血清miR-483-5p miR-487b表達與膿毒癥所致急性肺損傷患者炎性因子病情和預后的關系研究

戴 梅， 王 麗， 沙 丹， 張 薇， 王 昕， 雷育軍

(1.長江大學附屬仙桃市第一人民醫院, 湖北 仙桃 433000 2.武漢金域醫學檢驗所有限公司， 湖北 武漢 430000)

膿毒癥是宿主對感染反應失調引起的危及生命的器官功能障礙，膿毒癥誘導的全身炎癥反應可損害組織和器官功能，其中肺是最易受累的器官之一，表現為肺部大量中性粒細胞浸潤，細胞因子、趨化因子和活性氧等過度產生，引起不可控的炎癥反應和急性肺損傷(acute lung injury，ALI)[1]。過度炎癥反應是ALI發病的主要病理基礎，炎癥反應可破壞肺泡-毛細血管屏障，導致肺水腫和氣體交換嚴重受損[2]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)是天然存在的、高度保守的轉錄物家族，主要通過促進信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)降解或抑制 mRNA 翻譯來調節基因表達，涉及細胞發育、分化和信號傳導的各種過程，部分miRNA 參與B 細胞、T 細胞和樹突細胞分化和炎癥反應調節[3]。miR-483-5p可調節其靶基因-細胞因子信號通路抑制因3促使細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和單核細胞趨化蛋白-1的分泌[4]，miR-487b可靶向白細胞介素-33(interleukin-33，IL-33)抑制巨噬細胞激活，繼而抑制IL-33誘導的抗原呈遞細胞、共刺激分子以及促炎介質的表達，發揮抗炎作用[5]。miR-483-5p、miR-487b與膿毒癥所致ALI的報道十分少見，鑒于此，本研究擬探討miR-483-5p、miR-487b與膿毒癥所致ALI的關系，以期為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選擇2018年9月至2021年12月我院收治的133例膿毒癥患者，納入標準：①膿毒癥參考《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》診斷標準[6]；②年齡18周歲以上。排除標準：①創傷、肺部手術、溺水、有毒氣體吸入等導致的ALI；②經臨床確診的肺癌、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、肺纖維化等肺部疾病；③自身免疫疾病，血液系統疾病。其中51例合并ALI(ALI組)，82例未合并ALI(NALI組)，ALI參考2012年柏林急性呼吸窘迫綜合征診斷標準[7]。根據氧合指數(氧分壓/吸入氣氧濃度]將ALI組分為輕度組(201～300mmHg)16例、中度組(101～200mmHg)20例和重度組(≤100mmHg)15例[8]。追蹤膿毒癥所致ALI患者28d生存狀況并將ALI組分為生存組(28例)、死亡組(23例)。另選擇同期于我院體檢中心體檢的43例志愿者為對照組，均排除急慢性感染、肺癌、肺炎、哮喘等呼吸系統疾病。

1.2實驗室檢測方法:ALI組患者入住急診重癥醫學科立即(基線)、住院3d、住院7d(對照組體檢當日檢測一次，NALI組入院當日檢測一次)采集靜脈血完善實驗室檢查，其中干燥試管(3mL)標本室溫下靜置30～60min后取上層血清離心(3000rpm，半徑10cm，時間10min)后-20℃保存備用。取復融血清標本20μL，加入TRIzol試劑(Invitrogen生命技術公司，美國)提取總RNA，全波長酶標儀(型號Multiskan SkyHigh，賽默飛公司，美國)選取OD260：OD2801.8～2.0樣本，miRNeasy試劑盒(Qiagen公司，德國)提取miRNA，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit試劑盒(北京天根生化科技有限公司)將miRNA逆轉錄為cDNA。取2μL cDNA樣品加入反應體系，RT-qPCR系統(型號CFX96，BIO-RAD公司，美國)進行基因表達分析，2-ΔΔCt法計算miR-483-5p、miR-487b相對表達水平，引物設計金斯瑞生物科技公司合成，引物序列，反應體系和條件見表1。取復融血清標本，采用Varioskan LUX多功能酶標儀(美國賽默飛公司)運用酶鏈免疫吸附試驗檢測血清白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-33水平，試劑盒購自美國賽默飛公司。

表1 引物序列反應體系和條件

2 結 果

2.1ALI組、NALI組、對照組基線資料和實驗室指標比較:ALI組、NALI組、對照組年齡和性別比較無統計學差異(P>0.05)，ALI組膿毒癥休克比例、機械通氣比例、APACHE Ⅱ評分、血清基線miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33水平高于NALI組(P<0.05)，氧合指數、血清基線miR-487b表達低于NALI組(P<0.05)，見表2。

表2 基線資料差異

2.2不同病情嚴重程度患者臨床資料血清miR-483-5p、miR-487b表達和炎性因子水平比較:三組住院后miR-483-5p、miR-487b表達，IL-6、TNF-α、IL-33水平差異顯著(F組間=56.127、69.353、42.807、39.424、50.247，P<0.05)。輕度組血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33于住院3d輕度升高后，于住院7d下降，miR-487b表達于住院3d輕度下降后，于住院7d增高，中度組和重度組住院后血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33逐漸增高，miR-487b表達逐漸降低(F時間=32.052、41.009、22.427、28.724、30.524，P<0.05)。三組間存在交互效應(F交互=29.352、35.642、15.667、20.598、25.609，P<0.05)。重度組基線、住院3d、住院7d血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33水平高于中度組和輕度組(P<0.05)，且中度組高于輕度組(P<0.05)，miR-487b表達低于中度組和輕度組(P<0.05)，且中度組低于輕度組(P<0.05)。重度組APACHE Ⅱ評分高于中度組和輕度組(P<0.05)，氧合指數低于中度組和輕度組(P<0.05)，中度組血清APACHE Ⅱ評分高于輕度組(P<0.05)，氧合指數低于輕度組(P<0.05)。重度組、中度組膿毒癥休克比例和死亡率高于輕度組(P<0.05)，重度組、中度組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同病情嚴重程度患者臨床資料和基線血清miR-483-5p miR-487b表達和炎性因子水平差異

2.3膿毒癥所致ALI患者不同預后患者血清miR-483-5p、miR-487b表達和炎性因子水平比較:兩組住院后miR-483-5p、miR-487b表達，IL-6、TNF-α、IL-33水平差異顯著(F組間=63.235、59.485、73.681、42.152、38.452，P<0.05)。生存組血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33于住院3d輕度升高后，于住院7d下降，miR-487b表達于住院3d輕度下降后，于住院7d增高，死亡組住院后血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33逐漸增高，miR-487b表達逐漸降低(F時間=62.351、69.358、43.285、38.152、29.657，P<0.05)。兩組間存在交互效應(F交互=26.351、35.652、28.462、30.265、29.449，P<0.05)。死亡組基線、住院3d、住院7d血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33水平高于生存組(P<0.05)，miR-487b表達低于生存組(P<0.05)。見表4。

表4 膿毒癥所致ALI患者不同預后患者血清miR-483-5p miR-487b表達和炎性因子水平差異

2.4血清miR-483-5p、miR-487b表達與炎性因子水平相關性:膿毒癥所致ALI患者基線、住院3d、住院7d血清miR-483-5p表達與IL-6、TNF-α、IL-33水平呈正相關(P<0.05)，miR-487b表達與IL-6、TNF-α、IL-33水平呈負相關(P<0.05)，見表5。

表5 血清miR-483-5p miR-487b表達與炎性因子相關系數(r，P)

2.5miR-483-5p、miR-487b預測膿毒癥所致ALI的價值分析:住院7dmiR-483-5p、miR-487b預測膿毒癥所致ALI的曲線下面積高于基線和住院3d miR-483-5p、miR-487b(z=2.156、2.337；2.059、2.097，P<0.05)，基于二元Logistic回歸分析聯合住院7dmiR-483-5p和miR-487b預測膿毒癥所致ALI的曲線下面積為0.964，經DeLong檢驗大于單獨檢測(z=2.612、3.141，P<0.05)，見表6和圖1。

表6 miR-483-5p miR-487b預測膿毒癥所致ALI的效能

圖1 miR-483-5p、miR-487b預測膿毒癥所致ALI的ROC圖

3 討 論

ALI是臨床常見的危及生命的重癥疾病，肺部中性粒細胞浸潤和介導不可控的炎癥反應是導致肺泡毛細血管膜屏障功能障礙、肺水腫、呼吸衰竭和死亡的主要原因[9]。miRNA作為轉錄后調節因子，參與人類幾乎所有的生理病理活動過程，其中不乏炎癥反應的調節，據報道miRNA可調節巨噬細胞極化及其誘導的炎癥反應[10]，還可直接調節炎癥因子參與炎癥反應過程[11]。

miR-483-5p與炎癥疾病存在密切關系，現有研究發現miR-483-5p可調節血紅素加氧酶-1促使氧化應激和肥大細胞成熟、T細胞趨化因子表達以及樹突狀細胞脫顆粒，導致過敏反應發生[12]，miR-483-5p在特應性皮炎患兒血清中表達上調，調節皮膚慢性炎癥反應過程[13]。miR-483-5p在膿毒癥中也表達上調，且與膿毒癥嚴重程度以及預后密切相關[14]。但是miR-483-5p是否與膿毒癥所致ALI有關尚不清楚。本研究發現ALI組患者血清基線miR-483-5p表達高于NALI組和對照組，說明miR-483-5p與膿毒癥介導的ALI也存在密切關系。進一步觀察發現ALI組患者中度和重度組基線至住院7d血清miR-483-5p表達逐漸增高，輕度組則在住院3d后表達下降，組間比較中度和重度組基線、住院3d、住院7d miR-483-5p表達均高于輕度組，表明miR-483-5p表達隨著ALI病情加重而增加，miR-483-5p表達與ALI病情嚴重程度有關。信號轉導蛋白抑制劑和轉錄激活因子 1(Protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription-1，PIAS1)是炎癥信號網絡的重要調節因子，可通過激活調節磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶通路抑制炎性細胞粘附，降低IL-6水平[15]，PIAS1是miR-483-5p的直接靶點，miR-483-5p通過負性調控PIAS1表達增加IL-6和白細胞介素-1β水平，本研究相關性分析結果顯示miR-483-5p表達與IL-6、TNF-α、IL-33呈正相關，推測miR-483-5p通過促使炎癥反應加劇膿毒癥肺損傷進展。本研究結果表明miR-483-5p高表達與膿毒癥所致ALI患者預后不良也有關，ROC分析結果也顯示住院7d miR-483-5p預測膿毒癥所致ALI患者預后具有較高的效能，提示住院7d的miR-483-5p可作為膿毒癥所致ALI預后的標志物。

在炎癥背景下，miR-487b通過抑制基因轉錄、阻止翻譯和破壞mRNA穩定性來抑制IL-6、TNF-α等細胞因子的產生[16]，miR-487b可直接靶向IL-33，抑制IL-33和生長刺激表達因子2蛋白表達，抑制促炎細胞因子白細胞介素-4、白細胞介素-5和白細胞介素-13水平。本研究發現miR-487b在膿毒癥所致ALI患者血清呈低度表達，且miR-487b表達與IL-6、TNF-α、IL-33呈負相關，說明miR-487b是炎癥反應的負向調控因子，miR-487b表達缺失可能促使炎癥反應，導致膿毒癥病情進展。通過追蹤臨床結局發現miR-487b與膿毒癥患者預后有關，死亡組基線至住院7d血清miR-487b表達逐漸降低，且基線、住院3d、住院7d血清miR-487b表達均低于存活組，說明miR-487b持續低表達可促使ALI病情進展和不良結局發生。分析原因為miR-487b表達缺失，其抗炎作用減弱，導致過度炎癥反應，加速肺損傷。ROC分析結果顯示住院7d的miR-487b預測膿毒癥所致ALI患者預后的曲線下面積為0.762，說明住院7d的miR-487b具有預測患者預后的效能，聯合住院7d的miR-487b和miR-483-5p后預測效能明顯提高，表明住院7d miR-483-5p表達上調，miR-487b表達下調可能預示更高的死亡風險。

綜上，膿毒癥所致ALI患者血清miR-483-5p表達上調，miR-487b表達下調，miR-483-5p過表達，miR-487b低表達與膿毒癥所致ALI患者病情加重和不良預后有關，住院7d的miR-483-5p、miR-487b可作為預后預測的生物學指標。miR-483-5p、miR-487b可能通過調節炎癥反應參與膿毒癥所致ALI的發病過程。