述各組細胞共同置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，如無特殊說明，培養48 h后進行后續相關實驗。

1.2.2 CCK-8實驗檢測各組乳腺癌細胞的增殖活力取生長狀態良好的BT474細胞，消化細胞后接種至96孔板，調整細胞密度為3×104個/孔，待細胞貼壁后，按1.2.1方法進行轉染及處理，置于上述條件的培養箱中培養，并分別于12 h、24 h、36 h、48 h時向每孔細胞中加入10μl的CCK-8試劑，在培養箱中繼續孵育3 h后，于酶標儀450 nm處檢測每孔吸光度值（A450）。每個時間點每組設置5個復孔，繪制細胞生長曲線。實驗單獨重復3次。

1.2.3 流式細胞術檢測各組乳腺癌細胞的周期分布常規消化上述5組乳腺癌細胞，并于4℃、70%乙醇中固定過夜，收集細胞，調整密度至3×105個/ml，并加入0.5 ml的PI/RNase充分混勻，4℃避光孵育30 min。最后流式細胞儀檢測細胞周期分布。實驗單獨重復3次。

1.2.4 劃痕實驗檢測各組乳腺癌細胞的遷移能力將5組乳腺癌細胞按5×104個/孔接種至底部劃有間隔為5 mm平行線的24孔板中，置于上述條件培養箱中培養，待細胞生長融合至80%時，垂直于底部的兩條平行線去除線條內部細胞，PBS充分沖洗，繼續培養48 h后顯微鏡下拍照觀察，并計算分析。實驗單獨重復3次。

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測各組乳腺癌細胞的侵襲能力在Transwell小室底部包被BD基質膠，室溫靜置30 min后，將無血清培養基的5組乳腺癌細胞按3×105個/ml接種于小室中。配制Transwell下室溶液，A組下室為含15%FBS的正常培養基，B～E組為含100 ng/ml CXCL12與15%FBS的正常培養基。培養48 h后，取出小室，濕棉簽擦拭小室上層未穿出細胞，無水乙醇固定后，0.1%的結晶紫染色，PBS沖洗后，倒置顯微鏡觀察穿出細胞數，每組隨機選取5個視野進行計數。實驗單獨重復3次。

1.2.6 RT-PCR檢測siRNA轉染后乳腺癌細胞中CXCR4和CXCR7的mRNA表達 水平TRIzol法 提取轉染si-CXCR4、si-CXCR7和si-CXCR4+7乳腺癌細胞中的總RNA，測定RNA純度與濃度后，逆轉錄試劑盒進行合成cDNA。RT-PCR根據SYBR Green Real-time PCR試劑說明書確定的反應時間與溫度進行。CXCR4-F：5′-CTGACTATTCCCGACTTCATCTTTG-3′，CXCR4-R：5′-CAATGTAGTAAGGCAGCCAACAG-3′；CXCR7-F：5′-CATGCAACAGCAGCGACTGCATCG-3′；CXCR7-R：5′-CAGCGATAATGGAGAAGGGAACG-3′。β-actin-F：5′-ATCACCATTGGAATGAGCGCAG-3′；β-actin-R：5′-TTGAAGGTAGTTCGTGGATCAG-3′；以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt方法進行分析。實驗單獨重復3次。

1.2.7 Western blot檢測各組乳腺癌細胞中CXCR4、CXCR7和EMT相關蛋白的表達水平取待測細胞，應用RIPA裂解液及PMSF于冰上提取細胞總蛋白，BSA定量后，取適量蛋白樣品加入1/4體積的SDSPAGE上樣緩沖液中加熱變性。取約40μg變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE分離，隨后電泳轉移至PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉后，加入抗CXCR4（1∶500）、CXCR7（1∶800）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）抗體，并置于4℃條件下孵育過夜。隨后加入HRP標記的二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，最后均勻滴加ECL發光液后于凝膠成像儀曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值。實驗單獨重復3次。

1.3 統計學分析采用SPSS19.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析及繪圖，符合正態分布的數據采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）的LSD-t進行分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞中CXCR4和CXCR7的mRNA與蛋白表達RT-PCR與Western blot結果顯示，與BT474細胞相比，轉染si-CXCR4的細胞中CXCR4 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01），轉染si-CXCR7的細胞中CXCR7 mRNA與蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01），而聯合轉染si-CXCR4+7的細胞中CXCR4和CXCR7的mRNA和蛋白表達均降低（P＜0.01），見圖1。

2.2 沉默CXCR4和（或）CXCR7對CXCL12誘導的乳腺癌細胞增殖能力的影響CCK-8增殖實驗結果顯示，與A組乳腺癌細胞相比，B組、C組和D組細胞的增殖活力均顯著增強（P＜0.05或P＜0.01），其中以B組的增強趨勢最為明顯（P＜0.01），而E組細胞增殖活力明顯減弱（P＜0.05）；與B組細胞相比，C組、D組及E組細胞的增殖活力均明顯減弱（P＜0.05或P＜0.01），其中以E組細胞的減弱趨勢最為顯著（P＜0.01）；與C組或D組相比，E組細胞增殖活力明顯減弱（P＜0.05），前兩組間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖1 轉染siRNA后各組細胞中CXCR4和CXCR7的mRNA與蛋白表達Fig.1 mRNA and protein expressions of CXCR4 and CXCR7 in cells transfected with siRNA in each group

2.3 沉默CXCR4和（或）CXCR7對CXCL12誘導的乳腺癌細胞周期進展的影響流式細胞術檢測結果顯示，與A組乳腺癌細胞相比，B組、C組和D組細胞處于G1期的細胞比例均明顯降低（P＜0.05），S+G2期的細胞比例均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），其中以B組細胞S+G2期的細胞比例升高趨勢最為明顯（P＜0.01），而E組處于G1期的細胞比例明顯升高（P＜0.05），S+G2期細胞比例明顯降低（P＜0.05）；與B組相比，C組與D組S+G2期的細胞比例明顯降低（P＜0.05），處于G1期的細胞比例無明顯變化（P＞0.05），而E組處于G1期的細胞比例均明顯升高（P＜0.05），S+G2期的細胞比例明顯降低（P＜0.01）；與C組或D組相比，E組G1期的細胞比例明顯升高（P＜0.05），S+G2期的細胞比例明顯降低（P＜0.01），前兩組的細胞周期分布無明顯變化（P＞0.05），見圖3。

2.4 沉默CXCR4和（或）CXCR7對CXCL12誘導的乳腺癌細胞遷移能力的影響劃痕實驗結果顯示，與A組乳腺癌細胞相比，B組、C組和D組細胞的遷移能力均明顯增強（P＜0.05或P＜0.01），其中以B組細胞的遷移能力增強最為明顯（P＜0.01），而E組細胞遷移能力明顯降低（P＜0.05）；與B組細胞相比，C組、D組、E組細胞的遷移能力均明顯減弱（P＜0.05或P＜0.01），且以E組細胞的減弱趨勢最為明顯（P＜0.01）；與C組或D組相比，E組細胞的遷移能明顯減弱（P＜0.05），而前兩組間細胞遷移能力差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

2.5 沉默CXCR4和（或）CXCR7對CXCL12誘導的乳腺癌細胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實驗結果顯示，與A組乳腺癌細胞相比，B組、C組和D組細胞的侵襲能力均顯著增強（P＜0.05或P＜0.01），其中以B組細胞的侵襲能力增強最為顯著（P＜0.01），而E組細胞的侵襲能力明顯減弱（P＜0.05）；與B組細胞相比，C組、D組、E組細胞的遷移能力均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），且以E組細胞降低最為顯著（P＜0.01）；與C組或D組相比，E組細胞的侵襲能明顯減弱（P＜0.05），而前兩組間細胞侵襲能力差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖2 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12對乳腺癌細胞增殖的促進作用Fig.2 Silencing CXCR4 and/or CXCR7 inhibited proliferation promoting effect of CXCL12 on breast cancer cells

圖3 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12對乳腺癌細胞周期進展的促進作用Fig.3 Silencing of CXCR4 and/or CXCR7 inhibited promotion of CXCL12 on breast cancer cell cycle progression

圖4 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12對乳腺癌細胞遷移能力的促進作用Fig.4 Silencing of CXCR4 and/or CXCR7 inhibited migration promoting effect of CXCL12 on breast cancer cells

2.6 沉默CXCR4和（或）CXCR7對CXCL12誘導的乳腺癌細胞EMT能力的影響Western blot結果顯示，與A組乳腺癌細胞相比，B組、C組和D組細胞中E-cadherin表 達 水 平 均 顯 著 降 低（P＜0.01或P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），而E組細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水均無明顯變化（P＞0.05）；與B組細胞相比，C組和E組中E-cadherin表達水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），且以E組上述蛋白的變化趨勢最為明顯（P＜0.01），但D組細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平均無明顯變化（P＞0.05）；與C組相比，E-cadherin表達水平在D組中明顯減少（P＜0.05），而在E組中明顯增加（P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平在D組中明顯增加（P＜0.05），而在E組中明顯減少（P＜0.05），見圖6。

圖5 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12對乳腺癌細胞侵襲能力的促進作用Fig.5 Silencing CXCR4 and/or CXCR7 inhibited invasion ability promotion effect of CXCL12 on of breast cancer cells

圖6 沉默CXCR4和（或）CXCR7對CXCL12誘導的乳腺癌細胞EMT能力的影響Fig.6 Effect of silencing CXCR4 and/or CXCR7 on EMT ability of CXCL12-induced breast cancer cells

3 討論

目前，臨床針對HER2陽性乳腺癌的主要治療手段為手術、放療、化療等，其中針對分子表型進行的靶向化療已成為臨床治療的一種重要方式。迄今為止，以抗HER2單克隆抗體曲妥珠單抗為首的靶向化療藥物方案是HER2陽性乳腺癌患者的重要治療策略，然而，臨床觀察發現，經曲妥珠單抗治療治療一段時間后，約50%的患者會產生藥物不敏感，即耐藥現象［9-10］。因此，亟待尋求新的潛在靶點以提供更為有效的治療方法。

趨化因子屬于小分子蛋白類的細胞因子超家族，能夠與G蛋白偶聯受體相互作用，進而誘導細胞骨架的重排、黏附及定向遷移等行為。研究顯示，趨化因子CXCL12高表達于淋巴結、肝臟、肺等多種組織與器官中，且能夠趨化表達其受體的乳腺癌細胞優先轉移至上述器官［11-12］。此外，CXCL12在乳腺癌細胞中的高表達與腫瘤的侵襲、轉移及不良預后均有關［13］。CXCR4是最早發現的CXCL12受體，其為G蛋白偶聯受體，能夠通過不同的G蛋白亞基激活多條下游信號通路，從而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、EMT等生物學功能［14］。研究表明，CXCR4在乳腺癌組織中持續表達，且CXCL12對表達CXCR4陽性的乳腺癌細胞具有較強的趨化作用，能夠誘導腫瘤的特異性遷移，故CXCR4與原發性乳腺癌的轉移密切相關［12，15］。CXCR7是CXCL12新發現的另一個受體，研究顯示，CXCR7主要表達于原發腫瘤組織的血管系統，推測其可能通過促進腫瘤細胞對纖維蛋白和內皮細胞的黏附，從而促進腫瘤的發展及轉移［16］。同時，數據表明高表達CXCR7能夠增強乳腺癌細胞的黏附、侵襲和血管生成能力，在體內可促進腫瘤生長［17］。

本研究結果顯示，通過siRNA感染技術單獨沉默HER2陽性乳腺癌細胞BT474中的CXCR4與CXCR7均可顯著抑制CXCL12對乳腺癌增殖、細胞周期進展、遷移及侵襲能力的促進作用，說明CXCR4與CXCR7在腫瘤的增殖、遷移及侵襲能力上發揮對等的促進作用，而聯合沉默CXCR4、CXCR7表達能最大程度地抑制CXCL12對腫瘤細胞上述惡性行為的促進。這與CXCR12-CXCR4/CXCR7網絡對三陰性乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲等行為的調控具有一致性［18］。但在EMT的檢測實驗中發現，單獨或聯合沉默CXCR4后，CXCL12對乳腺癌細胞EMT的誘導能力被極大削弱，而單獨沉默CXCR7對CXCL12 EMT誘導能力的減弱作用沒有沉默CXCR4明顯，提示在BT474細胞中，CXCL12可能主要通過與受體CXCR4相互作用促進乳腺癌的EMT行為。結合研究CXCL12-CXCR4/CXCR7網絡對其他腫瘤細胞EMT調控的相關報道發現，CXCR4與CXCR7對CXCL12的這一作用的相應功能并非完全一致，其中CXCR7介導腫瘤細胞EMT的過程可能具有嚴格的環境特異性與細胞類型特異性。如在卵巢癌中，CXCL12誘導的EMT現象能夠被CXCR4抑制劑所拮抗，而不能被CXCR7抗體抑制［19］。同樣在胰腺癌中，CXCL12主要與CXCR4結合，通過非經典Hedgehog途徑促進腫瘤細胞的EMT［20］；但在肺癌中主要為CXCR7參與TGF-β誘導的EMT行為［21］。上述結果表明，CXCL12-CXCR4/7對HER2陽性乳腺癌細胞增殖、細胞周期進展、遷移和EMT行為的調控具有一定的差異性。

綜上，研究發現沉默CXCR4或CXCR7表達均可抑制CXCL12對HER2陽性乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和細胞周期進展的促進功能，但CXCL12主要通過與CXCR4相互作用來促進乳腺癌的EMT行為，而同時抑制CXCR4或CXCR7能更有效地抑制CXCL12的上述功能。本實驗進一步揭示了CXCL12及其受體CXCR4與CXCR7在HER2乳腺癌中的具體作用，為HER2乳腺癌的治療提供了潛在作用靶點，但其具體機制仍有待進一步研究。