花椒樹腐朽病病原菌鑒定及其生防菌劑篩選

梁巧蘭,魏列新,徐秉良,吳 瓊

(甘肅農業大學 植物保護學院,甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室,蘭州 730070)

花椒Zanthoxylum bungeanumMaxim 是蕓香科Rutaceae花椒屬ZanthoxylumL.多年生香料和油料樹種,葉片和果實都有揮發性油和脂肪,可作食物香料和香精原料,具有一定的醫療作用[1-2],并可用于糧食貯存期間病害防治及制作香皂、肥皂和工業油漆等的原料[3-5];花椒樹根系發達,能夠固土和耐干旱,是優勢生態林經濟樹種之一[6]。因其良好的經濟、社會和生態效益,花椒已成為甘肅經濟支柱產業[7]。近年來,隨著花椒產業和種植面積的不斷發展,花椒病害發生嚴重,已成為限制花椒生產的主要因素。2018年5月,在甘肅省永靖縣三塬鎮調查發現,花椒主要病害有干腐病、流膠病和腐朽病等,其中腐朽病發生最重[8]。已有報道表明,花椒樹腐朽病是由裂褶菌(Schizophyllum commune)引起的[9-10],該菌可引起花椒樹樹皮腐爛,而對于樹桿上無子實體的潰瘍斑是否由裂褶菌侵染所致及其生物學特性和生物防治等尚未見系統研究。為此,對引起甘肅省花椒樹腐朽病病原物進行分離純化鑒定及生物學特性研究;同時針對病原菌進行生物農藥室內篩選,旨在探明引起花椒樹腐朽病病原菌種類及影響發病的因素;同時,為指導利用生物農藥有效防治花椒病害提供依據。

1 材料與方法

1.1 花椒病害發生情況調查及病樣采集

2018年5月7-12日,在甘肅省永靖縣三塬鎮花椒園內,采用5點取樣調查法,依據表1分級標準[11],按照東、西、南、北4個方向分別對花椒樹主桿及枝條上腐朽病病害發生情況進行調查,每個點調查10株,共調查50株,每個方向調查3個枝條,采用“十字”交叉法測量病斑長徑和短徑,按下列公式計算發病株率和病情指數。同時,采集病樣帶回實驗室,備用。

表1 花椒樹腐朽病病害分級標準Table 1 Grading standard of decay disease on Zanthoxylum bungeanum

發病率=病株數/調查總株數×100%

病情指數=∑(病級株數×代表數值)/(調查總株數×發病最高級代表數值)×100

1.2 病原菌分離純化及鑒定

1.2.1 病原菌分離純化 將采集具有子實體的腐朽病枝條和具有腐爛病斑、無子實體的花椒樹枝條分別放置在不同容器中,用清水沖洗干凈,再用流水沖洗2 h,沖掉表面腐生菌,然后用0.1%升汞溶液表面消毒30 s,無菌水清洗后,取子實體、腐爛病斑邊緣樹皮分別放在鋪有3層無菌濕濾紙的培養皿里,置于25 ℃、L/D 為12 h/12 h(2 200 lx)光照培養箱中保濕培養,直至子實體、樹皮上長出菌絲,挑取菌絲接種到PDA 培養基,待長出菌絲后,及時挑取菌絲塊轉接到新的PDA平板上純化培養,連續純化3次后,將子實體彈射在培養皿蓋上的孢子用滅菌水洗下懸浮在離心管中,通過顯微鏡觀察將孢子懸浮液濃度調整為1×105個/m L),將孢子懸浮液稀釋100 倍后倒入2%瓊脂培養基表面(厚度0.5mm),轉動培養皿當孢子懸浮液布滿整個表面后,將多余的孢子懸浮液倒掉,用滅菌的解剖刀將瓊脂培養基切割成1 mm×1 mm 大小的瓊脂塊,然后將瓊脂塊挑到滅菌的載玻片上,置于顯微鏡下進行觀察,將有單個孢子的瓊脂塊接種在PDA 培養基上進行單孢分離培養[12],觀察菌落形態并將單孢分離純化的菌落4 ℃斜面保存,備用。

1.2.2 分離物致病性測定 參考周儀等[13]及張祥林等[14]的方法,略有改進,從生長健康的花椒樹上剪取長20 cm、直徑1 cm 左右枝條,用自來水沖洗干凈后,分成2組,每組20根,共40根,其中1組用燒紅的鐵釘對枝條進行燙傷處理,另1組不做燙傷處理,在超凈工作臺上用75%酒精對3組枝條進行表面消毒后分別接種病斑分離的菌餅、孢子(孢子獲得和濃度同“1.2.1”)和子實體分離菌餅,以接種PDA 培養基為對照,每個處理重復5次,枝條兩端用無菌濕棉球保濕,然后放入墊有濕濾紙的培養皿中,培養條件同“1.2.1”。定期觀察接種枝條的發病狀況,對所有接種發病的枝條從病斑處分離病原菌,并觀察培養形態、菌絲和孢子與原分離菌是否一致。

1.2.3 病原菌鑒定 采用形態學和分子生物學兩種方法對病原菌進行鑒定。通過觀察菌落形狀、菌絲和孢子形態結構,結合《植物病原真菌學》[15]進行病原菌鑒定。

按照真菌DNA 提取試劑盒說明,以菌絲為材料提取DNA,利用真菌通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進 行ITS序列擴增,PCR 擴增反應體系(25μL):12.5μL mix,9.5μL dd H2O,1μL上游引物,1μL下游引物,1μL cDNA 模板。PCR 反應條件:94 ℃初始變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30 個循環,再72 ℃延伸5 min。擴增產物由西安擎科有限公司進行測序,測序結果在GenBank 上進行Blastn 同源性比對,利用MEGA7軟件采用Neighbor-joining法構建系統發育樹并分析結果[16]。

1.3 病原菌生物學特性

1.3.1 不同培養基對花椒腐朽病病原菌菌絲生長的影響 制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)[12]。在PDA 組成的基礎上分別用花椒樹皮、花椒葉、花椒枝條各200 g,代替200 g馬鈴薯,制作成花椒樹皮、花椒葉及花椒枝條煎汁培養基,高溫滅菌后倒入滅菌培養皿中,冷卻凝固后,分別接入用直徑為5 mm 打孔器在病原菌菌落邊緣打取的菌餅,每個處理重復3次,放置于25 ℃恒溫培養箱中,4 d后觀察菌落生長情況,“十字”交叉法測定菌落直徑。

1.3.2 不同溫度對花椒樹腐朽病原菌菌絲生長的影響 選用“1.3.1”中病原菌生長最適培養基,制備成平板并接種病原菌(方法同“1.3.1”),然 后 分 別 放 置 于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的培養箱中,4 d后“燙十字”燙交叉法測菌落直徑。

1.3.3 不同濕度對花椒樹腐朽病病原菌菌絲生長的影響 使用“1.3.1”中病原菌生長最適培養基,制備成平板,并接種病原菌(方法同“1.3.1”),放置于25 ℃、相對濕度為50%、60%、70%、80%、90%光照培養箱中,每個處理重復3 次,4 d后采用“燙十字”燙交叉法測量菌落直徑。

1.3.4 不同p H 對花椒腐朽病病原菌菌絲生長的影響 分別用濃度為0.1 mol/L 的HCl和NaOH 溶液調節,制成p H 分別為5、6、7、8、9、10的平板,接種病原菌(方法同“1.3.1”),置于25 ℃、適宜相對濕度、光照度的培養箱中培養,4 d后“燙十字”燙交叉法測量菌落直徑。

1.3.5 裂褶菌對花椒樹的侵染過程 分別選用菌蓋培養的菌絲、病斑分離菌的菌絲和孢子(孢子獲得和濃度同“1.2.1”),通過有傷接種健康的花椒枝條后,置于溫度30 ℃、相對濕度70%的培養箱中,逐天觀察發病情況。

1.4 花椒樹腐朽病病原菌室內生物農藥篩選及毒力測定

1.4.1 幾種生物農藥對裂褶菌抑制作用測定采用生長速率法,將藥劑的推薦濃度擴大50 倍(表2)用無菌水配制成溶液,取1 m L藥劑加到滅菌冷卻至45 ℃左右的49 m L PDA 培養基中,搖勻,倒入4 個培養皿中制成含藥培養基,以只加1 m L無菌水的PDA 培養基為對照,然后接種病原菌,置于25 ℃培養箱中培養,4 d后“燙十字”燙交叉法測量菌落直徑,并按下式計算藥劑抑菌率,供試藥劑種類及濃度見表2。

表2 供試藥劑及推薦使用濃度Table 2 Tested fungicide and its recommended concentration

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-5 mm)×100%

1.4.2 幾種藥劑對裂褶菌室內活性測定 參考殺菌劑室內毒力測定方法,以各藥劑推薦濃度為最高濃度,按照對半稀釋法用滅菌水將上述供試藥劑分別稀釋成5個濃度梯度,采用“1.4.1”中的方法制備不同濃度含毒PDA 平板,接菌培養、測量菌落直徑,計算藥劑抑菌率,然后將藥劑濃度轉化為對數值,為橫坐標,再將抑菌率轉化為機率值,為縱坐標,求出毒力回歸方程和EC50。

1.5 數據分析

采用Excel2010和MEGA7軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 花椒病害發生情況調查

調查發現甘肅省永靖縣三塬鎮花椒園區內花椒樹腐朽病發生嚴重,發病病株率高達77.50%,病情指數為29.00,該病害主要危害花椒樹主干,尤其在疏剪、除孽后的傷口、枝干壁裂和芽眼處,受害部位的樹皮開始慢慢開裂、脫落、腐朽、直至裸露,枝干由外向內不斷干枯腐爛,形成大小不一的潰瘍斑,最大的潰瘍斑長度可達120 cm,危害嚴重的枝條整枝枯死,上面布滿白色或灰白色的蘑菇狀子實體,呈重疊狀群生于樹桿皮層上;同時還發現有的椒樹枝條也出現潰瘍斑,但其上并沒有裂褶菌的子實體(圖1)。在剪鋸口、昆蟲危害孔處長滿子實體,有的未見子實體,但樹皮腐朽脫落,露出木質部,形成大小不一的長條狀潰瘍斑,導致樹勢衰弱,品質下降,產量降低,樹體老化,壽命縮短,嚴重時椒樹干枯死亡。

圖1 花椒樹腐朽病癥狀Fig.1 Symptoms of decay disease of Zanthoxylum bungeanum tree

2.2 花椒樹腐朽病病原菌分離純化及鑒定

2.2.1 分離純化 花椒枝條上裂褶菌子實體經保濕培養獲得純化菌(圖2-A);從沒有子實體的花椒枝條潰瘍斑上共分離純化到3種菌,經過形態學觀察,分別是腐皮鐮刀菌(Fusarium solaniMart.)、鏈格孢(Alternaria alternata)和一種未知菌(編號為Z1),其分離頻率分別為20%、25%和80%。Z1單孢分離純化菌培養發現菌落初期呈白色,輻射狀向外生長,并伴有蘑菇的氣味,培養一段時間后菌落表面產生大小不等的菌絲柱,在其頂部產生扇形的子實體,培養后期在子實體頂部培養皿蓋上產生與子實體菌蓋大小相同的淡黃色孢子印(圖2-B)。

圖2 病原物形態圖Fig.2 Morphology of pathogens

2.2.2 Z1分離菌致病性 經致病性測定發現,分離菌Z1菌絲、孢子懸浮液接種于有傷口的花椒枝條上第5天時均能夠侵染發病,且癥狀和裂褶菌子實體上分離到的菌絲的致病癥狀相同,將發病枝條上的菌絲清洗干凈后,從枝條的病健交界處分離到與最初分離的Z1、裂褶菌子實體分離菌相同的病原菌(圖3-A,3-B,3-C),無傷接種第5天時均未發病。

圖3 分離菌Z1致病性測定Fig.3 Pathogenicity test of Z1 strain isolated from Zanthoxylum bungeanum tree

2.2.3 病原菌Z1的鑒定 Z1病原菌在PDA 上為輻射狀白色菌落,隨著培養時間的增加菌落上產生大小不等且傾斜向上生長的菌絲柱,菌絲柱頂端有凹陷小孔,呈珊瑚狀,頂端慢慢膨大,在邊緣形成幾條菌褶,最后頂端張開,形成長約0.4～1.4 cm、寬約0.2～1.4 cm 菌褶朝上的子實體,菌蓋圓形或扇形,外緣向內卷,有多個裂瓣,初形成時菌褶較密,等長或不等長,從基部輻射而出,呈白或灰白色,后期變為深褐色、灰褐色或黃褐色(圖4-A～4-G),并在菌蓋上部的培養皿蓋上彈射出與其相同大小的擔孢子堆,孢子印白色(圖4-H),孢子形態為單孢無色,棍棒狀,一端有一斜角,大小為11.81μm×6.62μm(圖4-I);挑取菌絲進行顯微觀察,菌絲有隔、分支狀,粗細不一,在近隔膜處形成鎖狀聯合,菌絲外著生小梗細棍棒狀,為針狀體,未見分生孢子,偶見菌絲膨大;菌絲粗細不均(圖4-J～4-L);發現該菌根據病原菌的形態特征及培養性狀,將引起花椒枯枝病的病原菌初步鑒定為裂褶菌Schizophyllum communeFranch.。

圖4 Z1菌株形態特征Fig.4 Morphological characteristics of Z1 strain

通過PCR 擴增得到1條長度為602 bp的片段,通過序列同源性比對發現Z1 分離菌與裂褶菌Schizophyllum communeFranch的同源性達到99%,結合形態學特征,進一步將該菌鑒定為擔子菌門(Basidiomycotina)、層 菌 綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、裂褶菌科(Schizophyllaceae)、裂褶菌屬(Schizophyllumsp.)、裂 褶 菌(Schizphylhls commneFranch),GenBank序列號為MT251888.1(圖5)。

圖5 花椒樹腐朽病病原菌系統發育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of pathogen of Zanthoxylum bungeanum tree decay disease

2.3 花椒樹腐朽病病原菌生物學特性

2.3.1 不同培養基對裂褶菌生長的影響 裂褶菌在不同種類培養基上均能生長,且生長速度存在明顯差異。其中在花椒枝條煎汁培養基上菌落生長最快,第4天時菌落直徑最大,為67.2 mm;PDA 培養基和花椒葉煎汁培養基次之,菌落直徑分別為58.3 mm 和58.0 mm,花椒樹皮煎汁培養基生長最慢,菌落直徑僅為44.3 mm,除PDA培養基和花椒葉煎汁培養基菌落直徑之間差異不顯著外,其他培養基菌落直徑之間差異極顯著(圖6)。

圖6 裂褶菌在不同培養基上的生長情況Fig.6 Growth of S.commune on different medium

2.3.2 溫度對裂褶菌生長的影響 溫度對病原菌生長狀況影響顯著,在15～35℃裂褶菌均可生長,且在10～30℃,菌落生長速度與溫度成正比,溫度越高菌落生長越快,不同溫度下培養4 d時,10 ℃下菌落直徑僅為10.7 mm,30 ℃下菌落直徑最大,為58.7 mm,其他溫度的菌落直徑介于二者之間,且存在極顯著差異;當溫度超過最適溫度(30 ℃)后,菌落生長速度開始下降,35 ℃的菌落直徑為41.3mm,與20 ℃的菌落直徑之間異顯著差(圖7)。

圖7 不同溫度下裂褶菌生長情況Fig.7 Growth of S.commune under different temperatures

2.3.3 濕度對裂褶菌生長的影響 裂褶菌在相對濕度為50%～90%時均能生長,當相對濕度在50%～70%時,菌落生長速度隨著濕度的增加而增大,且在相對濕度為70%時菌落生長最快,直徑最大,為58.6mm,在相對濕度在70%～90%時,菌落生長速度隨濕度的增加而減小;除相對濕度為60%和80%時菌落直徑之間差異顯著外,其余相對濕度下菌落直徑之間均存在極顯著差異(圖8)。

圖8 不同濕度下裂褶菌生長情況Fig.8 Growth of S.commune under different humidity

2.3.4 p H 對裂褶菌生長的影響 裂褶菌在p H為5～10的培養基上均能生長,在p H 為7的培養基上菌落生長最快,第4 天菌落直徑為34.0 mm;p H 為10時,菌落生長最慢,其直徑為21.0 cm,其余p H 條件下菌落直徑介于二者之間,除p H 為6和7時菌落直徑之間差異不顯著外,與其他p H 條件下的菌落直徑之間差異極顯著(圖9)。

圖9 不同p H 條件下裂褶菌生長情況Fig.9 Growth of S.commune under under different p H conditions

2.3.5 裂褶菌對花椒樹的侵染過程 觀察置于溫度30 ℃、相對濕度70%的培養箱中的有傷接種菌蓋培養的菌絲、病斑分離菌的菌絲和孢子的花椒枝條,發現在該適宜條件下2 d后裂褶菌兩種菌絲接種的部位均產生茂密的白色菌絲且菌絲向無傷的樹皮擴展,5 d后菌絲擴展至整個枝條,15 d后菌絲更加茂密,且菌絲柱產生,25 d后菌絲柱進一步形成子實體原基;而接種孢子懸浮液的枝條2 d后僅在接種部位產生稀疏的菌絲,5 d后菌絲向四周擴展,擴展面積為接種面積的1.5倍,15 d后菌絲擴展至整個枝條,有少量的菌絲柱產生,25 d后菌絲茂密,菌絲柱變大,但未見子實體原基(圖10)。

圖10 花椒樹腐朽病病原菌侵染過程Fig.10 Infection process of S.commune on Zanthoxylum bungeanum tree

2.4 室內生物藥劑篩選及活性測定

研究結果表明,4種生物農藥對裂褶菌均具有較強的抑菌作用,在推薦使用濃度下6%寡糖鏈蛋白、哈茨木霉和深綠木霉的抑菌率分別為99.99%、100%和100%,與1 500 g/m L 80%嘧霉胺的抑菌率相同,且高于667 g/m L 30%氟菌唑的抑菌率;1 000億/g枯草芽孢桿菌的抑菌率較低,為83.39%,毒力測定結果表明,80%嘧霉胺活性最強,EC50值為30.45μg/m L,1 000億/g枯草芽孢桿菌的活性最低,為486.46μg/m L,其他3種生物農藥和30%氟菌唑的EC50值介于二者之間(表3,表4)。

表3 4種生物農藥對裂褶菌抑制作用Table 3 Inhibition of four kinds of biological pesticides on S.commune

表4 4種生物農藥對裂褶菌的活性測定Table 4 Activity determination of four biological pesticides against S.commune

3 討論

通過對花椒樹腐朽病病原菌形態學鑒定發現,該病原菌菌落的形狀、顏色、菌絲的菌鎖結構和針狀體、孢子及子實體以及分子鑒定均表明該菌為裂褶菌Schizophyllum communeFranch;在自然寄主及人工培養基上S.communeFr.均為有性型,未發現無性型。裂褶菌是一種兼性寄生真菌,既能腐朽枯立木和倒木,也能侵染活立木[17]。在傷口處和主桿有腐爛斑的地方侵染率極高[18],可以引起木材白色腐朽[19-21]、蘋果樹腐爛病、桃樹腐朽病,發病率高達100%,且樹齡越長發病率越高[22];本研究也發現該病原菌在樹勢弱、剪鋸口和腐爛斑多的花椒樹主桿和大枝上發生嚴重。

目前,對于花椒樹腐朽病主要采用化學農藥通過防治天牛等蛀桿昆蟲,減少傷口,減輕該病害的發生,在防治核桃裂褶菌病害時,主要采用涂抹劑防治核桃潰瘍病的發生,尚未見直接針對裂褶菌進行防治的化學藥劑和生物藥劑的研究報道[8,17],選用生物藥劑防治花椒樹腐朽病對減輕裂褶菌的危害,降低化學農藥殘留污染、提高花椒品質具有重要意義,在室內篩選出對花椒樹腐朽病菌具抑菌作用且與兩種化學農藥80%嘧霉胺和30%氟菌唑相同或略高,抑菌活性較高的3種生物農藥,分別為6%寡糖鏈蛋白、哈茨木霉和深綠木霉。但是,本研究僅對分離獲得的主要分離菌進行了致病性測定,而對另外兩種菌是否具有致病性,與裂褶菌之間的協同關系,以及3種生物藥劑在田間對花椒樹腐朽病的防治等問題尚未涉及,還有待進一步研究。

4 結論

花椒樹樹桿腐朽病在甘肅省永靖縣三塬鎮10 a樹齡的花椒樹上發生嚴重,平均發病率約為77.50%,病情指數為29.00,枝條上枯斑面積最大可達240 cm2,將引起該病害的主要病原菌鑒定為Schizophyllum communeFranch,病原菌生長的最適培養基為花椒枝條煎汁葡萄糖瓊脂培養基,最適條件為30 ℃、相對濕度70%、p H7,菌絲比孢子侵染寄主快10 d,在菌絲侵染寄主第15天時產生菌絲柱,第25天時菌絲柱進一步形成子實體原基,接著產生子實體;篩選出3種對Schizophyllum communeFr.抑菌活性較高的生物農藥——6%寡糖鏈蛋白、哈茨木霉和深綠木霉。