響應(yīng)面法優(yōu)化聚酰胺層析純化煙草綠原酸的工藝研究

陳月星，李亞文，張梅娟

(商洛學(xué)院，陜西 商洛 726000)

煙草種植與加工在我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1-2]，基于廢次煙草的循環(huán)利用和綠原酸產(chǎn)業(yè)需求，擬采用響應(yīng)面法，對(duì)煙草綠原酸純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

廢次煙葉(商洛市煙草公司提供)。

1.2 試劑

95%乙醇、乙酸、氫氧化鈉、纖維素酶(食品級(jí))、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈、無水甲醇、聚酰胺樹脂。

1.3 儀器與設(shè)備

電子分析天平(BS110)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9030A)、恒溫水浴鍋(HH-4)、微型粉碎機(jī)(FW80)、pH 計(jì)(PHS-3C)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE52-99)、真空抽濾機(jī)(CM- 2002)、高效液相色譜儀(TDP-009)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品預(yù)處理

參照李亞男等[3]的方法進(jìn)行綠原酸粗品提取。

1.4.2 聚酰胺層析法對(duì)煙草綠原酸純化工藝流程

取100 mL綠原酸粗品傾入裝有預(yù)處理好的聚酰胺樹脂層析柱→乙醇洗脫→真空干燥得到綠原酸純品→聚酰胺回收再生。

1.4.3 高效液相色譜法測(cè)定綠原酸方法的建立

樣品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取一定量的綠原酸粗品置入25 mL容量瓶中，用80%的甲醇水溶液溶解定容至刻度，充分混合后經(jīng)濾膜過濾后待測(cè)。

色譜條件。HPLC檢測(cè)條件：流動(dòng)相A為0.5%的乙酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，柱溫為35℃，柱流量為1 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL，梯度洗脫為0～10 min A90%、B10%，10～15 min A59%、B41%，15～20 min A90%、B10%，檢測(cè)波長為327 nm。色譜柱型號(hào)及參數(shù)為ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。精確稱取10 mg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分別置于25 mL容量瓶用甲醇定容到刻度。用高效液相色譜儀檢測(cè)稀釋液峰面積，以綠原酸的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，以此來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 聚酰胺柱層析法純化綠原酸單因素實(shí)驗(yàn)

聚酰胺柱層析基準(zhǔn)工藝：用30 mL濃度為8 mg/mL的吸附液上80～100目聚酰胺柱(16×300 mm)進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，用2.5 BV 45%的乙醇來進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，測(cè)定不同洗脫液濃度中的綠原酸含量，計(jì)算解吸附率。

在以上工藝基礎(chǔ)上，對(duì)上柱液濃度、洗脫液濃度和用量(BV)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，因素及水平如表1所示。

表1 單因素及其水平表Tab.1 Single factors and their levels

1.4.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6軟件、Box-Behnken法設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，獲得聚酰胺層析法純化煙草綠原酸的最優(yōu)工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，回歸方程為y=154.99x-2.329 8，R2=0.999 9，表明綠原酸在0.2～1 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

經(jīng)分析，各因素最佳水平分別為：上柱液濃度為8 mg/mL、洗脫液濃度60%和洗脫液體積2.5 BV，因此確定上樣液濃度6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，洗脫液濃度50%、60%和70%，洗脫液體積1.5 BV、2.5 BV和3.5 BV進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，其中A0B0C0組合解析率最高為92.97%。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果Tab.2 Box-Behnken test protocol and results

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型分析

建立以上柱液濃度X1、洗脫液濃度X2、洗脫液體積X3為自變量，解吸附率 Y為因變量的回歸模型，回歸方程

Y=91.55+1.48X1+1.68X2+2.3X3+0.78X1X2+2.02X1X3-2.59X2X3-10.2X12-8.38X22-5.79X32

由表3可以得到，F(xiàn)值為61.2，P值<0.000 1的模型，表明該模型具有高度的顯著性。決定系數(shù)R2=0.994 3，表明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值吻合度極高，可以解釋99.43%的響應(yīng)值變化，R2=0.997 5有合理的一致性，失擬相P值0.736 2>0.05，不顯著，說明該二次方程與真實(shí)響應(yīng)面擬合度較高，模型成立。回歸模型中C、BC、A2、B2、C2都達(dá)到影響極顯著(P<0.01)，A、B、AC影響顯著(P<0.05)，說明各個(gè)影響因素對(duì)解吸附率具有顯著的影響。變異系數(shù)C.V%值為1.61，比較穩(wěn)定。說明可以使用該模型對(duì)煙草綠原酸的純化工藝優(yōu)化做出合理的分析和評(píng)估。

表3 回歸模型統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.3 Statistical results of regression model

各個(gè)單因素對(duì)解吸附率的影響從大到小依次為C(洗脫液用量)>B(洗脫液濃度)>A(上柱液濃度值)，AB交互作用不顯著，AC、BC交互作用分別達(dá)到顯著和極顯著水平。

2.3.3 工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面模型的分析，得到最佳純化工藝參數(shù)為上柱液濃度為8.13 mg/mL，洗脫液濃度為61.49%的乙醇，用量為2.71 BV。此條件下，解吸附率為91.52%。

2.3.4 最佳工藝參數(shù)結(jié)果驗(yàn)證

因響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果得到的綠原酸解吸附率為91.52%，低于響應(yīng)面試驗(yàn)組合A0B0C0，故以響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果工藝(W1)、A0B0C0工藝(W2)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為了方便實(shí)驗(yàn)，將響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果整合為上柱液濃度為8.1 mg/mL，洗脫液濃度為61%，用量為2.7 BV，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Tab.4 Analysis of confirmatory experiment results

由表4可知，W1比W2平均解吸附率較高，因此最佳純化工藝參數(shù)為上柱液濃度8.1 mg/mL，洗脫液濃度61%，用量2.7 BV。

3 結(jié)論與討論

以廢次的煙葉為研究對(duì)象，采用聚酰胺柱層析法對(duì)煙草綠原酸提取液進(jìn)行純化工藝研究，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，最終確定優(yōu)化工藝為上柱液濃度8.1 mg/mL，洗脫液濃度61%，用量2.7 BV，此條件下，解吸附率為91.9%。但是，聚酰胺層析法純化煙草綠原酸，在提高綠原酸純度的同時(shí)存在高成本、高耗時(shí)等問題，因此對(duì)于如何降低廢次煙葉中高純度綠原酸提取成本的問題將是下一步的研究重點(diǎn)。