hsa_circ_0044556通過miR145/PD-L1介導NK細胞對肝癌細胞的殺傷作用

鄭 文， 李 萌， 張艷麗， 禚金花， 戴永剛， 程世亮

(山東省立第三醫院檢驗科， 山東 濟南 250031)

近年來，肝癌的發病率呈現出逐年遞增趨勢，成為一種高死亡率的惡性腫瘤疾病[1]。環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類新發現的內源性非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，在各類細胞中廣泛表達，并對細胞的信號傳導具有重要作用[2]。隨著RNA測序技術的發展，越來越多的circRNA在癌組織中被發現。研究表明，circRNA通過影響腫瘤生長、遷移、侵襲和分化在癌癥進展中發揮重要作用[3]。最近的研究發現hsa_circ_0044556還可以促進肝癌細胞增殖和惡化，可能成為肝癌治療的潛在靶點[4]。然而，hsa_circ_0044556促進肝癌發展的作用機制尚不清楚。程序性死亡因子1(programmed death ligand 1,PD-1)/程序性死亡因子配體(programmed death ligand 1，PD-L1)信號通路可抑制T細胞的增殖與活化，是目前腫瘤免疫治療的研究熱點。而一些circRNA和miRNA可以通過干擾免疫攻擊相關分子的表達影響癌癥免疫監視和免疫逃逸。circRNA在腫瘤免疫微環境中發揮著重要作用，并調節免疫檢查點基因從而影響免疫療法的治療效果[5]。本研究探究肝癌細胞表達的hsa_circ_0000190是否通過circRNA-miRNA-mRNA軸調節PD-L1表達參與免疫逃逸，為未來研究肝癌的免疫療法提供參考價值。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實驗細胞：留取2018年6月至2021年3月于我院行肝癌切除術患者40例癌組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5mm)標本100mg，液氮中保存備用。所有患者術前均未接受放化治療，且簽署知情同意書。

1.1.2實驗試劑：正常肝上皮HL-02細胞、肝癌細胞系SMMC-7721、HCCLM3購自中科院上海細胞庫；NK-92細胞購自上海澤葉生物科技有限公司；si-NC、si-miR-145、si-hsa_circ_0044556、LipofectamineTM 2000 購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司；NK細胞殺傷活性檢測試劑購于Promega公司；PD-L1抗體、GAPDH抗體購自英國abcam公司；PD-L1、hsa_circ_0044556、miR-145、GAPDH的qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方 法

1.2.1細胞培養：正常肝上皮HL-02細胞、SMMC-7721、HCCLM3肝癌細胞均使用含10%胎牛血清RPMI 1640培養基培養，NK-92細胞培養于NK-92細胞專用培養基中，均置于37℃、5%CO2恒溫的細胞培養箱中培養，根據細胞生長密度更換新鮮的培養基，待細胞生長到80%-90%時進行消化傳代，取對數生長期的細胞進行的實驗。

1.2.2hsa_circ_0044556、miR-145靶向性檢測：利用TargetScan數據庫和LncRNA2Target數據庫預測hsa_circ_0044556、miR-145的靶基因。收集對數生長期的HCCLM3細胞接種至96孔板，根據LipofectamineTM 2000說明書進行轉染，分別將hsa_circ_0044556 WT與hsa_circ_0044556 MUT及miR-145 mimic、miR-145-NC mimic轉染至HCCLM3細胞中(同時miR-145 mimic、miR-145-NC mimic及 PD-L1-WT或 PD-L1-MUT共轉染至HCCLM3細胞中)，48h后，應用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測HCCLM3細胞的熒光素酶活性。依據以下公式進行計算:相對luciferase活性=firefly luciferase活性/renilla luciferase活性×100%。

1.2.3NK細胞毒性試驗：以培養24h后的NK-92細胞為效應細胞，以不同方式處理的腫瘤細胞為靶細胞，600r/min離心PBS洗滌2次，分別按2∶1、5∶1、10∶1效靶比加入96孔板，每組設3個復孔。37℃、5%CO2培養箱培養3h。分別加10μL裂解液培養1h。加反應底物室溫避光放置30min，加反應終止液終止反應，酶標儀測OD450nm值。NK-92細胞殺傷率(%)=(實驗組OD平均值-靶細胞自然釋放組OD平均值-效應細胞自然釋放組OD平均值)/(靶細胞最大釋放組OD平均值-靶細胞自然釋放組OD平均值)×100%。

1.2.4細胞轉染：將以3.5×106個對數生長期的HCCLM3細胞接種于6孔板中，待細胞生長密度至65%～75%時，分別轉染si-NC、si-hsa_circ_0044556、si-miR-145、si-hsa_circ_0044556+si-miR-145。分別設置為si-NC組(轉染si-NC)、si-hsa_circ_0044556組(轉染si-hsa_circ_0044556)、si-miR-145組(轉染si-miR-145)和si-hsa_circ_0044556+si-miR-145(轉染si-hsa_circ_0044556+si-miR-145)

1.2.5CCK8細胞增殖實驗：取各組細胞，胰酶消化后離心，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基稀釋成單細胞懸液，以3×104個/mL密度接種到96孔板中，接種體積為200μL。在細胞培養箱中培養，在培養至24h、48h及72h時加入20μL CCK8檢測試劑，1h后通過酶標儀測定450nm吸光度值。

1.2.6RT-qPCR法檢測腫瘤組織或細胞中PD-L1、hsa_circ_0044556的表達：TRIzol試劑提取肝癌組織樣本、正常肝上皮HL-02細胞、肝癌細胞株SMMC-7721、HCCLM3中的總RNA。按照qRT-PCR試劑盒實驗說明，依次進行逆轉錄和qRT-PCR實驗。擴增結果根據2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。引物序列：GAPDH-F，5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3，GAPDH-R，5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3；PD-L1-F，5-TTGCTGAACGCCCCATACAA-3，PD-L1-R，5-TGTCCCGTTCCAACACTGAG-3；miR-145-F，5-GTCCAGTTTTCCCAGGA-3，miR-145-R，5-GAACATGTCTGCGTATCTC-3；hsa_circ_0044556-F，5-GAAGCTGGTCTGCCTGGTG-3,hsa_circ_0044556-R，5-GAGGAGCGAAAGGAAGGAGA-3。

1.2.7Western blot法檢測腫瘤組織或細胞中PD-L1的表達：收集各組細胞，使用RIPA裂解提取總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶4℃封閉1h，TBST洗膜5min，3次，加入GAPDH抗體(1∶4000)、PD-L1抗體(1∶2000)，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜5min，3次，加入HRP標記的羊抗兔的二抗(1∶1000)37℃孵育1h，TBST洗膜5min，5次。顯影曝光，利用Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶的灰度值進行分析。實驗重復3次，取平均值。

2 結 果

2.1肝癌患者中hsa_circ_0044556和PD-L1的表達水平比較：qRT-PCR結果顯示，與癌旁組織(1.00±0.42，1.00±0.54)相比，腫瘤組織中hsa_circ_0044556(7.03±3.26)和PD-L1(4.35±2.84)表達水平升高(P<0.05)，見圖1A。通過Spearman進行相關性分析，結果顯示，癌旁組織及腫瘤組織中hsa_circ_0044556和PD-L1的表達呈正相關(r=0.5481)，見圖1B。

圖1 肝癌中hsa_circ_0044556和PD-L1的表達水平呈正相關

2.2不同細胞系中hsa_circ_0044556和PD-L1的表達水平比較：qRT-PCR結果顯示，與正常肝上皮HL-02細胞(1.00±0.35，1.00±0.47)相比，肝癌SMMC-7721(4.74±1.64，2.25±0.85)、HCCLM3細胞(11.95±3.26，6.64±1.05)的hsa_circ_0044556和PD-L1表達水平升高(P<0.05)；與SMMC-7721細胞相比，HCCLM3細胞的hsa_circ_0044556和PD-L1表達水平升高(P<0.05)，見圖2。后續選擇肝癌HCCLM3細胞進行細胞實驗。

圖2 不同細胞系中hsa_circ_0044556和PD-L1的表達水平比較

2.3hsa_circ_0044556靶向抑制miR-145：預測結果顯示，hsa_circ_0044556與miR-145的5’端存在多個連續匹配堿基對，見圖3A。熒光素酶報告實驗結果顯示，轉染miR-145模擬物和野生型hsa_circ_0044556的熒光素酶強度比轉染miR-NC和野生型hsa_circ_0044556的降低(P<0.05)；這種現象在轉染突變型hsa_circ_0044556后消失，見圖3B。通過si-RNA沉默hsa_circ_0044556表達，與si-NC組(1.00±0.21)相比，si-hsa_circ_0044556組(2.13±0.68)miR-145表達水平升高(P<0.05)，見圖3C。結果提示hsa_circ_0044556負調控miR-145表達。

圖3 hsa_circ_0044556靶向抑制miR-145

2.4miR-145靶向抑制PD-L1：預測結果顯示，miR-145的5’端與PD-L1存在多個連續匹配堿基對，見圖4A。熒光素酶報告實驗結果顯示，轉染miR-145模擬物和野生型PD-L1的熒光素酶強度比轉染miR-NC和野生型PD-L1的降低(P<0.05)；這種現象在轉染突變型PD-L1后消失，見圖4B。通過si-RNA沉默miR-145表達，與si-NC組(1.00±0.26)相比，miR-145組(2.96±0.34)PD-L1表達水平升高(P<0.05)，見圖4C。結果提示miR-145負調控PD-L1表達。

圖4 miR-145靶向抑制PD-L1

2.5hsa_circ_0044556通過miR-145影響PD-L1表達：Western blot結果顯示，與si-NC組(0.82±0.13)相比，si-hsa_circ_0044556組(0.31±0.08)PD-L1表達降低，si-miR-145組(1.42±0.15)PD-L1表達升高(P<0.05)。與si-hsa_circ_0044556組相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145組(1.34±0.16)PD-L1表達升高(P<0.05)。與si-miR-145組相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145組PD-L1表達無顯著性差異，見圖5。結果提示，hsa_circ_0044556通過抑制miR-145的表達，間接調控PD-L1表達。

圖5 沉默hsa_circ_0044556和miR-145對PD-L1表達影響

2.6hsa_circ_0044556通過miR-145影響肝癌細胞增殖和對NK細胞敏感性：CCK8實驗和NK細胞毒性實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-hsa_circ_0044556組細胞增殖能力降低，對NK細胞敏感性增加(P<0.05)；si-miR-145組細胞增殖能力升高，對NK細胞敏感性降低(P<0.05)。與si-hsa_circ_0044556組相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145組細胞增殖能力升高，對NK細胞敏感性降低(P<0.05)。與si-miR-145組相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145組細胞增殖能力和對NK細胞敏感性無顯著性差異，見圖6和表1。

表1 沉默hsa_circ_0044556和miR-145對NK細胞敏感性的影響

圖6 沉默hsa_circ_0044556和miR-145對細胞增殖的影響

3 討 論

世界衛生組織的數據顯示，肝癌是全球第四大與癌癥相關的死亡原因[6]。早期診斷可以顯著改善肝癌患者的預后和生存率。然而，現臨床研究中缺乏可靠的肝癌預后和復發的監測生物標志物。深入研究肝癌發生發展的病理機制，將為肝癌的診治開辟新的思路和方法。

大多數circRNAs存在于細胞質中，在多種疾病中的發揮重要功能，包括腫瘤的發展、轉移或預后有關[7]。在哺乳動物細胞中，與其他ncRNA相比，circRNA具有高度保守的序列和高穩定性，這些特征可能讓circRNAs成為癌癥理想的生物標志物和診斷的潛在靶點。hsa_circ_0044556由COL1A1基因(膠原蛋白，I型，Alpha 1)產生，位于17號染色體上，長度為200 bp。研究表明，hsa_circ_0044556在多種乳腺癌細胞中高表達，敲低其表達水平可顯著抑制乳腺癌細胞的轉移。此外，hsa_circ_0044556表達水平升高與患者較低的生存率相關[8]。本研究在肝癌細胞系和肝癌組織中均發現hsa_circ_0044556的表達水平升高，提示hsa_circ_0044556可能促進了肝癌的發展。

PD-1/PD-L1是重要的免疫檢查點信號，受到人們越來越多的關注。近期研究表明，ncRNA參與了PD-1/PD-L1通路在癌變過程中的調控，其中circRNA介導的PD-1/PD-L1表達異常可能通過多種分子途徑介導癌細胞的遷移和耐藥性[9]。在本實驗中，PD-L1在肝癌組織和肝癌細胞中高表達，且與hsa_circ_0044556呈現顯著相關性，提示hsa_circ_0044556可能通過介導PD-L1的表達發揮作用。

miRNA是一組長短較短的非編碼調控RNA，主要通過與3'-非翻譯區(3'-UTR)互補結合在轉錄后調節基因表達。多種miRNA在人類惡性腫瘤中表達失調，其中miR-145被認為是致癌和治療耐藥性的關鍵抑制因子[10]。本研究發現hsa_circ_0044556負調控miR-145表達，miR-145負調控PD-L1表達，hsa_circ_0044556通過抑制miR-145的表達，間接調控PD-L1表達。NK細胞在對癌癥的免疫反應中起關鍵作用，腫瘤細胞則可以利用腫瘤微環境中多種因素逃逸NK細胞的免疫監視。在本實驗中，si-hsa_circ_0044556組肝癌細胞對NK細胞的殺傷敏感性明顯增加，而si-hsa_circ_0044556+si-miR-145組細胞增殖能力升高，對NK細胞敏感性降低，hsa_circ_0044556通過miR-145影響肝癌細胞增殖和對NK細胞敏感性。

綜上所述，hsa_circ_0044556和PD-L1在肝癌患者組織和肝癌細胞系中呈現高表達且具呈正相關，hsa_circ_0044556通過miR145/PD-L1信號軸促進肝癌細胞增殖的同時抑制對NK細胞殺傷的敏感性，從而介導腫瘤細胞的免疫逃逸。